浸漬式快速冷凍液的優(yōu)化及凍結(jié)技術(shù)對(duì)脆肉鯇品質(zhì)的影響

馬曉斌，林婉玲，楊賢慶，*，刁石強(qiáng)，郝淑賢，馬海霞

（1．廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088；2．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510300）

浸漬式快速冷凍液的優(yōu)化及凍結(jié)技術(shù)對(duì)脆肉鯇品質(zhì)的影響

馬曉斌1，2，林婉玲2，楊賢慶2，*，刁石強(qiáng)2，郝淑賢2，馬海霞2

（1．廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088；2．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510300）

為優(yōu)化浸漬快速凍結(jié)的冷凍液配方，以乙醇、丙二醇、甜菜堿和氯化鈉組成冷凍液，運(yùn)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討冷凍液的最佳配比。并用此最佳冷凍液（-35℃）對(duì)脆肉鯇進(jìn)行研究，比較-18℃凍結(jié)、直接浸漬凍結(jié)、間接浸漬凍結(jié)對(duì)脆肉鯇品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：以占冷凍液總質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，由20%乙醇、10%丙二醇、7%甜菜堿和10%氯化鈉和水組成的冷凍液，凍結(jié)點(diǎn)可達(dá)-66.10℃。采用-18℃凍結(jié)的樣品與兩種浸漬凍結(jié)的樣品相比較，前者肌原纖維蛋白含量和總巰基含量低于后者，并且Ca2+-ATPase活性的損失高于后者。綜合各項(xiàng)指標(biāo)說(shuō)明浸漬凍結(jié)利于減少蛋白的變性。

冷凍液，響應(yīng)面法，脆肉鯇，凍結(jié)特性

浸漬凍結(jié)技術(shù)是利用低溫的冷凍液與物品直接接觸，在物品浸入液體后瞬間表層凍結(jié)，從而實(shí)現(xiàn)快速冷凍，是一種凍結(jié)速率快、低能耗加工技術(shù)[1-4]。直接浸漬凍結(jié)中的冷凍液與物品接觸，對(duì)冷凍液的質(zhì)量要求相對(duì)較高。浸漬凍結(jié)中所用的載冷劑包括醇類、糖類和鹽類的水溶液等[2，5]。楊賢慶等[6]以甜菜堿、丙二醇、氯化鈉與水組成的冷凍液，其凍結(jié)點(diǎn)偏高和黏度偏大，為了得到凍結(jié)點(diǎn)更低和黏度更小的冷凍液，所以需要對(duì)冷凍液進(jìn)一步的優(yōu)化。

脆肉鯇（Ctenopharyngodon idellus）的蛋白質(zhì)含量比普通鯇魚(yú)（草魚(yú)）高，肉質(zhì)緊密，肉味鮮美和久煮不爛。目前脆肉鯇主要以鮮活的方式進(jìn)行運(yùn)輸和銷售，很少對(duì)脆肉鯇進(jìn)行加工，但隨著脆肉鯇的產(chǎn)量及市場(chǎng)需求的日益增加，急需進(jìn)行其他產(chǎn)品形式的深加工技術(shù)研究。冷凍魚(yú)片是魚(yú)類冷凍加工的主要產(chǎn)品形式之一，主要是采用空氣鼓風(fēng)凍結(jié)和間接凍結(jié)，阮征[7]和李汴生等[8]研究不同凍結(jié)速率和凍結(jié)溫度對(duì)脆肉鯇品質(zhì)的影響，指出提高凍結(jié)速率有利于保持脆肉鯇的品質(zhì)。因此，尋找一種適合脆肉鯇加工的快速凍結(jié)工藝是擴(kuò)大脆肉鯇加工的一種重要手段之一。鄧敏等[9-10]研究了不同凍結(jié)方式和不同浸漬凍結(jié)溫度對(duì)草魚(yú)品質(zhì)的影響，指出浸漬凍結(jié)優(yōu)于常規(guī)空氣鼓風(fēng)凍結(jié)。但是，浸漬凍結(jié)技術(shù)對(duì)脆肉鯇品質(zhì)研究鮮有報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)在前期配方的基礎(chǔ)上，通過(guò)采用響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)對(duì)浸漬凍結(jié)的冷凍液配方進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳配比，然后用最佳配方研究浸漬快速凍結(jié)技術(shù)對(duì)脆肉鯇品質(zhì)的影響，為脆肉鯇的保鮮加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脆肉鯇 廣東省中山市坦洲鎮(zhèn)某養(yǎng)殖場(chǎng)；蛋白定量（雙縮脲法）試劑盒、Ca2+-ATP酶測(cè)試盒 江蘇南京建成生物工程研究所；1-苯胺基-8-萘基磺酸（ANS）、DTNB 美國(guó)Sigma公司；其余試劑 均為分析純。

DW-86L386海爾超低溫冰箱 青島海爾股份有限公司；735-2溫度測(cè)量?jī)x 德國(guó)德圖儀器公司；TES 1310溫度計(jì)探頭 臺(tái)灣泰仕電子工業(yè)股份有限公司；NDJ-8s數(shù)字黏度計(jì) 上海方瑞儀器有限公司；MettlerGB204電子天平 梅托勒-托利多儀器公司；SP 2558熒光光度計(jì)；UV-3000（PC） 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Sigma-3K30高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 冷凍液凍結(jié)點(diǎn)的測(cè)定 參照楊賢慶等[6]方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 冷凍液黏度的測(cè)定 參照楊賢慶等[6]方法，并稍作修改。為了準(zhǔn)確的測(cè)定某一溫度下的黏度值，在待測(cè)冷凍液外加無(wú)水乙醇，即將盛有冷凍液的燒杯置于無(wú)水乙醇大燒杯中。

1.2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在楊賢慶等[6]研究的基礎(chǔ)上，主要研究乙醇（A）質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%～20%）、丙二醇（B）質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2%～10%）、甜菜堿（C）（5%～ 15%）、氯化鈉（D）質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2%～10%）對(duì)凍結(jié)點(diǎn)和黏度的影響。采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)，運(yùn)用Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以凍結(jié)點(diǎn)的絕對(duì)值與-20℃的黏度的比值為響應(yīng)值，比值越大，冷凍液質(zhì)量越好。設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分析水平見(jiàn)表1。

表1 浸漬速凍冷凍液響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.2.4 凍結(jié)和解凍 將脆肉鯇魚(yú)片（以背部肉為主）均分為三組，分別做如下處理：

a.第一組直接置于-18℃冰箱凍結(jié)，當(dāng)中心溫度至-18℃時(shí)，用濾紙吸干樣品表面殘留的液體，密封于聚乙烯塑料袋中，在4℃下解凍備用；

b.第二組直接浸漬在優(yōu)化后的冷凍液（-35℃）中凍結(jié)（直接浸漬凍結(jié)），凍結(jié)至中心溫度為-18℃，用濾紙吸干樣品表面殘留的液體，密封于聚乙烯塑料袋中，在4℃下解凍備用；

c.第三組采用聚乙烯塑料袋真空包裝后間接浸漬在優(yōu)化后的冷凍液（-35℃）中凍結(jié)（間接浸漬凍結(jié)），當(dāng)魚(yú)片中心溫度降至-18℃時(shí)，用濾紙吸干樣品表面殘留的液體，放置于4℃冰箱中解凍備用。

1.2.5 肌原纖維蛋白的提取 按照GB/T 18654.10-2002[11]進(jìn)行取樣，參照Hashimoto等[12]的方法進(jìn)行提取。

1.2.6 蛋白含量的測(cè)定 采用蛋白定量（雙縮脲法）試劑盒測(cè)定。

1.2.7 Ca2+-ATPase酶的活性測(cè)定 采用定磷法測(cè)定，使用Ca2+-ATP酶測(cè)試盒測(cè)定。

1.2.8 總巰基含量的測(cè)定 根據(jù)Ellman和Benjakul等方法，運(yùn)用DTNB法[13-14]測(cè)定。

1.2.9 表面疏水性的測(cè)定 在Benjakul等[14]方法上稍作修改，激發(fā)波長(zhǎng)366nm，發(fā)射波長(zhǎng)470nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

黏度值采用10次平行實(shí)驗(yàn)的均值，其余數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)的均值，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用JMP7.0（SAS公司）和Excel 2003（微軟公司）處理，蛋白質(zhì)冷凍變性的變化運(yùn)用ANOVA單因素方差分析及Tukey’s HSD法多重檢驗(yàn)（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面分析與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)[14-15]結(jié)果見(jiàn)表2，回歸方程方差分析見(jiàn)表3。

經(jīng)回歸擬合后，實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可以用回歸方程表示為：

從表3可得整體模型的顯著性水平p＜0.0001，說(shuō)明所選用的二次多項(xiàng)式模型具有顯著性，能夠很好的反應(yīng)各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可以運(yùn)用該回歸方程確定最佳冷凍液的配方。失擬性檢驗(yàn)p= 0.1851＞0.05，表明差異不顯著，說(shuō)明殘差有隨機(jī)誤差引起。R2=0.9374，表明曲線的擬合程度較高。由表3的方差分析可以看出，A、B、C、D、AC、A2為顯著性影響因素。影響因素的顯著性次序?yàn)楸迹疽掖迹韭然c＞甜菜堿。

2.2 配方的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

從表3可知，只有AC響應(yīng)值的變化具有顯著性的影響，于是列出了乙醇和甜菜堿對(duì)冷凍液質(zhì)量影響的響應(yīng)面圖，其余均未列出。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

圖1 乙醇和甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)冷凍液質(zhì)量的影響響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots showing the interactive effects of ethanol and betaine concentration on the freezing pointof immersion solution

由圖1可知，乙醇對(duì)響應(yīng)值的影響較甜菜堿顯著，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，隨甜菜堿的含量增加，響應(yīng)值變化較小，這可能與甜菜堿具有較大的黏度有關(guān)。

通過(guò)回歸方程求解得到最大值，得到冷凍液最佳配方是20.00%乙醇、10.00%丙二醇、7.00%甜菜堿和10.00%氯化鈉，由模型方程預(yù)測(cè)得到的響應(yīng)值是1.20。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regressionmodel

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果，以20%乙醇、10%丙二醇、7%甜菜堿和10%氯化鈉為配方，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)值為1.18±0.02，凍結(jié)點(diǎn)為（-66.11±0.056）℃，-20℃黏度為（55.73±1.18）mPa·s，且-35℃黏度為（154.26± 1.81）mPa·s，該配方比楊賢慶等[6]研究的凍結(jié)點(diǎn)低，黏度較小，質(zhì)量好?？赡苁怯捎谝掖嫉募尤耄c其他幾種物質(zhì)相互作用，有助于其凍結(jié)點(diǎn)和黏度的降低。根據(jù)單樣本t檢驗(yàn)，與模型方程預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異（p＞0.05），表明實(shí)際測(cè)的值與模型方程預(yù)測(cè)一致。

2.3 凍結(jié)曲線

圖2 不同凍結(jié)方式的凍結(jié)曲線Fig.2 Freezing curve under different freezing processing conditions

圖2為脆肉鯇塊分別在3種不同凍結(jié)方式下的凍結(jié)曲線。從圖2可知，浸漬凍結(jié)通過(guò)最大冰晶生成帶（凍結(jié)點(diǎn)）的時(shí)間少于-18℃凍結(jié)。-18℃、直接浸漬和間接浸漬凍結(jié)至魚(yú)塊中心溫度-18℃分別需要6.3、0.38、0.43h，可知直接浸漬和間接浸漬凍結(jié)的速率大于-18℃凍結(jié)，直截浸漬凍結(jié)的速率和間接浸漬凍結(jié)速率差不大。Jeremiah研究指出凍結(jié)速率快，形成的冰晶體積小，數(shù)量多，分布均勻，對(duì)組織細(xì)胞的破壞作用小，可以較好的保持食品的品質(zhì)[16]。

2.4 凍結(jié)前后蛋白質(zhì)冷凍變性的變化

2.4.1 肌原纖維蛋白含量的變化 魚(yú)肉在凍結(jié)過(guò)程中，肌原纖維蛋白發(fā)生變性導(dǎo)致其鹽溶性發(fā)生變化，鹽溶性蛋白的含量減少[18]。通常魚(yú)肉蛋白的冷凍變性越嚴(yán)重，其鹽溶性蛋白的含量越低。從表4可以看出，與新鮮魚(yú)塊相比，凍結(jié)后樣品的肌原纖維蛋白含量的溶出量有不同程度的降低，直接浸漬和間接浸漬凍結(jié)下降的程度比-18℃凍結(jié)的小。由圖2可知，直接浸漬和間接浸漬凍結(jié)速率快，快速的通過(guò)最大冰晶生長(zhǎng)帶，在凍結(jié)的魚(yú)肉形成的冰晶細(xì)小且均勻，對(duì)肌肉組織破壞較小，因此直接浸漬和間接浸漬凍結(jié)對(duì)蛋白質(zhì)變性程度較小，提取的肌原纖維含量相對(duì)-18℃凍結(jié)的高。

2.4.2 Ca2+-ATPase酶的活性的變化 Ca2+-ATP酶活性來(lái)源于肌球蛋白，表征其頭部S-1片段的性質(zhì)，是衡量蛋白質(zhì)冷凍變性的重要指標(biāo)[19]。凍結(jié)前后樣品的Ca2+-ATP酶活都有不同程度的降低，Ca2+-ATP酶活性降低程度分別經(jīng)直接浸漬和間接浸漬凍結(jié)的樣品其蛋白變性的程度比經(jīng)-18℃凍結(jié)小。經(jīng)-18℃凍結(jié)Ca2+-ATP酶活性下降程度最大，說(shuō)明凍結(jié)速率慢，通過(guò)最大冰晶生長(zhǎng)帶時(shí)間長(zhǎng)，肌球蛋白的完整性易破壞，蛋白容易發(fā)生變性。而經(jīng)直接浸漬和間接浸漬的樣品凍結(jié)速率快，有助于快速通過(guò)最大冰結(jié)晶生成區(qū)，從而可以減緩脆肉鯇蛋白的冷凍變性。

2.4.3 總巰基含量的變化 巰基是魚(yú)肉蛋白中最具有反應(yīng)活性基團(tuán)，巰基對(duì)于穩(wěn)定肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)具有主要的意義。巰基含量的變化反映蛋白的變性程度[20]。由表4可知，經(jīng)-18℃凍結(jié)處理后的總巰基含量顯著下降，而經(jīng)過(guò)直接浸漬和間接浸漬凍結(jié)處理后的幾乎沒(méi)有下降。因此可推測(cè)出，-18℃凍結(jié)速率慢，形成了較大和較多的冰晶，很大程度上破壞了蛋白的結(jié)構(gòu)，埋藏在其分子內(nèi)部的巰基更加容易暴露，易氧化而形成二硫鍵，從而總巰基含量下降。

2.4.4 表面疏水性的變化 蛋白質(zhì)的表面疏水性反映的是蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸的相對(duì)含量，也可以用它來(lái)衡量蛋白質(zhì)的變性程度[21]。表4可以看出經(jīng)過(guò)不同凍結(jié)方式的處理后，表面疏水性都顯著增加，直接浸漬和間接浸漬凍結(jié)的增加量比-18℃凍結(jié)的少。在凍結(jié)的過(guò)程中蛋白質(zhì)表面疏水性的增加是由于蛋白質(zhì)的伸展和疏水性脂肪族及芳香族氨基酸的暴露，破壞了蛋白質(zhì)原來(lái)的空間構(gòu)象，從而蛋白質(zhì)表面疏水性增加[22]。

3 結(jié)論

3.1 利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，探討浸漬快速凍結(jié)的凍結(jié)液配方的最佳配比為：以占冷凍液總質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，20%乙醇、10%丙二醇、7%甜菜堿和10%氯化鈉。此條件下的冷凍液的凍結(jié)點(diǎn)可達(dá)-66.10℃。

3.2 并運(yùn)用此最佳冷凍液（-35℃）進(jìn)行研究，采用-18℃凍結(jié)、直接浸漬凍結(jié)和間接浸漬凍結(jié)的樣品，凍結(jié)后肌原纖維蛋白含量、Ca2+-ATPase活性的損失和總巰基含量都有不同程度的降低，而直截浸漬凍結(jié)和間接浸漬凍結(jié)降低的幅度小。綜合各指標(biāo)，可以得出經(jīng)快速浸漬凍結(jié)對(duì)脆肉鯇的品質(zhì)優(yōu)于-18℃凍結(jié)。

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表4 凍結(jié)前后蛋白質(zhì)冷凍變性的變化Table 4 Change in protein frozen denaturation after freezing

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Optim ization of immersion solution for quick freezing and the effect of freezing technology on the quality characteristics of crisp grass carp

MA Xiao-bin1，2，LINW an-ling2，YANG Xian-qing2，*，DIAO Shi-qiang2，HAO Shu-xian2，MA Hai-xia2
（1.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，National Research and Development Center for Aquatic Product Processing，Key Laboratory of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China）

An immersion solution for quick freezing was using ethanol，p ropaned iol，betaine and sodium chloride. A Box-Behnken experimental design was used to exp lore op timal immersion solution formulation.The op timal immersion solution was used to study on crisp g rass carp，com pared the influence of immersion and chilling freezing and trad itional-18℃ on the quality changes of crisp g rass carp.A freezing point of-66.10℃ was observed for an aqueous immersion solution containing，on a total d ipp ing solution weight basis，20%ethanol，10%p ropaned iol，7%betaine and 10%sodium chloride，respectively.Com pared w ith the other two freezing p rocessing，crisp grass carp frozen in-18℃had lower contentofm yofibrillar p rotein and total-SH，more reduced Ca2+-ATPase activity.The results of physicochem ical and textural charac teristics ind icated that immersion and chilling freezing could assist to reduce the denaturation of fish p rotein.

immersion solution；response surfacemethodology；crisp g rass carp；freezing characteristics

TS254.4

A

1002-0306（2014）18-0338-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.067

2013－12－31 *通訊聯(lián)系人

馬曉斌（1988-），男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏方面的研究。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B00）；農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（nybjg201202）。