溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19和CYP2C9基因多態(tài)性分析

周懷彬，王金丹，胡理懷，溫超瑋，呂建新

（溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院、生命科學學院，浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035）

溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19和CYP2C9基因多態(tài)性分析

周懷彬，王金丹，胡理懷，溫超瑋，呂建新

（溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院、生命科學學院，浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035）

目的：研究溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19、CYP2C9基因多態(tài)性分布。方法：采用聚合酶鏈式反應和測序方法，對287例健康人群CYP2C19、CYP2C9基因多態(tài)性進行分析。結(jié)果：溫州地區(qū)漢族人群的CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3三種等位基因的頻率分別為65.16%、29.27%和5.57%；CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*2和CYP2C19*3/*3基因型的頻率分別為44.95%、33.45%、6.97%、4.18%、10.45%和0.00%，弱代謝率為14.63%；CYP2C9*1和CYP2C9*3等位基因頻率分別為97.74%和2.26%，CYP2C9*1/*1和CYP2C9*1/*3的基因頻率為95.47%和4.53%，未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*3/*3。結(jié)論：溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19和CYP2C9弱代謝率與已報道的漢族人群基本一致，與日本人群相近，顯著高于歐美人群。

P450；CYP2C19；CYP2C9；多態(tài)性；溫州地區(qū)；漢族

細胞色素（cytochrome P450，CYP450）是一組參與生物轉(zhuǎn)化的超基因家族編碼的同工酶。其中CYP2C是細胞色素P450的主要成分，占其總量的20%。在CYP2C的亞家族中，CYP2C19和CYP2C9藥物反應起著關(guān)鍵的作用。CYP2C19主要參與代謝的藥物有：質(zhì)子泵抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、抗癲癇藥、抗精神病藥、降糖藥、抗凝藥、抗瘧疾藥以及一些抗癌藥物等。CYP2C9主要參與代謝的藥物有香豆素類抗凝血藥、血管緊張素II受體拮抗劑、口服降血糖藥、抗癲癇藥等。這兩個基因酶活性在人群中呈多態(tài)性分布，而基因的多態(tài)性是導致這些酶活性個體差異的分子基礎(chǔ)。我們利用測序方法對287例溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19和CYP2C9最主要的幾個多態(tài)位點進行分析，計算各等位基因和代謝型的頻率，為該地區(qū)的遺傳多態(tài)性研究和臨床合理用藥提供參考。

1 對象和方法

1.1 研究對象 隨機選取287例溫州地區(qū)漢族健康體檢人群，抽取2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-20 ℃保存待檢。所有血樣的采集均依據(jù)溫州醫(yī)科大學倫理委員會管理規(guī)定執(zhí)行。

1.2 DNA提取 用寶生物工程（大連）有限公司Universal Genomic DNA Extraction Kit，按使用說明書進行操作提取DNA。

1.3 引物設(shè)計與合成 查閱文獻，根據(jù)NCBI Gen-Bank數(shù)據(jù)庫的序列，用Primer3在線設(shè)計引物（序列見表1）。引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 CYP2C19和CYP2C9引物序列

1.4 PCR擴增 50μL PCR體系包含100 ng基因組DNA，3μL 25 mmol/L MgCl2，5μL 2.5 mmol/L dNTP，5μL 10×buffer，20μmol/L引物各0.2μL，1 U Taq，用ddH2O補足50μL。95 ℃預變性5 min；94 ℃變性35 s，53～55 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃后延伸5 min，4 ℃保溫。

1.5 DNA測序分型 對PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，送上海鼎安生物科技有限公司進行測序（測序引物序列見表1）。

1.6 統(tǒng)計學處理方法 用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理。根據(jù)基因型頻率計算等位基因頻率，采用x2檢驗分析基因型頻率與Hardy-Weinberg平衡的符合程度，比較本組結(jié)果與其他文獻公布的不同種族人群之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 基因型的判定 CYP2C19*2和CYP2C19*3分別是681位點和636位點發(fā)生G→A突變。根據(jù)這兩個位點的突變情況的不同組合呈現(xiàn)不同的基因型。兩個位點均未發(fā)生突變，基因型為CYP2C19*1/*1；636位點未突變，681位點雜合突變和純合突變，對應基因型分別為CYP2C19*1/*2和CYP2C19*2/*2；681位點未突變，636位點雜合和純合突變，對應基因型分別是CYP2C19*1/*3和CYP2C19*3/*3；兩個位點均發(fā)生突變對應基因型為CYP2C19*2/*3（見表2和圖1）。

表2 CYP2C19和CYP2C9突變位點和基因型

CYP2C9*3是1075位點發(fā)生A→C突變。根據(jù)這個位點的突變情況分三種基因型：未發(fā)生突變的基因型為CYP2C9*1/*1，發(fā)生雜合突變的為CYP2C9*1/*3，發(fā)生純合突變的為CYP2C9*3/*3（見表2和圖1）。

2.2 CYP2C19和CYP2C9等位基因頻率分布 在287例溫州地區(qū)漢族人群中，CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3等位基因頻率分別為65.16%、29.27%、5.57%；CYP2C9*1和CYP2C9*3等位基因頻率分別為97.74%和2.26%（見表3）。經(jīng)x2檢驗，P＞0.05，均符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究對象來自同一個群體，具有較好的代表性。

2.3 CYP2C19和CYP2C9基因型和表型頻率分布 結(jié)果（見表4）表明，在287例標本中，CYP2C19基因型以CYP2C19*1/*1居多，CYP2C19*1/*2次之，未發(fā)現(xiàn)CYP2C19*3/*3型；CYP2C9各基因型中，以野生型CYP2C9*1/*1為主，共274例（占95.47%），CYP2C9*1/ *3有13例，未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*3/*3型?；虮硇椭?，CYP2C19弱代謝型有三種基因型（CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3、CYP2C19*2/*3），本研究287例標本中CYP2C19弱代謝型的有42例，占14.63%；CYP2C9弱代謝型有兩種基因型（CYP2C9*3/*3和CYP2C9*1/ *3），287例標本中CYP2C9弱代謝型有13例，占4.53%。

圖1 CYP2C19和CYP2C9代表性測序峰圖

表3 CYP2C19和CYP2C9等位基因頻率分布

3 討論

在中國人群中CYP2C19基因突變的主要類型是CYP2C19*2和CYP2C19*3[1]。CYP2C19*2是在第5外顯子681堿基處發(fā)生單堿基突變（G→A），產(chǎn)生一個異常拼接位點，造成mRNA的閱讀框架改變；CYP2C19*3發(fā)生在第4外顯子的636堿基處（G→A），結(jié)果產(chǎn)生一個過早的終止子，導致編碼蛋白合成縮短。這兩個位點的突變都可引起代謝酶活性下降或缺失。野生純合子為強代謝型（CYP2C19*1/*1），只有其中一個位點突變的為中間代謝型（CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3），其中一個位點純合突變或兩個點雜合突變?yōu)槿醮x型（CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3、CYP2C19*2/*3）。CYP2C9在人類中存在多種突變體，其中在東亞人中最常見的突變是CYP2C9*3[2]。該位點突變會引起359位氨基酸變化（Ile359Leu，1075A＞C），破壞了蛋白底物識別位點區(qū)域內(nèi)一個β折疊，從而影響蛋白功能。攜帶突變型基因的個體代謝相應藥物能力較攜帶野生型基因個體為低，通常較易發(fā)生不良反應。比如CYP2C9參與代謝的抗凝血藥華法林在臨床中有廣泛的應用，能較好地預防血液透析長期深靜脈導管血栓形成，但出血風險相對較大[3]，所以國內(nèi)外專家[4-5]建議該類藥物根據(jù)基因型來確定藥物的劑量。

表4 CYP2C19和CYP2C9基因型和表型頻率分布

本研究發(fā)現(xiàn)，溫州地區(qū)漢族人群CYP2C19具有遺傳多態(tài)性，等位基因*1、*2、*3，分別為65.16%、29.27%和5.57%。其中CYP2C19*2遠大于CYP2C19*3，未檢測到CYP2C19*3/*3，說明CYP2C19*2是溫州地區(qū)漢族人群弱代謝的主要原因。CYP2C19各基因表型中，弱代謝型占14.63%，跟已報道[5-6]的國內(nèi)漢族人群基本相符，遠高于白種人的3%～5%，跟日本人群的18.86%[7]相近。本研究中CYP2C9*3等位基因頻率為2.26%，跟已報道的漢族人群（為2.94%）沒有顯著性差異，跟南方漢族人群基本一致（為2.44%）[8]，顯著低于羅馬尼亞人群的9.3%[9]和西班牙人群中的16.2%[10]，與日本的2.06%相近[11]。說明CYP2C19和CYP2C9具有種族差異。中國幅員遼闊，各地區(qū)既有相同的遺傳背景又有各自的特點，了解本地區(qū)的藥物代謝相關(guān)基因的多態(tài)性分布情況，對臨床用藥有重要的指導意義。本研究隨機抽取溫州地區(qū)287例漢族健康體檢人員進行CYP2C19和CYP2C9常見多態(tài)位點進行檢測，具有一定的代表性，希望能為本地區(qū)的遺傳多態(tài)性分析和個體化用藥提供參考。

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（本文編輯：吳健敏）

·論 著·

Objective:To investigate distribution status of CYP2C19 and CYP2C9 genotype in Wenzhou Han population.Methods:The CYP2C19 and CYP2C9 genotype of 287 Wenzhou Han Chinese were determined by sequencing.Results:In Wenzhou Han population, CYP2C19*1, CYP2C19*2 and CYP2C19*3 allele frequencies were 65.16%, 29.27% and 13.6%, respectively; CYP2C19*1/*1, CYP2C19*1/*2, CYP2C19*1/*3, CYP2C19*2/*3, CYP2C19*2/*2 and CYP2C19*3/*3 genotype frequencies were 44.95%, 33.45%, 6.97%, 4.18% and 0.00%, respectively. The frequency of CYP2C19 poor metabolisms was 14.63%; CYP2C9*1 and CYP2C9*3 allele frequencies were 97.74% and 2.26%, respectively; CYP2C9*1/*1 and CYP2C9*1/*3 genotype frequencies were 95.47% and 4.53%, respectively, CYP2C9*3/*3 homozygous genotype was not found in this study. Conclusion: The frequencie of CYP2C19 and CYP2C9 poor metabolisms are similar to those of Japanese population, whereas they are signifcantly different from America-European populations.

cytochrome P450; CPY2C19; CYP2C9; polymorphism; Wenzhou; Han population

Q39；R969.3

A

1000-2138（2014）12-0864-04

2014-05-05

國家青年科學基金資助項目（81200253）；浙江省重點科技創(chuàng)新團隊資助項目（2012R10048）。

周懷彬（1981-），男，浙江永嘉人，助理實驗師，遺傳學碩士。

呂建新，教授，博士生導師，Email：jxlu313@163. com。

Analysis of genetic polymorphism of CYP2C19 and CYP2C9 in Wenzhou Han population

ZHOU Huaibin, WANG Jindan, HU Lihuai, WEN Chaowei, LV Jianxin. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035