應(yīng)用微電極芯片技術(shù)評(píng)價(jià)抗心房顫動(dòng)藥物對(duì)兔右心房快速起搏模型的影響*

孫娟 ，黃焰，張玲，馬嵋，郭新貴，焦昌安，郭玉君，劉海利，李天奇，徐文莉，馬依彤

應(yīng)用微電極芯片技術(shù)評(píng)價(jià)抗心房顫動(dòng)藥物對(duì)兔右心房快速起搏模型的影響*

孫娟 ，黃焰，張玲，馬嵋，郭新貴，焦昌安，郭玉君，劉海利，李天奇，徐文莉，馬依彤

目的：應(yīng)用微電極芯片技術(shù)篩選和評(píng)價(jià)抗心房顫動(dòng)（房顫）藥物對(duì)兔右心房快速起搏模型的影響。

心房快速起搏；微電極芯片；場(chǎng)電位時(shí)程；胺碘酮

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:639.)

心房顫動(dòng)（房顫）是臨床上最常見的一種快速性心律失常[1]，其發(fā)病率隨人群年齡的增長(zhǎng)而增加。ATRIA研究報(bào)道房顫患病率為 0.4%～1%[2]。胡大一等[3，4]的流行病學(xué)研究結(jié)果顯示：中國(guó)房顫的患病率為0.77%。其發(fā)病率和病死率隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著增長(zhǎng)。由于房顫發(fā)生的確切分子基礎(chǔ)和電生理機(jī)制仍不清楚，建立與臨床具有相似病理生理特點(diǎn)的動(dòng)物模型，是認(rèn)識(shí)和治療房顫的有效措施。同時(shí)藥物篩選模型是發(fā)現(xiàn)新藥的重要條件，新模型的建立將會(huì)帶動(dòng)新型藥物的出現(xiàn)。盡管藥物篩選模型的研究主要集中在分子細(xì)胞水平和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型方面，組織水平的篩選模型可以反映生理?xiàng)l件下的抗房顫藥物作用，觀察藥物對(duì)病理?xiàng)l件下心臟組織的作用。本文應(yīng)用微創(chuàng)技術(shù)建立快速起搏兔右心房致房顫模型，結(jié)合微電極芯片技術(shù)，建立組織水平篩選和評(píng)價(jià)抗房顫藥物模型。

1 材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：2009-01至2009-06 選擇新西蘭大白兔32只，體重2.5～3 kg，雌雄不拘，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物質(zhì)量屬于一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[許可證號(hào)：SCXK（新）2003-01]。隨機(jī)分為4組， 鉀離子通道阻斷劑Tetraethylammonium組（TEA組，n=8）：取24小時(shí)快速心房起搏（RAP）后的右心耳切片組織，置入到微電極芯片記錄盤中，用改良臺(tái)式液恒速灌流心臟標(biāo)本，選擇刺激電極施加電壓2V，脈寬0.5 ms的脈沖連續(xù)刺激30 min。用含有20 mmol/L TEA的改良臺(tái)式液表面灌流以阻斷延遲整流型鉀通道（ IK ）。鉀離子通道阻斷劑氯化鋇組（BaCl2組，n=8）：用含有1×10-4mol/L BaCl2的改良臺(tái)式液灌流心臟標(biāo)本10 min以阻斷內(nèi)向整流鉀通道（Kir）。鉀離子通道阻斷劑氯化鎘組（CdCl2組，n=8）： 用含有1 mmol/L CdCl2的改良臺(tái)式液表面灌流標(biāo)本10 min后以阻斷L-型鈣電流（ICa，L ）。胺碘酮組（n=8）：用含有2×10-6mmol/L 胺碘酮的改良臺(tái)式液恒速灌流標(biāo)本10 min。

主要試劑、溶液成分和儀器：改良臺(tái)式液成分（mmol/L）: NaCl 144.0; KCl 5.0; CaCl21.8; MgCl21.0; NaH2PO40.33; Glucose 10.0; HEPES 5.0; pH 7.4。TEA（批號(hào)：045K0175）， 胺碘酮 （批號(hào)：126K1585）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。微電極芯片（德國(guó)），Stimulus Generator刺激儀（德國(guó)）。

快速心房起搏致房顫模型建立：用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉后，靜脈推注肝素1000 U抗凝。將兔仰位固定于兔臺(tái)上，頸部正中切口，分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈并切開，近頭端結(jié)扎，近心端置入一根6 F兩極電極（電極間距5 mm），在B超指引下定位，B超縱切引導(dǎo)，保持B超和電極平行，縱切觀察電極尖端位置是否正確；再以B超橫切引導(dǎo)，觀察到電極尖端在右心房?jī)?nèi)。應(yīng)用LEAD-2000電生理儀（四川錦江電子科技）記錄心內(nèi)電圖，以心內(nèi)電生理圖出現(xiàn)高大A波小V波為理想記錄圖，固定電極導(dǎo)管。以600 次/分的固定頻率進(jìn)行快速心房起搏24小時(shí)，脈寬 0.5 ms，強(qiáng)度 4V。起搏誘發(fā)房顫判斷標(biāo)準(zhǔn)：心臟電刺激時(shí)，記錄體表Ⅱ?qū)?lián)心電圖，誘發(fā)房顫后同步記錄左、右心房電圖。持續(xù)時(shí)間＞ 5min的房顫為持續(xù)性房顫。當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命體征不平穩(wěn)，如出現(xiàn)心率緩慢、呼吸頻率不穩(wěn)定時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。 快速起搏致房顫動(dòng)物模型制作過(guò)程中，3只新西蘭大白兔死于電極尖端穿透心房游離壁心臟破裂，2只因呼吸衰竭死亡，補(bǔ)充同體重量的5只大白兔。其余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)時(shí)間完成實(shí)驗(yàn)檢查。制作模型成功率75%，房顫持續(xù)時(shí)間5～10 s，給予冷鹽水敷于心臟可終止房顫的持續(xù)。

心房組織標(biāo)本制備：新西蘭大白兔快速心房起搏24小時(shí)后，迅速開胸取心臟剪下右心耳切片，組織厚度500 μm，用銀絲圈將標(biāo)本固定在微電極芯片記錄系統(tǒng)，改良臺(tái)式液恒速（3 ml/min）灌流心房組織30 min，溫度保持在37℃。Stimulus Generator刺激儀發(fā)出刺激強(qiáng)度在閾上二倍，波寬0.5 ms，頻率1 HZ的脈沖做驅(qū)動(dòng)刺激，設(shè)置27號(hào)和36號(hào)電極分別為刺激電極的正負(fù)極。標(biāo)本穩(wěn)定30 min后開始記錄鉀通道阻斷劑和抗心律失常藥物對(duì)心房場(chǎng)電位時(shí)程的影響。

微電極芯片記錄場(chǎng)電位時(shí)程：微電極芯片是以8×8陣列的形式鑲嵌入60個(gè)氮化鈦電極，電極尖端直徑10 μm，相鄰電極間隔100μm。植于芯片底部的微電極記錄心臟組織切片電活動(dòng)得到的原始信號(hào)，經(jīng)放大器MEA1060（增益1200倍）調(diào)制后，由模數(shù)轉(zhuǎn)換卡MC-card數(shù)字化，使用軟件MCRack處理心肌組織場(chǎng)電位各項(xiàng)參數(shù)：第一個(gè)正向峰值（ FPpre）、第一個(gè)最大負(fù)向峰值（ FPmin）、最后正向最大峰值（ FPmax）以及場(chǎng)電位時(shí)程（ FPdur，從FPmin到FPmax的時(shí)間）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用給藥前、后配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

TEA和BaCl2對(duì)快速心房起搏兔右心耳場(chǎng)電位時(shí)程的影響： TEA組用TEA改良臺(tái)式液灌流心房組織10 min后，右心耳場(chǎng)電位時(shí)程由（176.67±8.66）ms延長(zhǎng)到（196.11±10.76）ms，場(chǎng)電位時(shí)程延長(zhǎng)了10.55 ms，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）。BaCl2組用BaCl2改良臺(tái)式液灌流后兔右心耳場(chǎng)電位時(shí)程由（182.22±12.87）ms延長(zhǎng)到（191.11±13.09）ms，場(chǎng)電位時(shí)程延長(zhǎng)了8.89 ms，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.039）。圖1

圖1 給予TEA和BaCl2前后兔右心耳場(chǎng)電位時(shí)程變化

CdCl2對(duì)快速心房起搏兔右心耳場(chǎng)電位時(shí)程的影響：CdCl2組給與CdCl2改良臺(tái)式液灌流后兔右心耳場(chǎng)電位時(shí)程由（178.33±7.85）ms延長(zhǎng)到（206.67±9.70）ms，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0015）。圖2

圖2 給予CdCl2前后兔右心耳場(chǎng)電位時(shí)程變化

胺碘酮對(duì)快速心房起搏兔右心耳場(chǎng)電位時(shí)程的影響：胺碘酮組用胺碘酮改良臺(tái)式液灌流后兔右心耳場(chǎng)電位時(shí)程由（167.38±13.67）ms延長(zhǎng)到（185±15.14）ms，場(chǎng)電位時(shí)程延長(zhǎng)了17.62 ms，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。圖3

圖3 給予胺碘酮前后兔右心耳場(chǎng)電位時(shí)程變化

3 討論

心肌細(xì)胞在藥物作用下，可對(duì)心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上蛋白、受體、細(xì)胞內(nèi)的線粒體、微管等產(chǎn)生作用，這些變化可以綜合地體現(xiàn)在細(xì)胞的電生理功能的變化上。微電極陣列（MEA）能檢測(cè)各種離子通道在興奮水平時(shí)的離子運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞間的信號(hào)傳遞等。由于檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞和電極緊密藕合，微電極陣列能靈敏地檢測(cè)到藥物對(duì)細(xì)胞電生理信號(hào)的影響，并且傳感器具有穩(wěn)定性，因此可發(fā)展成一個(gè)基于生物電生理信號(hào)分析的可靠的藥物毒性評(píng)估平臺(tái)，根據(jù)心肌細(xì)胞的電生理功能變化來(lái)對(duì)分析藥物毒性等。目前國(guó)內(nèi)資料顯示人們已建立眾多房顫模型，如以犬等大型動(dòng)物為代表的房顫模型，包括藥物房顫模型和電刺激模型。以中型動(dòng)物兔為代表的房顫模型，如兔急性心房顫動(dòng)模型，兔慢性心房顫動(dòng)模型，離體兔心房顫動(dòng)模型。其缺點(diǎn)是兔心房過(guò)小難以容納多折返環(huán)，不易模擬房顫的發(fā)生和維持。本實(shí)驗(yàn)與之對(duì)應(yīng)的微電極芯片評(píng)價(jià)電生理指標(biāo)為場(chǎng)電位時(shí)程。實(shí)驗(yàn)建立快速起搏右心房致房顫模型與臨床觀測(cè)的房顫具有一定共性，包含結(jié)構(gòu)和功能兩方面的異常；模型能被誘導(dǎo)出房顫并能維持，房顫不會(huì)自行終止，而干預(yù)手段能有效終止。

理想的抗心律失常藥物應(yīng)對(duì)誘發(fā)心律失常的多個(gè)靶點(diǎn)有作用；應(yīng)對(duì)誘發(fā)心律失常的最佳靶點(diǎn)作用強(qiáng)調(diào)整動(dòng)作電位時(shí)程恢復(fù)正?；蚵匝娱L(zhǎng)。通道蛋白水平分子的重構(gòu)對(duì)房顫患者心房動(dòng)作電位和有效不應(yīng)期的縮短有重要意義，而多離子通道阻滯劑對(duì)心臟Na+、K+、Ca2+等多個(gè)離子通道有不同程度的調(diào)控作用，可使失調(diào)的離子通道功能恢復(fù)平衡，具有較低的致心律失常副作用[5,6]。有研究證實(shí)，房顫時(shí)心房有效不應(yīng)期縮短除了與ICa，L、Ito、INa等電流減弱有關(guān)外，還與鉀離子通道基因表達(dá)及活性改變有關(guān)[7,8]。IK有三種類型：快速延遲整流鉀電流（IKr）、緩慢延遲整流鉀電流（IKs）和超快延遲整流鉀電流（IKur）。本實(shí)驗(yàn)給予TEA作用右心耳組織致場(chǎng)電位時(shí)程延長(zhǎng)。依據(jù)結(jié)果推測(cè)，IK 參與了房顫電重構(gòu)中的鉀通道重構(gòu)。給予BaCl2阻斷Kir，右心耳場(chǎng)電位時(shí)程延長(zhǎng)。結(jié)果提示，快速起搏兔右心耳可能導(dǎo)致心房肌Kir減少，進(jìn)而參與心房有效不應(yīng)期（AERP）的縮短和房顫的維持，使用Kir特異性阻斷劑后，場(chǎng)電位時(shí)程延長(zhǎng)，相應(yīng)電重構(gòu)的電生理指標(biāo)心房有效不應(yīng)期延長(zhǎng)，阻止房顫的進(jìn)一步發(fā)生。實(shí)驗(yàn)給予CdCl2作用于心房組織，微電極芯片記錄中表現(xiàn)為場(chǎng)電位時(shí)程延長(zhǎng)。以具有多離子通道阻滯效果的胺碘酮為代表的復(fù)合型Ⅲ類藥物成為近年來(lái)抗心律失常藥物研究的熱點(diǎn)。胺碘酮為多通道阻滯劑，對(duì)于包括鈉通道、L 型鈣通道以及鉀通道 IKr、IKs在內(nèi)的多個(gè)心肌細(xì)胞膜離子通道均有阻滯作用[9]，可延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期，延長(zhǎng)心肌復(fù)極化時(shí)間。胺碘酮是目前唯一無(wú)逆頻率依賴性延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程、心房有效不應(yīng)期的藥物。在心肌細(xì)胞對(duì)開放和關(guān)閉狀態(tài)的IKs均有阻滯作用，但主要抑制開放狀態(tài)的IKs，這可能是其在快速心率時(shí)維持場(chǎng)電位時(shí)程延長(zhǎng)作用的重要原因。本實(shí)驗(yàn)給予胺碘酮顯示，右心耳場(chǎng)電位時(shí)程延長(zhǎng)。抗心律失常藥物篩選評(píng)價(jià)指標(biāo)包括動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，鉀、鈉、鈣電流的減少。本實(shí)驗(yàn)中微電極芯片記錄指標(biāo)場(chǎng)電位時(shí)程與動(dòng)作電位時(shí)程均可客觀評(píng)價(jià)生理、病理狀態(tài)下心臟組織電生理改變和反映離子電流的變化。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未報(bào)道有關(guān)應(yīng)用微電極芯片技術(shù)測(cè)量病理狀態(tài)下和病理模型后心房組織場(chǎng)電位時(shí)程的可靠、真實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用微電極芯片技術(shù)在接近房顫病理?xiàng)l件下，給予鈣和鉀通道阻斷劑記錄其對(duì)場(chǎng)電位時(shí)程變化的影響。通過(guò)區(qū)分藥物對(duì)不同觀測(cè)指標(biāo)的作用及影響程度可直接判斷在抗房顫藥物中的分類。根據(jù)藥物對(duì)場(chǎng)電位時(shí)程的作用，可初步預(yù)測(cè)到該藥抗房顫可能存在的不良反應(yīng)。由于各離子通道在不同病理進(jìn)程中的變化并不是同步的，故以怎樣的程度和比例阻斷不同的離子通道才能成為理想的抗心律失常藥。

多離子通道阻滯劑是人們研究Ⅲ類抗心律失常藥物時(shí)提出的。臨床上，Ⅲ類抗心律失常藥物的致心律失常作用具有明顯差異。隨著臨床研究復(fù)雜性的增加， 臨床信息和基礎(chǔ)藥物研究之間鴻溝也在不斷加深，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)作為致力于克服這種困難的新型研究模式，加快候選藥物從實(shí)驗(yàn)室走向臨床研究的步伐。隨著人們對(duì)抗心律失常藥物致心律失常機(jī)制的不斷深入認(rèn)識(shí)，新的抗心律失常藥物概念的提出，以及更加完善的藥物安全評(píng)價(jià)指標(biāo)的發(fā)現(xiàn)，人們會(huì)找到更加安全、有效的抗心律失常藥物。

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Evaluation of Anti-atrial Fibrillation Drug With Multi Ion Channel Targets by Micro-electrode Chip Technology in Experimental Rabbit Model

SUN Juan, HUANG Yan, ZHANG Ling, MA Mei,GUO Xin-gui, JIAO Chang-an, GUO Yu-jun, LIU Hai-li, LI Tianduo, XU Wen-li, MA Yi-tong.
Department Cardiology, Xinjiang Medical University, Urumqi (830011), Xinjiang, China

MA Yi-tong, Email: myt-xj@163.com

Objective: To evaluate and screen the anti-atrial fi brillation drug with multiion channel targets by micro-electrode chip technology in a rapid atrial pacing (RAP) rabbit model.Methods: A total of 32 rabbits were randomly divided into 4 groups, n=8 in each group. Potassium channel blocker (TEA) group, Potassium channel blocker (BaCl2) group, Potassium channel blocker (CdCl2) group and Amiodarone group.The electrode was inserted into right atrium via internal jugular vein with rapid right atrial pacing (600 beat/min) and the effect of each anti-atrial fi brillation drug on fi eld action potential (fAPD) were measured in different groups.Results: With 24 hour RAP, the fAPD was prolonged from (176.67 ± 8.66) ms to (196.11 ± 10.76) ms, P=0.012 in TEA group; from (182.22 ± 12.87) ms to (191.11 ± 13.09) ms, P=0.039 in BaCl2group; from (178.33±7.85) ms to (206.67 ± 9.70) ms, P=0.0015 in CdCl2group; from (167.38 ± 13.67) ms to (185 ± 15.14) ms, P=0.002 in Amiodarone group.Conclusion: RAP induced atrial fibrillation in experimental rabbit model is a simple and feasible method for screening the anti-atrial fibrillation drugs, combining with micro-electrode chip technology, it might be used for developing the new product.

Atrial rapid pacing; Micro-electrode chip; Field action potential duration; Amiodarone

2013-08-28）

（編輯：汪碧蓉）

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（2013911119）

830011 新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床博士后流動(dòng)站（孫娟），心臟中心（張玲、馬嵋、郭玉君、劉海利、馬依彤） ；復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院（黃焰、郭新貴、焦昌安、李天奇、徐文莉）

孫娟 主治醫(yī)師 博士 研究方向：心臟電生理 Email: sunjuandee@126.com 通訊作者：馬依彤 Email: myt-xj@163.com

R445.1

A

1000-3614（ 2014） 08-0639-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.08.020

方法：兔32只隨機(jī)分為4組：鉀離子通道阻斷劑 Tetraethylammonium組（TEA組，n=8），鉀離子通道阻斷劑氯化鋇組（BaCl2組，n=8），鉀離子通道阻斷劑氯化鎘組（CdCl2組，n =8），胺碘酮組（n=8）。經(jīng)頸內(nèi)靜脈將電極置入右心房，以600次/分行心房快速起搏（RAP），給予TEA、BaCl2、CdCl2和胺碘酮觀察抗房顫藥物作用的離子通道對(duì)電生理指標(biāo)場(chǎng)電位時(shí)程（fAPD）的影響。

結(jié)果： 24小時(shí)快速起搏后，20 mmol/L TEA 使場(chǎng)電位時(shí)程由（176.67±8.66）ms延長(zhǎng)到（196.11±10.76） ms（P=0.012）。1×10-4mol/L BaCl2使 場(chǎng)電位時(shí)程由（182.22±12.87）ms延長(zhǎng)到（191.11±13.09）ms（P=0.039）。CdCl2使場(chǎng)電位時(shí)程由（178.33±7.85）ms延長(zhǎng)到（206.67±9.70）ms（P=0.0015）。2×10-6mmol/L 胺碘酮灌流心臟組織， 場(chǎng)電位時(shí)程由（167.38±13.67）ms延長(zhǎng)到（185±15.14）ms（P=0.002），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論：快速起搏兔右心房致房顫模型是一種簡(jiǎn)單可行的抗房顫藥物篩選模型，結(jié)合微電極芯片技術(shù)有可能用于抗房顫藥物開發(fā)的早期快速篩選。