心肌缺血預適應作用對老年大鼠心肌的影響及其機制的研究

韓勁松，王輝山，韓宏光，尹宗濤，汪曾煒

基礎與實驗研究

心肌缺血預適應作用對老年大鼠心肌的影響及其機制的研究

韓勁松*，王輝山，韓宏光，尹宗濤，汪曾煒

目的: 本研究探索心肌缺血預適應 （IPC）對老年大鼠心肌缺血再灌注（I/R）后的影響及機制。

老年；缺血預適應；缺血再灌注；過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因子1α

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:624.)

心肌缺血預適應 （IPC） 是一種最為有效的內源性保護措施，IPC可以明顯改善心肌線粒體的超微結構，能有效地減輕心肌缺血再灌注損傷（I/R）[1]，但IPC對于老年大鼠心臟的作用如何觀點不一致[2]。目前較為公認的IPC機制是細胞內信號傳導途徑[3]，涉及轉錄基因的調控等復雜過程。對于大多數(shù)生物過程的轉錄調控仍集中在對轉錄因子數(shù)目和活性變化的研究上[4,5]，雖然這是轉錄調控的主要模式，但轉錄共同激活蛋白比轉錄因子本身有更高的被調控性，當轉錄因子以序列特異性的方式結合到DNA上時，由于缺乏染色體修飾、DNA解鏈和招募RNA聚合酶Ⅱ的酶促活性，它并不能單獨啟動基因表達的發(fā)生，而啟動這一生化反應的往往是一些共同調節(jié)因子，轉錄因子的轉錄調節(jié)功能是通過與特異性共同激活因子或共同抑制因子結合來實現(xiàn)的，轉錄共同激活蛋白才可能是激素調節(jié)和信號傳導途徑的主要調控對象[6]。

過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因子1α（PGC-1α）就是其中的一個典型代表，由染色體4p15.1區(qū)域基因編碼的一種核受體協(xié)同刺激因子。St-Pierre等[7]發(fā)現(xiàn)，在心肌細胞中PGC-1α強表達可激活線粒體生物合成、氧化磷酸化及呼吸作用。Leone等[8]證實，敲除PGC-1α的裸鼠，其體內組織中氧化代謝功能有明顯的缺陷，心肌收縮功能下降，心率異常及左心室功能受損。PGC-1α與心臟的能量代謝以及與心臟能量代謝紊亂所致病變的關聯(lián)研究開始引起人們的極大關注[9]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，IPC對心肌線粒體有保護作用，可能與PGC-1α激活及高表達有關[1]。但老年大鼠心肌經IPC后PGC-1α如何變化，鮮有文獻報道。本研究通過觀察IPC對老年大鼠心肌有無明顯的心肌保護作用，并觀察老年大鼠心肌PGC-1α表達的變化，以期探討IPC對老年大鼠心肌的影響及可能機制。

1 材料與方法

動物與材料：2013-05至2013-10期間進行實驗。21～23月齡老年Wistar大鼠32只（購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心）。肌酸激酶MB同工酶（CKMB）及乳酸脫氫酶試劑盒 （美國Beckman）。丙二醛和超氧化物歧化酶試劑盒 （南京建成生物工程研究所）。心功能檢測采用BIOPAC 16導生理記錄儀（CBI-8000，美國）。全自動生化分析儀 （美國Beckman）。Langendorff灌注裝置和恒溫冰凍切片機（英國Thermo Shandon），Olympus光學顯微鏡、-70℃冰箱（日本Siemenon），MetaMorph/DP10/ BX41顯微圖像分析系統(tǒng)（生產廠：UIC/OLYMPUS,US/ JP），JEM-1200EX透 射 電 鏡。95%O2-5%CO2混合氣體（大連大特氣體有限公司）。PGC-1α（sc-13067）購自美國Santa Cruz 公司，二抗（EnVisionTM）購自丹麥Dako公司，OCT液（Tissue-Tek 4583） 購自日本Sakura公司。

離體心臟Langendorff灌注模型建立：麻醉采用腹腔內注射戊巴比妥 （5 mg/kg）, 開胸前5 min腹腔注射肝素500 U/ kg ,開胸后迅速取出心臟, 置于4℃改良Krebs-Henseleit （K-H）液中洗凈血液, 迅速轉移、固定于Langendorff灌流裝置。結扎雙側肺靜脈，以改良K-H液行常規(guī)恒壓 （80 mmHg） 灌流。改良K-H 液成分 （mmol /L ）：NaCl 118.0、KCl 4.7、K2PO41.2、MgSO41.2、NaHCO325.0、CaCl21.25、葡萄糖10.0, pH 7.3～7.4, 以95% O2-5%CO2飽和, 維持灌流液溫度37℃。

動物分組：將32只大鼠分為4組（每組8只）：對照組、I/R組、IPC組、強化IPC組。對照組采用全心灌流180 min，不做任何處理。I/R組采用心臟平衡灌流30 min后，缺血30 min，再復灌120 min。IPC組采用心臟平衡灌流10 min，經兩次缺血5 min再灌注5 min后，缺血30 min，再復灌120 min。強化IPC組采用心臟平衡灌流10 min，經四次缺血5 min再灌注5 min后，缺血30 min，再復灌120 min。缺血期間關閉氣體。

左心功能恢復率：切開左心耳，將充水乳膠囊由左心耳插入至左心室，囊內壓力經特氟綸管傳遞至壓力傳感器，通過壓力換能器輸入BIOPAC16導生理記錄儀。記錄缺血前的左心室發(fā)展壓及左心室內壓最大上升速率 （＋dp/dtmax）和左心室內壓最大下降速率 （-dp/dtmax），主動脈流量和冠狀動脈（冠脈）流量分別通過收集主動脈和冠脈流出液來獲得，并計算心排血量 （主動脈流量+冠脈流量）作為正常對照，復灌30 min、60 min、90 min、120 min再次記錄以上指標，并與心臟缺血前數(shù)值進行比較。心功能恢復率（%） = 復灌后值/缺血前值×100%。

冠狀動脈流出液CK-MB、乳酸脫氫酶活性：取缺氧前和復灌30 min后的冠脈流出液,12 h內用全自動生化分析儀測定CK-MB、乳酸脫氫酶的活性,按使用說明書操作。

心肌丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性測定：實驗完畢取0.5 g心室肌制成10%組織勻漿，丙二醛采用硫代巴比妥酸比色法[10]，超氧化物歧化酶采用黃嘌呤氧化酶法[11]，具體操作步驟按丙二醛和超氧化物歧化酶測試盒說明書進行。

心肌PGC-1α的免疫組織化學染色：各組均取心尖部約5 mm×5 mm×5 mm 組織, 用錫箔紙包裹，放入-70℃冰箱保存，標本取齊后做冰凍切片：OCT液包埋→恒溫冰凍切片機（-20℃）切成6 μm薄的冰凍切片。采用鏈霉素抗生物素蛋白—過氧化物酶（SP法）進行。以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）替代一抗作為每次染色的陰性對照。Olympus光學顯微鏡400倍條件下觀察：隨機選取6個高倍視野，將圖像輸入MetaMorph/DP10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)，計算出平均積分吸光度。

統(tǒng)計學分析：采用SPSS 17.0軟件分析。計數(shù)資料用率表示，計量資料數(shù)據(jù)以表示，使用方差結合post-Hoc檢驗，不同時間點應用重復方差檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

左心功能恢復率：各組缺血前基線值經方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。I/R組和IPC組各時間點與對照組比較，心排血量、左心室發(fā)展壓及+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯降低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。而強化IPC組與對照組比較，心排血量僅在復灌30 min和60 min明顯降低（P＜0.05）；左心室發(fā)展壓僅在復灌30 min、60 min和90 min明顯降低（P＜0.05）；+dp/dtmax和-dp/dtmax在復灌30 min明顯下降（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。強化IPC組與I/R組和IPC組各時間點比較，左心室發(fā)展壓及+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯升高（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義（表1）。通過公式計算，左心功能恢復率的比較：IPC組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,而強化IPC組與I/R組和IPC組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

冠狀動脈流出液CK-MB、乳酸脫氫酶活性：各組缺血前基線值經方差分析差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。復灌后IPC組和I/R組較對照組均明顯增高（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。但兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），對照組和強化IPC組較IPC組和I/R組明顯減少（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。圖 1

心肌組織中丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性的變化： I/R組和IPC組較對照組均明顯變化（丙二醛：P＜0.05，超氧化物歧化酶: P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。但兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而對照組和強化IPC組與IPC組和I/R組比較，丙二醛含量明顯降低（P＜0.05）、超氧化物歧化酶活性明顯增加（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。

PGC-1α的 表 達： PGC-1α在 強 化IPC組（11.89±5.21）明顯增高，與對照組（3.50±2.24）、I/R組（3.89±1.72）、IPC組（3.99±0.98）比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但IPC組及I/R組兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。圖2

表1 缺血預適應對老年大鼠左心功能的影響(n=8,

表1 缺血預適應對老年大鼠左心功能的影響(n=8,

注：與對照組比較*P＜0.05 **P＜0.01；與 I/R 組比較△P＜0.05 ；與IPC組比較▲P＜0.05。I/R：缺血再灌注 IPC：缺血預適應。1 mmHg= 0.133 kPa

復灌30 min 60 min 90 min 120 min心排血量(ml/min)對照組 28.0±3.8 28.1±4.4 27.9±4.0 28.1±4.2 28.0±3.5 I/R 組 29.9±2.1 6.4±3.0** 8.4±2.6** 12.4±3.0** 15.6±2.3**IPC 組 27.6±2.2 6.8±2.1** 8.8±3.5** 12.8±2.9** 16.0±3.2**強化IPC組 28.0±6.1 9.5±2.2*△▲ 14.5±3.0*△▲ 21.5±4.2△▲ 23.6±3.5△▲左心室發(fā)展壓(mmHg)對照組 81.5±9.7 81.4±8.8 81.4±6.7 81.5±7.5 81.4±6.5 I/R 組 84.1±5.7 28.4±2.1** 38.5±2.4** 49.2±2.0** 58.3±2.1**IPC 組 82.2±5.3 29.3±1.0** 39.2±1.5** 50.4±3.3** 59.2±1.2**強化IPC組 81.6±8.3 45.7±2.2*△▲ 55.6±3.1*△▲ 67.8±2.6*△▲ 70.8±3.8△▲左心室內壓最大上升速率(mmHg/s)對照組 2272.0±335.1 2272.3±334.9 2271.9±335.0 2271.6±320.7 2271.5±305.5 I/R 組 2205.9±204.3 1385.9±214.9** 1485.7±204.3** 1595.6±205.4** 1699.9±203.1**IPC 組 2199.3±202.2 1388.3±202.3** 1499.3±220.5** 1609.3±213.0** 1701.3±202.2**強化IPC組 2201.9±313.6 1602.8±283.2*△▲ 1805.9±299.6△▲ 1901.6±303.2△▲ 2009.9±310.1△▲左心室內壓最大下降速率(mmHg/s )對照組 1910.3±225.1 1910.6±226.2 1909.9±224.8 1911.3±237.5 1910.0±224.0 I/R 組 1918.0±324.3 1308.0±304.2** 1381.0±314.1** 1429.0±304.6** 1508.0±313.4**IPC 組 1898.7±350.4 1311.7±330.3** 1390.6±340.2** 1422.3±275.1** 1501.5±348.2**強化IPC組 1900.3±268.3 1600.3±254.2*△▲ 1696.7±268.3△▲ 1750.5±301.5△▲ 1798.3±246.1△▲缺血前

圖1 缺血預適應對離體老年大鼠心臟灌流液中肌酸激酶MB同工酶活性和乳酸脫氫酶活性的影響

圖2 缺血預適應對老年大鼠心肌過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因子1α的影響（SP，×400）

3 討論

正常情況下，體內氧自由基和脂質過氧化物的產生與清除保持動態(tài)平衡[12]。心肌I/R發(fā)生后，氧自由基通過攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而引發(fā)脂質過氧化作用，導致生物膜損傷而引發(fā)細胞組織的病理改變[13]，表現(xiàn)為氧自由基清除系統(tǒng)受損，超氧化物歧化酶等活性下降，細胞內鈣超負荷以致細胞膜受損，氧自由基生成增多，可使膜脂質過氧化產物丙二醛產生增加，加重細胞損傷、心肌細胞腫脹、線粒體產能障礙[14]。心肌中丙二醛含量升高、超氧化物歧化酶活性下降常用來衡量細胞損傷的程度。通過測定冠脈流出液CK-MB、乳酸脫氫酶活性可客觀地評價心肌梗死范圍,因為壞死的心肌將CK-MB、乳酸脫氫酶釋放, 其將隨灌流液而流失, 冠脈流出液CK-MB、乳酸脫氫酶活性可間接反映壞死心肌組織的多少，從而避免了染色法分離心肌梗死與非梗死部分的主觀性。

本研究結果顯示：在老年大鼠中，IPC未使I/R后的心肌損傷減輕，而強化IPC使I/R后的老年大鼠心肌損傷明顯減輕，表現(xiàn)為冠脈流出液CK-MB、磷酸脫氫酶生成明顯減少, 心肌丙二醛含量明顯降低, 超氧化物歧化酶活性明顯增加。左心功能恢復率也得出類似結果，即反映心臟收縮功能指標心排血量、+dp/dtmax，反映心臟舒張功能左心室發(fā)展壓、-dp/dtmax，在再灌注后各自的恢復率比較，IPC組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學意義，而強化IPC組與I/R組比較明顯增加。提示IPC對老年大鼠I/R心肌無明顯的保護作用，與Fenton等[15]和 Schulman等[16]的研究結論一致。本研究還提示強化IPC可恢復IPC對老年大鼠I/R心肌的保護作用，Lee等[17]的研究結果與本研究結果類似。本研究還觀察到：老年大鼠IPC組與I/R組比較，PGC-1α未見明顯增加，有趣的是，強化IPC組PGC-1α明顯增加。因此，老年大鼠心肌IPC作用不明顯，可能與老年心肌PGC-1α基因表達降低有關，而強化IPC可恢復老年大鼠IPC的心肌保護作用，其機制可能與強化IPC后激活PGC-1α基因的表達有關。

隨著年齡增加，線粒體生成氧自由基增加，已導致線粒體氧化損傷[18]。PGC-1α可保護心臟功能，在治療心力衰竭等心臟疾病中起重要作用[19]。PGC-1α促進線粒體氧化表達，提高線粒體的氧化功能[20]。PGC-1α可保護心臟免受氧化應激反應[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠心肌IPC后，PGC-1α表達未見明顯增加。因此，我們推測老年大鼠心肌PGC-1α表達降低可能使老年大鼠心肌調節(jié)超氧化物歧化酶的作用下降，進而影響心肌對應激反應的防護能力，使IPC對老年大鼠心肌不能發(fā)揮應有的保護作用。而強化IPC使老年大鼠心肌PGC-1α表達增加，恢復了老年大鼠心肌對超氧化物歧化酶活性的調節(jié)能力，進而恢復了IPC對老年大鼠心肌的保護作用。

當然，影響老年心肌IPC的機制很復雜，雖然本研究顯示強化IPC可激活老年心肌PGC-1α的表達，并推測PGC-1α降低與老年心肌IPC心肌保護作用減弱有關，而強化IPC由于PGC-1α被激活繼而使老年心肌IPC的心肌保護作用恢復，但尚不能確定PGC-1α的這些變化是老年心肌IPC心肌保護作用減弱的獨立因素，需進一步研究PGC-1α信號通路與其他信號通路的關系及相互影響。但是，PGC-1α畢竟在代謝調控中具有重要的地位和全能性，因為其處于許多代謝通路網絡調節(jié)的中上游，并且是以“結點”的方式將其“多功能”的轉錄增強作用發(fā)散至下游諸多能量相關的代謝線路中。對PGC-1α的信號途徑的研究可以為心肌保護的治療提供新的靶點。

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Effect of Cardiac Ischemic Preconditioning on Myocardium With its Mechanism in Aged Rats

HAN Jin-song, WANG Hui-shan, HAN Hong-guang, YIN Zong-tao, WANG Zeng-wei.
Department of Cardiovascular Surgery, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang (110016), Liaoning, China

WANG Hui-shan, E-mail: huishanwang@hotmail.com

Objective: To explore the impact of Ischemic preconditioning (IPC) in aged experimental rats after myocardial ischemia-reperfusion (I/R) with its mechanism.Methods: A total of 32 Wistar rats at the age of (21-23) months were divided into 4 groups, n=8 in each group.①Control group, the rats received cardiac perfusion for 180 min. ②I/R group, the rats received cardiac perfusion for 30 min, followed by ischemia for 30 min, then reperfusion for 120min. ③IPC group, the rats received cardiac perfusion for 10 min, followed by ischemia and reperfusion 2 times (5 min in each time), then ischemia 30 min and reperfusion 120 min. ④Enhanced IPC group, rats received cardiac perfusion for 10 min, followed by ischemia and reperfusion 4 times (5 min in each time), then ischemia 30 min and reperfusion 120 min. The recovery rate of cardiac output (CO), left ventricular developed pressure (LVDP) and the recovery rate of maximum rise and fall of left ventricular pressure (±dp/dtmax) at (30, 60, 90, 120) min after reperfusion were recorded respectively. The creatine kinase (CK-MB), superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content were examined before ischemia and 120 min after reperfusion. The apical peroxisome proliferator-activated receptor γ co-stimulatory factor 1α (PGC-1α) was examined by immuno-histochemistry.Results: The MDA content, CK-MB, SOD activities LVDP and (±dp/dtmax) recovery were similar between IPC group and I/R group, P＞0.05. While compared with I/R group, the Enhanced IPC group showed decreased CK-MB activity and MDA content, increased SOD activity and CO, LVDP and (±dp/dtmax) recovery rate, all P＜0.01. The PGC-1α expression was similar between IPC group and I/R group, P＞0.05. While compared with I/R group, the Enhanced IPC group had increased PGC-1α expression, P＜0.01.Conclusion: The cardiac IPC was weakened in aged rats which might be because of decreased PGC-1α expression, the enhanced IPC may up-regulate PGC-1α expression and therefore, protect the cardiac tissue in aged experimental rats.

Aging; Ischemic preconditioning; Ischemia-reperfusion; PGC-1α

2013-11-14）

（編輯：漆利萍）

110016 遼寧省沈陽市，中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 心血管外科

韓勁松 副主任醫(yī)師 博士研究生 主要從事心外科基礎和臨床研究 Email: hanjs0216@sina.com*沈陽軍區(qū)總醫(yī)院和第四軍醫(yī)大學聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生 通訊作者：王輝山 Email: huishanwang@hotmail.com

R544. 1

A

1000-3614（2014）08-0624-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.08.017

方法: 取21～23月齡老年Wistar大鼠32只，建立離體心臟Langendorff灌注模型， 分為4組（每組8只）：對照組、I/R組、IPC組、強化IPC組。對照組采用全心灌流180 min，不做任何處理。I/R組采用心臟平衡灌流30 min后，缺血30 min，再復灌120 min。IPC組采用心臟平衡灌流10 min，經兩次缺血5 min再灌注5 min后，缺血30 min，再復灌120 min。強化IPC組采用心臟平衡灌流10 min，經四次缺血5 min再灌注5 min后，缺血30 min ，再復灌120 min。比較各組復灌30 min、60 min、90 min、120 min后心排血量的恢復率以及左心室發(fā)展壓、左心室內壓最大上升和下降速率 （±dp/dtmax） 的恢復率；檢測缺血前及復灌120 min后冠狀動脈流出液中肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）和乳酸脫氫酶活性，心肌組織中丙二醛含量和超氧化物歧化酶的活性。各組取心尖肌做冰凍切片行過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因子1α（PGC-1α）免疫組織化學染色，計算出平均積分吸光度。

結果: IPC組與I/R組丙二醛含量、CK-MB及超氧化物歧化酶活性，左心室發(fā)展壓 、±dp/dtmax恢復率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而強化IPC組與I / R組比較， CK-MB和超氧化物歧化酶活性明顯減少（P＜0.01），丙二醛含量明顯降低（P＜0.05），超氧化物歧化酶活性明顯增加（P＜0.01），心排血量、左心室發(fā)展壓、±dp/dtmax恢復率明顯增加 （P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。PGC-1α的表達：IPC組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而強化IPC組表達明顯增加，與I/R組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

結論: 老年大鼠心肌IPC的保護作用減弱，可能機制是老年心肌PGC-1α蛋白表達降低，使老年心肌調節(jié)超氧化物歧化酶活性的作用下降，進而影響老年心肌對應激反應的防護能力，使IPC對老年心肌不能發(fā)揮保護作用。而強化IPC使PGC-1α表達增加，恢復了對超氧化物歧化酶活性的調節(jié)能力，進而恢復了IPC對老年心肌的保護作用。