腫瘤相關長非編碼RNA的表達及調控機制的研究進展

陳 葳，薛 梅

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710061)

轉錄組學分析證實，哺乳動物基因組可轉錄出大量不編碼蛋白質的非編碼RNA(non-coding RNAs, ncRNAs)，這些ncRNAs可分為片段長度小于200 nts的短鏈非編碼RNA和片段長度大于200 nts的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNAs)[1]。起初，ncRNAs被認為是轉錄的“噪音”或者是RNA聚合酶Ⅱ的“副產物”，不具有生物學功能。但是，隨著對ncRNAs的深入研究，發(fā)現ncRNAs也是具有調控功能的生物學分子[2]。目前，絕大多數ncRNAs的研究集中在短鏈非編碼RNA，對其特性、分類、功能已闡明的較為清楚，其中microRNA可以調控mRNA表達；小核仁RNAs指導RNA分子的化學修飾；siRNAs參與RNA干涉通路；Piwi-RNAs與轉座子的轉錄基因沉默有關[3-4]。

近期研究發(fā)現，lncRNAs也是具有重要生物學功能的調控分子，在調控基因表達和表觀遺傳學修飾方面發(fā)揮著重要作用[5]。許多復雜的人類疾病中都伴隨著lncRNAs的表達失調，例如心血管疾病、阿爾茨海默病以及各種類型的腫瘤。然而，lncRNAs與腫瘤的關系是我們課題組一直關注并致力于研究的領域。有研究表明，一些lncRNAs與腫瘤類型相關，可作為腫瘤診斷的新分子標志物和治療的新靶點[6]。但是，lncRNAs在人類腫瘤中特異性表達及其表達異常的分子機制尚不清楚。因此，本文僅對腫瘤相關性長非編碼RNA的表達及調控機制進行了探討。

1lncRNAs在腫瘤組織細胞中的表達

lncRNAs的表達具有組織細胞及發(fā)育時期的特異性。研究顯示lncRNAs在組織中表達的特異性比蛋白編碼基因要高。H19是第1個被發(fā)現的印跡lncRNA，它在食道癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌和轉移性肝癌等組織中都異常表達[7]。肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT-1)是在多種腫瘤中高表達的lncRNA，其表達異常與多種腫瘤發(fā)病相關，包括乳腺癌、肺癌和肝癌[8]。HOX基因的反義基因間RNA HOTAIR是在原發(fā)性和轉移性乳腺癌中表達上調的lncRNA，而且HOTAIR在結腸癌組織中的表達也上調[9]。HULC(highly upregulated in liver cancer, HULC)是篩選肝細胞癌特異性cDNA文庫后得到的，在肝細胞癌中異常高表達的lncRNA[10]。UCA1(urothelial carcinoma associated 1, UCA1)是在膀胱癌中特異性高表達的lncRNA，UCA1基因外源性表達可以促進膀胱癌細胞的增殖與遷移能力，產生對順鉑和絲裂霉素的耐藥性[11-12]。PlncRNA-1是在前列腺癌中高表達的lncRNA，沉默PlncRNA-1可顯著降低前列腺癌細胞的增殖，誘導細胞的凋亡[13]。BRUNNER等人[14]利用3′末端測序的技術分析了17種腫瘤組織樣本和相對應的正常組織樣本，發(fā)現1 065個已知的lncRNAs和1 071個新的基因間lncRNAs在樣本中的表達具有差異性，并且發(fā)現了lncRNA Peak 13 741在雌激素受體陽性和陰性的乳腺癌中表達具有顯著的差異。以上這些研究數據表明lncRNAs的表達具有組織特異性，并且許多l(xiāng)ncRNAs是腫瘤特異性表達，提示這些lncRNAs可能會成為腫瘤診斷和預后監(jiān)測的分子標志物。

lncRNAs的表達除了具有組織特異性外，其在細胞中的定位也具有特異性。與mRNA和其他ncRNAs不同，lncRNAs在細胞中主要定位于細胞核，但也有部分lncRNAs分布于細胞質中。VIDISHA等人利用RNA原位雜交技術檢測發(fā)現MALAT-1主要定位于細胞核中speckles結構域。Speckles是高度動態(tài)的亞核結構域，是負責對mRNA前體進行剪切的剪切復合體駐留和發(fā)生修飾的地方。研究還發(fā)現MALAT-1可以與剪切因子家族SerArg剪接因子相互作用，調節(jié)這些因子分布至speckles。由此認為，MALAT-1通過控制SerArg剪接因子的磷酸化水平從而調控mRNA前體的選擇性剪接[15]。lncRNAs在細胞中的定位不同，賦予了lncRNAs的不同的生物學功能；定位于細胞核的lncRNAs可作為microRNA的前體，其調控相應的microRNA從而發(fā)揮重要的生物學功能。研究發(fā)現，H19是同時分布在細胞核和細胞質中的lncRNA，H19的1號外顯子是miR-675-5p和miR-675-3p的模板，這兩個microRNA賦予了H19相應的生物功能[16]。而對于定位在細胞質的lncRNAs，則是具有功能活性的成熟的lncRNAs。肝癌中高表達的lncRNA HULC的RNA主要定位在肝癌細胞胞質中，其可作為分子海綿或分子誘餌降低miR-372的表達與活性[17]。有關lncRNAs在細胞中特異性的分布與定位的研究，對于今后研究lncRNAs的功能具有重要的提示意義。

2lncRNAs表達與腫瘤侵襲轉移及預后的關系

lncRNAs表達不但具有組織細胞的特異性，而且lncRNAs的表達與腫瘤侵襲轉移及預后密切相關。HOTAIR在原發(fā)性乳腺癌和轉移性乳腺癌中的表達都會增加，并且原發(fā)腫瘤中HOTAIR的表達水平可以用來有效預測乳腺癌的轉移和預后[18]。MALAT-1在非小細胞肺癌高轉移腫瘤中的表達明顯高于非轉移腫瘤，沉默MALAT-1的表達將阻止肺腺癌細胞的遷移。MALAT-1除了在肺癌中高表達外在其他類型的腫瘤中該分子也高度過表達。MALAT-1高表達可增加肝癌的復發(fā)率，細胞學實驗發(fā)現MALAT-1表達抑制能有效降低細胞侵襲遷移能力，MALAT-1表達抑制還可以有效減少宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力。因此，MALAT-1可作為多種腫瘤侵襲遷移及預后診斷的一個重要分子生物學標志物[19]。HULC不僅在肝細胞癌中高表達，而且在結直腸癌肝轉移瘤中其表達也上調。但是，HULC在原發(fā)性結直腸癌和非肝轉移瘤中則不表達[20]。UCA1在膀胱癌中表達陽性率高達100%，其表達在膀胱癌不同病理分級、分期以及原發(fā)和復發(fā)膀胱癌組織中均具有統計學意義，細胞學實驗發(fā)現UCA1基因外源性表達可以促進膀胱癌細胞的侵襲與遷移能力。因此，UCA1有望成為膀胱癌侵襲轉移診斷的核酸分子標志物[21]。lncRNAs表達與腫瘤侵襲轉移及預后的研究，將為腫瘤臨床診斷與治療提供更多有效的核酸分子標志物及治療靶點。

3lncRNAs的表達調控

3.1轉錄調節(jié)蛋白對lncRNAs表達的調控lncRNAs的表達主要依賴于轉錄水平的調控。GUTTMAN等人研究發(fā)現，人類21和22號染色體上存在Sp1、c-Myc和p53的結合位點，這些結合位點約有22%分布在蛋白編碼基因的5′端，36%分布在蛋白編碼基因的中部或3′端，并且這36%的轉錄因子結合位點與基因組中非編碼RNA的分布一致。提示人類基因組中，非編碼基因與編碼基因的轉錄調控類似，都受到常見的轉錄因子所調控[22]。隨后GUTTMAN等人在研究胚胎干細胞中l(wèi)ncRNAs表達時，發(fā)現位于基因間的lncRNAs linc2048可以被胚胎干細胞相關轉錄因子所調控，并且根據實驗數據建立了一個lncRNAs功能研究的模型。在這一模型中，特定的轉錄因子可以調控lncRNAs的表達[23]。此外，YANG等人將6個物種不同組織細胞543個染色質免疫共沉淀-序列分析技術(chromatin immunoprecipitation-sequencing, ChIP-Seq)實驗的數據整合建立了一個ChIPBase的數據庫，該數據庫是目前第1個提供lncRNAs轉錄調控圖譜的數據庫，通過對數百萬個轉錄因子進行分析，最終確定約幾萬個轉錄因子與lncRNAs存在轉錄調控的關系[24]。

lncRNAs轉錄調控的研究發(fā)現，lncRNAs的啟動子可以和轉錄因子Oct3/4、Nanog、CREB、Sp1、 c-Myc、Sox2、NF-κB和p53等結合并且受這些轉錄因子所調控[25-26]。KOSHIMIZU等[27]采用染色質免疫共沉淀結合基因芯片技術發(fā)現，神經母細胞瘤細胞株中MALAT-1啟動子區(qū)有轉錄因子CREB的結合位點。WANG等[17]研究發(fā)現，肝細胞癌中HULC的核心啟動子區(qū)中存在CREB的結合位點，并且證實PKA通路可能參與HULC的上調，HULC作為分子海綿或分子誘餌與miR-372特異性結合，從而降低miR-372的表達與活性。抑癌基因p53可作為轉錄激活因子調節(jié)多種lncRNAs的表達，p53可以下調印跡lncRNA H19的表達。p53通過與多種lncRNAs啟動子的p53結合模體相互作用并以p53依賴的方式調節(jié)這些lncRNAs的轉錄，而且p53激活的lncRNA lincRNA-p21在p53通路中可作為轉錄抑制子調控細胞凋亡[28]。我們研究發(fā)現，UCA1的核心啟動子區(qū)有c-Ets-2和C-EBPα的結合位點，并且c-Ets-2和C-EBPα作為正向的轉錄調控因子參與調控UCA1基因的轉錄水平及啟動子活性(數據未發(fā)表)。有關轉錄調節(jié)蛋白對lncRNAs基因表達調控的研究，表明lncRNAs和蛋白編碼基因類似都受到常見的轉錄調節(jié)蛋白所調控。但是，lncRNAs轉錄調控機制的研究尚處于起步階段，研究者期望通過針對性的干預lncRNAs啟動子與轉錄因子的結合，逆轉lncRNAs在腫瘤中的異常表達，從而達到腫瘤靶向治療的目的。

3.2表觀遺傳學修飾對lncRNAs表達的調控SATISH等人[29]觀察了不同細胞組織中DNA甲基化與組蛋白修飾標志物(H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3和H3K36me3)和lncRNAs轉錄起始位點(transcription start site, TSS)的相關性，研究發(fā)現無論lncRNAs基因的表達情況如何，其在TSS附近的甲基化密度都比蛋白編碼基因高。組蛋白修飾標志物H3K4me3、H3K36me3、H3K27me3與lncRNAs表達相關，其作用方式與mRNA的調控相類似。因此，lncRNAs表觀遺傳學調控與mRNA的表觀遺傳學調控具有相似的特性。

MEG3是第1個被發(fā)現具有腫瘤抑制功能的印跡lncRNA[30]。研究發(fā)現MEG3的表達受到表觀遺傳學的控制。在許多腫瘤中MEG3都存在表達缺失，導致MEG3在腫瘤中表達缺失的機制包括基因刪除、啟動子超甲基化和基因間差異性甲基化區(qū)域的超甲基化。MEG3上游有2個差異性甲基化區(qū)域(differentially methylated region, DMR)，其覆蓋了MEG3第1外顯子上游1.5 kb，并且延伸到第1個內含子，其中MEG3啟動子也是MEG3-DMR覆蓋的區(qū)域并且GC含量豐富。值得注意的是在MEG3啟動子存在cAMP反應元件(CRE)的結合位點，刪除這一結合位點能明顯降低啟動子轉錄活性。除此之外，CRE序列包含一個CpG島，表明這一CpG的甲基化可能阻止轉錄因子與此位點的結合，這可能在腫瘤中MEG3基因啟動子沉默中發(fā)揮作用[31]。MEG3啟動子的甲基化還可以受到microRNA的調控，miR-29可以通過調節(jié)甲基轉移酶(DNA methyltransferase, DNMT), 使MEG3啟動子甲基化，當過表達miR-29時可明顯增加MEG3的表達，因此miR-29以甲基化依賴的方式調節(jié)MEG3的表達[32]。由此我們認為，lncRNAs表觀遺傳學的調控可能也是導致lncRNAs在腫瘤組織中表達異常的機制之一，而且這種調控作用與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

4展望

隨著人們對腫瘤特異性表達lncRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的認識，研究者已經著手研發(fā)以lncRNAs為靶點的新藥。針對性的干預lncRNAs的轉錄，逆轉lncRNAs在腫瘤中的異常表達，以此達到腫瘤靶向治療的目的。目前，對lncRNAs表達分子機制的研究還相當有限。因此，今后lncRNAs研究將可能集中于研究其表達調控，從而促使lncRNAs盡快成為臨床腫瘤治療的理想靶點。

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