血管內(nèi)皮生長因子165和肝細(xì)胞生長因子促心肌梗死后心肌細(xì)胞增生機(jī)制的研究*

錢雪松，安豐慧，劉普，陳波，李春堅(jiān)，王連生，楊志健，陶正賢

血管內(nèi)皮生長因子165和肝細(xì)胞生長因子促心肌梗死后心肌細(xì)胞增生機(jī)制的研究*

錢雪松**，安豐慧，劉普，陳波，李春堅(jiān)，王連生，楊志健，陶正賢

目的: 探討血管內(nèi)皮生長因子165（VEGF165） 和肝細(xì)胞生長因子（HGF）促進(jìn)心肌梗死后心肌細(xì)胞增生機(jī)制的異同。

心肌梗死；血管內(nèi)皮生長因子；肝細(xì)胞生長因子；增生

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:634.)

心肌梗死是一類嚴(yán)重威脅人類健康的急重癥。現(xiàn)有的治療手段，包括藥物治療、血管介入成形術(shù)和外科血管搭橋術(shù)，主要強(qiáng)調(diào)血運(yùn)重建，而對心肌梗死后心肌細(xì)胞丟失和梗死后的心肌細(xì)胞丟失的補(bǔ)充并無“良方”。多種生長因子與心絞痛嚴(yán)重程度相關(guān)[1]，而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[2]、成纖維細(xì)胞生長因子[3]和肝細(xì)胞生長因子（HGF）[4]等能誘導(dǎo)梗死后心肌血管新生、抗心肌細(xì)胞凋亡而改善心臟功能，為心肌梗死提供了新的治療策略。

1 材料與方法

材料：心電監(jiān)護(hù)儀：V24E，飛利浦；呼吸機(jī)：Newport E100m Ventilator， 美國紐邦醫(yī)療器械公司；氣管插管：塑料氣管插管（5.5，6.0，6.5，7.0，7.5），美國Sheridan公司；喉鏡：Kawe牌特制難度插管喉鏡，德國Kawe公司；無創(chuàng)傷縫針及無創(chuàng)傷滑線：帶雙頭針7-0聚丙烯（prolene）滑線；蛋白電泳儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽（Mini Trans-Blot Cell型）均為美國Bio-RAD公司產(chǎn)品；BIO-RAD680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國Bio-RAD公司；BX51型正置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；DP70型圖像采集系統(tǒng)，日本Olympus公司；門控單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)成像儀（G-SPECT，ECAM+; Siemens， 德國）；99Tcm-甲氧基異丁基異腈（99Tcm-MIBI）：南京森科醫(yī)藥有限公司；EnSite NavX系統(tǒng)：St. Jude Medicine， Inc.，USA；注射導(dǎo)管：上海微創(chuàng)公司?？贵w：單克隆大鼠抗Akt抗體（美國Santa Cruz公司）；單克隆兔抗磷酸化Akt抗體（美國Santa Cruz公司）；單克隆大鼠抗p21抗體（美國Santa Cruz公司）；單克隆大鼠抗p27抗體（美國Santa Cruz公司）；單克隆小鼠細(xì)胞周期蛋白A（Cyclin A）、Cyclin D1、 Cyclin D2、 Cyclin E（美國Sigma公司）；單克隆周期蛋白依賴性激酶（cdk）2、cdk4（美國Cell Signaling Technology公司）；單克隆小鼠抗β-actin抗體（美國Santa Cruz公司）；Protease inhibitor cocktail tablets（瑞士Roche公司）；Chemiluminescent Substrate kit（美國Pierce公司）。

方法：①載體構(gòu)建：在本研究中，使用的 VEGF165、HGF均 為 人 VEGF165（human VEGF165， hVEGF）和HGF（human HGF， hHGF）。從人胎肝中抽提總RNA，并以該肝細(xì)胞總RNA為模版，利用合成的一對引物，采用RT-PCR技術(shù)獲得HGF基因的cDNA，并引入酶切位點(diǎn)。利用AD-EASYTM系統(tǒng)，構(gòu)建HGF基因重組腺病毒載體（Ad- HGF）系統(tǒng)。將已引入酶切位點(diǎn)的HGF基因的cDNA，先轉(zhuǎn)入感受態(tài)質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，篩選陽性菌落，經(jīng)酶切及測序，證實(shí)HGF基因已經(jīng)正確轉(zhuǎn)入，再將該基因轉(zhuǎn)入pUC18質(zhì)粒，pUC18質(zhì)粒與AD-EASY質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，用PacI酶切成線性化DNA，利用脂質(zhì)胺轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)三輪擴(kuò)增，制備高效表達(dá)Ad- HGF。同樣方法構(gòu)建VEGF基因重組腺病毒載體（Ad-VEGF）。具體構(gòu)建方法同前[5]。②動(dòng)物模型構(gòu)建和心肌注射：我們于2012-01至2013-01選擇雄性中華小型豬15頭，平均體重（36±2.6） kg，年齡3～4個(gè)月。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理均遵循中華人民共和國衛(wèi)生部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例和南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。術(shù)前禁食、禁水4小時(shí)。在誘導(dǎo)麻醉、氣管插管、開通靜脈通道和復(fù)合麻醉后，自下而上沿前正中線剪開胸骨，氬氣電刀電灼骨膜出血點(diǎn)，胸骨牽開器自正中撐開胸骨。暴露心包和肺臟?？v形切開心包，鈍性剝離心包，暴露心臟，并用7號手術(shù)線固定心包。顯露左前降支，于左前降支中遠(yuǎn)端第二對角支處用無創(chuàng)針線7.0 prolene預(yù)結(jié)扎（不全部阻斷血流）10 min，然后結(jié)扎，構(gòu)建心肌梗死模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成3組：對照組（n=5）、Ad-VEGF組（n=5）、Ad-HGF組（n=5）。將溶解在1ml HEPES（pH=7.4）總量1×1010pfu的Ad-VEGF和Ad-HGF分別心肌局部注射到心肌梗死周圍區(qū)，注射分5點(diǎn)，相同劑量的生理鹽水注射到對照組。具體構(gòu)建和心肌注射方法同前[5]。③心肌灌注和心臟功能檢測：治療前和治療后4周用G-SPECT檢測心肌灌注和心臟功能。靜注99Tcm-MIBI后60～90 min，行G-SPECT心肌灌注核素顯像。將左心室分為17個(gè)節(jié)段，左前降支分為7個(gè)節(jié)段[6]。采用5分評分法對各節(jié)段心肌的核素放射性分布進(jìn)行評分[7]：0分：無分布；1分：分布嚴(yán)重降低；2分：分布減低；3分：分布輕度減低；4分：分布正常。正常左前降支為28分。采用GS Quant自動(dòng)勾邊技術(shù)勾畫出垂直長軸和水平長軸的左心室舒張末期及收縮末期心腔輪廓，計(jì)算機(jī)三維擬合數(shù)學(xué)模型計(jì)算出左心室舒張末期容積（LVEDV）和左心室收縮末期容積（ LVESV），由公式算出左心室射血分?jǐn)?shù)（ LVEF），LVEF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%。④蛋白免疫印跡（Western blotting）和免疫共沉淀（ IP）：在治療后4周，心肌灌注和心臟功能檢測后，取三組動(dòng)物左心室正常心肌、梗死心肌、梗死移行區(qū)心肌，提取蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育等，進(jìn)行Western blotting和IP，具體檢測方法同前[5]。⑤免疫熒光檢測：在治療后4周，心肌灌注和心臟功能檢測后，取三組動(dòng)物左心室正常心肌、梗死心肌、梗死移行區(qū)心肌，進(jìn)行石蠟包埋、切片、抗體孵育等，進(jìn)行免疫熒光檢測，檢測方法同前[5]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：每組經(jīng)4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

VEGF165和HGF在缺血心肌的表達(dá)：心肌治療4周后，通過免疫印跡法檢測VEGF和HGF的表達(dá)。結(jié)果顯示：在Ad-VEGF組（圖1A），心肌梗死區(qū)（I）和梗死周圍區(qū)（P）的VEGF表達(dá)分別為正常心?。∟）的2.21倍和2.18倍（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而對照組心肌梗死區(qū)（I）和梗死周圍區(qū)（P）與正常心肌（N）VEGF表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在Ad-HGF組（圖1B），心肌梗死區(qū)（I）和梗死周圍區(qū)（P）的HGF表達(dá)分別為正常心?。∟）的1.73倍和1.69倍（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而對照組心肌梗死區(qū)（I）和梗死周圍區(qū)（P）與正常心?。∟）HGF表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

VEGF165和HGF改善梗死后心臟功能和心肌灌注：治療前和治療后4周用G-SPECT檢測心肌灌注和心臟功能，結(jié)果顯示：Ad-VEGF組和Ad-HGF組心肌灌注（圖2A、2B）和左心室射血分?jǐn)?shù)（圖2A、2C）治療后4周和治療前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

VEGF165和HGF促進(jìn)梗死后心肌細(xì)胞增生：通過增值細(xì)胞核抗原（Ki67）和肌鈣蛋白T（Troponin T）熒光共染檢測VEGF165和HGF促進(jìn)梗死后心肌細(xì)胞增生。如圖3所示，Ki67陽性細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)、陽性細(xì)胞百分比在Ad-VEGF組分別為9.80±2.31/mm2、45.85±5.72/mm2、（21.78±6.3）%，在Ad-HGF組分別為9.20±3.43/mm2、46.70±7.99/ mm2、（19.72±6.31）%，在對照組分別為1.90±0.97/ mm2、22.30±6.86/mm2、（8.82±5.59）%。Ad-VEGF和Ad-HGF組的Ki67陽性細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)、陽性細(xì)胞百分比分別與對照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

圖1 血管內(nèi)皮生長因子165和肝細(xì)胞生長因子表達(dá)

圖2 三組在治療前后的心肌灌注和左心室射血分?jǐn)?shù)比較

圖3 三組梗死后心肌細(xì)胞增生

VEGF165促進(jìn)梗死后心肌細(xì)胞增生機(jī)制：為闡明VEGF165促進(jìn)梗死后心肌細(xì)胞增生機(jī)制，通過免疫共沉淀分析梗死后心肌細(xì)胞增生途徑，如圖4所示，在Ad-VEGF組，細(xì)胞周期蛋白p21在梗死周圍區(qū)和梗死區(qū)表達(dá)分別與正常心肌比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；正常心肌細(xì)胞周期蛋白p27表達(dá)分別是梗死區(qū)和梗死周圍區(qū)2.23倍和2.90倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而梗死區(qū)心肌Cyclin D2、cdk4、Cyclin A、cdk2表達(dá)分別是正常心肌的1.61倍、3.02倍、3.06倍、2.16倍，梗死周圍區(qū)心肌Cyclin D2、cdk4、Cyclin A、cdk2表達(dá)分別是正常心肌的1.73倍、2.98倍、3.29倍和2.31倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

HGF促進(jìn)梗死后心肌細(xì)胞增生機(jī)制：為闡明HGF促進(jìn)梗死后心肌細(xì)胞增生機(jī)制，通過免疫共沉淀分析梗死后心肌細(xì)胞增生途徑，如圖5所示，在Ad-HGF組，正常心肌p21表達(dá)分別是梗死區(qū)和梗死周圍區(qū)1.93和2.05倍、p27表達(dá)分別是梗死區(qū)和梗死周圍區(qū)的2.23和2.90倍，而梗死區(qū)心肌Cyclin A 、Cyclin E、cdk2表達(dá)分別是正常心肌1.94倍、1.93倍和2.11倍，而梗死周圍區(qū)心肌Cyclin A、Cyclin E、cdk2表達(dá)分別是正常心肌的2.14倍、2.01倍和2.09倍；梗死區(qū)和梗死周圍區(qū)心肌Cyclin D1表達(dá)分別是正常心肌 1.94和2.06倍，cdk4表達(dá)分別是正常心肌的2.08和1.99倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

圖4 血管內(nèi)皮生長因子165促進(jìn)梗死后心肌細(xì)胞增生途徑情況

圖5 肝細(xì)胞生長因子促進(jìn)梗死后心肌細(xì)胞增生途徑 。

3 討論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為心肌細(xì)胞在出生后即向終末分化，不能夠復(fù)制，并且成年心肌組織中沒有儲存的心肌祖細(xì)胞，心肌損傷后心肌細(xì)胞不具有內(nèi)源性再生能力，因此心肌受損后心肌細(xì)胞不能再生，被疤痕組織代替，最終導(dǎo)致心臟的收縮功能受損[8]。隨著干細(xì)胞和再生生物學(xué)的發(fā)展，這一傳統(tǒng)觀念引起越來越多的爭論和質(zhì)疑。目前的研究表明，哺乳動(dòng)物出生后心臟具有增生能力[9，10]。隨著心肌損傷后心肌組織具有再生能力資料的積累，如何促進(jìn)心肌梗死后心肌細(xì)胞再生以補(bǔ)充丟失的心肌細(xì)胞，從而修復(fù)損傷心肌、恢復(fù)或改善心臟功能成為新的研究熱點(diǎn)。

目前，促心肌細(xì)胞新生研究主要集中在兩個(gè)方面：第一，通過干細(xì)胞定向分化修復(fù)心肌組織；第二，通過各種因子促進(jìn)血管新生和心肌細(xì)胞新生修復(fù)心肌組織。然而外源性細(xì)胞治療心肌梗死面臨著來源、擴(kuò)增、定向分化、移植后免疫反應(yīng)、倫理學(xué)等諸多問題，因此內(nèi)源性心肌細(xì)胞新生成為新的研究熱點(diǎn)。

多種因子促進(jìn)心肌細(xì)胞增生已有報(bào)道。Engel等[11]用bFGF和p38抑制劑治療梗死心肌時(shí)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用bFGF和p38可促進(jìn)心肌細(xì)胞增生。Nakajima 等[12]發(fā)現(xiàn)突變的p193和p53可使梗死后心肌重新進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。Smart等[13]證實(shí)，胸腺素β4可促進(jìn)血管新生和心肌細(xì)胞新生，并改善梗死后心臟功能。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，通過多種細(xì)胞因子可促進(jìn)心肌細(xì)胞增生。

本研究進(jìn)一步證實(shí)，VEGF165和HGF可改善心肌梗死后心肌灌注和心臟功能，比較兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可知，VEGF165和HGF可對心肌梗死后心肌灌注和心臟功能改善程度上并無差異。同時(shí)也證實(shí)VEGF165和HGF可促心肌梗死后心肌細(xì)胞增生，但無論是Ki67陽性細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)、Ki67陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞百分比兩組間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟功能改善無差異原因之一。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)VEGF165促心肌梗死后心肌細(xì)胞增生與Cyclin A和Cyclin D2/cdk4有關(guān)，而HGF促心肌梗死后心肌細(xì)胞增生與Cyclin A、Cyclin E和CyclinD1有關(guān)。Woo等[14]使用Cyclin A2處理缺血后心功能衰竭心臟，提示Cyclin A2促進(jìn)心肌細(xì)胞再生，并改善心臟功能。Tamamor等[15]也發(fā)現(xiàn)Cycling D1和Skp2泛素鏈激酶可促進(jìn)梗死后心功能衰竭心臟的心肌細(xì)胞增生。表明心肌細(xì)胞周期蛋白與心肌細(xì)胞增生有關(guān)。

為比較VEGF165和HGF可促心肌梗死后心肌細(xì)胞增生機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)VEGF165通過p27途徑，而HGF通過p21和p27兩條途徑。無論是p21還是p27只有與Cyclin/cdk結(jié)合，才能通過細(xì)胞核，引起心包有絲分裂，促進(jìn)心肌細(xì)胞增生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，雖然VEGF165和HGF促心肌梗死后心肌細(xì)胞增生都與p27有關(guān)，但其下游途徑并不相同，VEGF165與Cyclin A/cdk2和Cyclin D2/cdk4有關(guān)，而 HGF與 Cyclin A/cdk2、Cyclin E/cdk2和 Cyclin D1/cdk4有關(guān)。

總之，本研究證實(shí)VEGF165和HGF可改善心肌梗死后心肌灌注和心臟功能，促進(jìn)梗死心臟心肌細(xì)胞增生，但VEGF165和HGF促心肌細(xì)胞增生途徑不同。至于合用VEGF165和HGF是否可進(jìn)一步增加梗死后心臟心肌細(xì)胞數(shù)量，減少心肌梗死面積，提高梗死后心肌灌注和心臟功能，有待于以后的實(shí)驗(yàn)深入研究。

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VEGF 165 and HGF Improving Cardiomyocyte Proliferation in Experimental Porcine After Myocardial Infarction

QIAN Xue-song***, AN Feng-hui, LIU Pu, CHEN Bo, LI Chun-jian, WANG Lian-sheng, YANG Zhi-jian, TAO Zheng-xian.
Department of Cardiology, The People’s Hospital of Jiangsu Province, Nanjing (210029), Jiangsu, China

TAO Zheng-xian, Email: zxtao@njmu.edu.cn

Objective: To investigate the mechanism of vascular endothelial growth factor ( VEGF)165 and hepatocyte growth factor (HGF) improving cardiomyocyte proliferation in experimental porcine after myocardial infarction (MI).Methods: The MI model was established by left anterior descending artery ligation in 15 male pigs and the animals were divided into 3 groups, n=5 in each group. Control group, the pigs received normal saline injection at the infarct and peri-infarct zones. VEGF group, the pigs received (1×1010) pfu of viral titers of Ad-VEGF injection. HGF group, the pigs received (1×1010) pfu of viral titers of Ad-HGF injection. The myocardial perfusion and cardiac function were examined by SPECT, the protein expressions of VEGF165 and HGF were measured by Western blot analysis, cardiomyocyte proliferation was analyzed by immunof l uorescence and immunoprecipitation method.Results:① Compared with Control group, the expressions of VEGF165 and HGF were higher at the infarct and peri-infarct zones in both treatment groups;② Both treatment groups had better cardiac function and myocardial perfusion;③ Both treatment groups had improved cardiomyocyte proliferation at the infarct and peri-infarct zones.④VEGF165 promoted cardiomyocyte proliferation via p27 pathway; ⑤HGF promoted cardiomyocyte proliferation via p21 and p27 pathways.Conclusion: VEGF165 and HGF could improve myocardial perfusion and function in experimental porcine afterMI, VEGF165 and HGF promote cardiomyocyte proliferation via different pathways.

Myocardial infarction; Vascular endothelial growth factor; Hepatocyte growth factor; Proliferation

2013- 03-28）

（編輯: 汪碧蓉）

江蘇省自然科學(xué)基金（BK2010021）；國家自然科學(xué)基金（81170102）；江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)帶頭人科研項(xiàng)目（JX2161015030）

210029 江蘇省南京市，江蘇省人民醫(yī)院 心臟科（錢雪松、陳波、李春堅(jiān)、王連生、楊志健、陶 正賢）；伊犁州友誼醫(yī)院 心臟科（安豐慧、劉普）

錢雪松 副主任醫(yī)師 學(xué)士**現(xiàn)在張家港市第一人民醫(yī)院 心臟科***Now working in The First People's Hospital of Zhangjiagang

陶正賢 Email: zxtao@njmu.edu.cn

R445.1

A

1000-3614( 2014 ) 08-0634-05

10.3969/j. issn. 1000-3614. 2014.08.019

方法:將15頭雄性中華小型豬結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支構(gòu)建心肌梗死模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成三組：對照組、VEGF基因重組腺病毒載體組（Ad-VEGF組）、HGF基因重組腺病毒載體組（Ad- HGF組） ，每組5只。將1×1010pfu的Ad-VEGF和Ad-HGF分別局部注射到Ad-VEGF組和Ad- HGF組豬的心肌梗死周圍區(qū)，相同劑量的生理鹽水注射到對照組。通過門控單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)成像儀檢測心肌灌注和心臟功能，通過免疫印跡法檢測VEGF165和HGF在心肌的表達(dá)，采用免疫熒光雙染和免疫共沉淀分析心肌細(xì)胞增生。

結(jié)果: ①在Ad-VEGF組，心肌梗死區(qū)和梗死周圍區(qū)的VEGF165表達(dá)明顯高于正常心?。≒＜0.01）；在Ad-HGF組，心肌梗死區(qū)和梗死周圍區(qū)的HGF表達(dá)明顯高于正常心肌（P＜0.01）。②高表達(dá)的VEGF165和HGF改善梗死后心肌灌注和心臟功能。③VEGF165和HGF可促進(jìn)梗死區(qū)和梗死周圍區(qū)心肌細(xì)胞增生。④VEGF165通過 p27促心肌細(xì)胞增生。⑤HGF通過 p21和p27促心肌細(xì)胞增生。

結(jié)論: VEGF165和HGF改善梗死后心肌灌注和心臟功能，促心肌細(xì)胞增生，但VEGF165和HGF促心肌細(xì)胞增生途徑不同。