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    內(nèi)翻性乳頭狀瘤中角蛋白免疫組化方法研究

    2014-03-02 05:13:52輝,王春,葛瑩,李晨,孔慧,孔
    關(guān)鍵詞:檸檬酸鈉光密度角蛋白

    王 輝,王 春,葛 瑩,李 晨,孔 慧,孔 力

    (1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 耳鼻咽喉科,遼寧 大連116027;2.烏蘭察布市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉科,內(nèi)蒙古 集寧012000;3.大連醫(yī)科大學(xué) 組胚實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連116044)

    鼻腔、鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤(sinonasal inverted papilloma,SNIP)以單側(cè)發(fā)病為主,特征性地發(fā)生于鼻腔后壁中鼻甲區(qū)域和鼻隱窩,有學(xué)者認(rèn)為其可能與胚胎期Schneiderian 膜(外胚層呼吸上皮)不正常異位有關(guān)。SNIP 的組織學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為幾乎全部是由被覆基底膜完整且明顯增生的非角化鱗狀上皮構(gòu)成,向腫瘤基質(zhì)內(nèi)生長。

    廣譜細(xì)胞角蛋白CK,組成細(xì)胞骨架蛋白之一,廣泛存在于人體上皮組織,而不存在于間葉組織中,早在1990年Moll 等[1]的研究報(bào)道,角蛋白分有40種,分為:I 型具有酸性等電點(diǎn),相對(duì)分子量為40 ~56 kb,Ⅱ型具有中性或偏堿性,相對(duì)分子量為52 ~67 kb。CK 用于標(biāo)記上皮及上皮來源的腫瘤,亦有用于乳腺癌、結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢測(cè)的報(bào)告,特別是對(duì)鑒別和判斷轉(zhuǎn)移性腫瘤是否為上皮源性具有一定的意義。不同文獻(xiàn)報(bào)道SNIP 的復(fù)發(fā)率差別較大,從0% ~78%不等[2],多為術(shù)后2年,有學(xué)者認(rèn)為其與SNIP“多中心起源”相關(guān)[3],也有專家認(rèn)為SNIP 切除的徹底性是影響復(fù)發(fā)的主要因素[4-5]。因CK 在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中一般保持其亞微結(jié)構(gòu)及免疫學(xué)特征,角蛋白類型可判斷腫瘤組織學(xué)來源[6]。鼻腔黏膜及多數(shù)腫瘤,主要為鱗狀上皮所覆蓋,有研究指出SNIP 復(fù)發(fā)與瘤體部位和鱗狀上皮增生有關(guān)[7-8]。目前的研究多僅限于鏡下判斷是否陽性,其強(qiáng)度多根據(jù)其范圍、染色深淺用等級(jí)表示(如-,+,+ +,+ + +)。SNIP 尚未有利用圖像分析儀計(jì)算具體數(shù)值進(jìn)行陽性表達(dá)程度的比較方法。本研究利用Image-ProPlus 圖像分析儀,測(cè)定染色區(qū)陽性反應(yīng)的平均標(biāo)準(zhǔn)光密度值,探討不同抗原修復(fù)條件對(duì)廣譜細(xì)胞角蛋白(CK)陽性表達(dá)程度的影響,篩選優(yōu)勢(shì)抗原修復(fù)方法。

    1 材料和方法

    1.1 一般資料

    實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來自2012年9月—2013年5月在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受手術(shù)治療且經(jīng)病理證實(shí)的11 例鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤患者,均無其他合并癥。組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋后,連續(xù)切片,切片厚度為2. 5 μm。切片所用的載玻片為經(jīng)防脫處理的APES 玻片,60 h烤箱中烤1 ~1.5 h。每例患者的標(biāo)本取連續(xù)切片(4 片),分為4 組進(jìn)行不同修復(fù)方法,比較其陽性表達(dá)強(qiáng)度。

    1.2 免疫組織實(shí)驗(yàn)試劑

    細(xì)胞廣譜角蛋白CK 工作液ZM-0069(北京中杉金橋);EDTA 抗原修復(fù)液(稀釋50 倍,pH= 9.0)(北京中杉金橋);PBS 磷酸鹽緩沖液(0.01M pH =7.2 ~7.4)(北京中衫金橋:當(dāng)天配置);SP 試劑盒(北京中山生物);DAB 顯色工作液(北京中山生物)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    全部指標(biāo)均應(yīng)用免疫組織化學(xué)LSAB 法。陰性對(duì)照以PBS 代替一抗,皮膚組織切片作為CK 陽性對(duì)照。應(yīng)用日本尼康光學(xué)顯微鏡拍攝圖片,Image -Pro Plus 7.0 圖像分析儀。

    每張切片取5 個(gè)視野,平均計(jì)算200 個(gè)單位染色區(qū)域面積,測(cè)定染色區(qū)陽性反應(yīng)的平均標(biāo)準(zhǔn)光密度值。實(shí)驗(yàn)過程如下:按實(shí)驗(yàn)修復(fù)條件不同分為4組:(1)高溫高壓EDTA 修復(fù):切片置于高壓鍋中加入EDTA 加熱至121.5 ℃(2 min),冷卻至室溫;(2)高溫高壓檸檬酸鈉修復(fù):切片置于高壓鍋中加入檸檬酸鈉加熱至121.5 ℃(2 min),冷卻至室溫。(3)微波EDTA 抗原修復(fù)液,切片置于微波爐加入EDTA 高火3 min,解凍15 min,放置至室溫。(4)微波檸檬酸鈉修復(fù):標(biāo)本置于微波爐加入檸檬酸鈉高火3 min,解凍15 min,放置至室溫。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié) 果

    如表1所示,SNIP 組織高溫高壓EDTA 修復(fù)CK 陽性表達(dá)強(qiáng)度明顯優(yōu)于其他3 種修復(fù)方法。應(yīng)用相同的EDTA 修復(fù)液時(shí),高溫高壓條件陽性表達(dá)強(qiáng)度增高(P <0.05)。高溫高壓條件下,EDTA 修復(fù)液(0.01 mmol/L pH=9.0)修復(fù)效果優(yōu)于檸檬酸鈉修復(fù)液(0.01 mmol/L pH =6.0)(P <0.05)。免疫組化圖片見圖1~4。

    表1 陽性表達(dá)程度平均標(biāo)準(zhǔn)光密度值Tab 1 Positive expression of average level ( ± s)

    表1 陽性表達(dá)程度平均標(biāo)準(zhǔn)光密度值Tab 1 Positive expression of average level ( ± s)

    1)與其他3 種修復(fù)方法比較,P <0.05

    修復(fù)條件 修復(fù)液平均標(biāo)準(zhǔn)光密度值高溫高壓EDTA 修復(fù)液 0.365464 ±0.02329881)檸檬酸鈉修復(fù)液 0.323518 ±0.0511906微波EDTA 修復(fù)液 0.324955 ±0.0557229檸檬酸鈉修復(fù)液0.302555 ±0.0614531

    3 討 論

    免疫組化是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的病理輔助診斷之一,它應(yīng)用抗原抗體特異性結(jié)合原理,標(biāo)記的抗體與顯色劑結(jié)合、在組織切片上顯示原位組織細(xì)胞內(nèi)抗原以及抗原的含量與分布,對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。

    圖1 高溫高壓EDTA 修復(fù)表達(dá)Fig 1 Positive expression of high temperature and pressure EDTA retrieval

    圖2 微波EDTA 修復(fù)表達(dá)Fig 2 Positive expression of microwave EDTA retrieval

    圖3 高溫高壓檸檬酸鈉修復(fù)表達(dá)Fig 3 Positive expression of high temperature and pressure citrate retrieval

    圖4 微波檸檬酸鈉修復(fù)表達(dá)Fig 4 Positive expression of microwave citrate retrieval

    Image-Pro Plus 7.0 是由美國Media Cybernetics 生產(chǎn)的全球頂級(jí)32 位圖像處理與分析系統(tǒng)軟件,目前應(yīng)用于測(cè)量細(xì)胞的核漿比、免疫組織化學(xué)染色圖片分析、DNA 分析、蛋白顆粒分析、相同細(xì)胞不同亞群分析等。以往對(duì)免疫組化圖片的分析多采用陽性細(xì)胞百分比聯(lián)合陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分的方式,是半定量的分析方法,人為判定干擾因素較大且組內(nèi)缺乏一定的關(guān)聯(lián)性。后采用灰度值方式表達(dá),雖然其具有量的概念,但灰度值受染色時(shí)間、顯微鏡照明光源的亮度影響,且與陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。光密度與切片陽性表達(dá)強(qiáng)弱呈正相關(guān)是通過計(jì)算同一標(biāo)本最亮區(qū)域與待測(cè)目標(biāo)的平均灰度值的比值,再通過一系列的數(shù)學(xué)公式計(jì)算得來,其不僅具有量的概念,而且大大減小了由于直接測(cè)量目標(biāo)區(qū)域所產(chǎn)生的誤差[9]。有研究顯示,傳統(tǒng)半定量描述+、++之間定量數(shù)與灰度值和光密度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在這時(shí)陽性區(qū)域強(qiáng)弱定量分析更有意義[10]。

    本實(shí)驗(yàn)不僅采取最先進(jìn)的指標(biāo),在結(jié)果判定部分更加準(zhǔn)確,將隨機(jī)選擇的5 個(gè)視野,應(yīng)用日本尼康顯微鏡(放大400 倍)、CCD 圖像傳感器拍攝免疫組化圖片,調(diào)整為灰階8 位,避免背景著色的干擾,并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正,對(duì)各組免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)光密度(standard optical density,SOD)測(cè)定及分析,每張至少取200 個(gè)單位染色區(qū)域面積,取其均值作為SOD 參數(shù),計(jì)算5 個(gè)視野SOD 的平均值,平均標(biāo)準(zhǔn)光密度代表蛋白的顆粒密度,作為CK 染色區(qū)陽性反應(yīng)的平均SOD 值。

    不同的抗體在不同的修復(fù)條件下,表達(dá)強(qiáng)度不一。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞廣譜角蛋白CK 受抗原修復(fù)條件及修復(fù)液影響較大,根據(jù)患者入院時(shí)間進(jìn)行編序隨機(jī)盲法抽取11 例SNIP 患者病理切片,采用4種不同抗原修復(fù)方法及修復(fù)液。結(jié)果發(fā)現(xiàn):高溫高壓EDTA 修復(fù)液修復(fù)后的CK 陽性表達(dá)強(qiáng)度明顯優(yōu)于其他3 種修復(fù)方法。

    自1991年Shi SR 等[11]認(rèn)為:使用抗原修復(fù)的抗體陽性檢出率及陽性表達(dá)程度明顯高于未修復(fù)者。微波、水浴pH 9.0 T ris -EDTA 熱修復(fù)(水浴或微波)的切片,其表達(dá)效果優(yōu)于pH 6.0 的檸檬酸鹽緩沖液,陽性信號(hào)強(qiáng),定位準(zhǔn)確,背景清晰。修復(fù)液主要有:蒸餾水、檸檬酸鈉緩沖液、EDTA。目前抗原修復(fù)一般采用:電爐、微波爐加熱,高壓鍋加熱及微波爐加熱。不同的抗體,其最佳的抗原修復(fù)方法和抗原修復(fù)液不盡相同,可能與抗原暴露、修復(fù)的原理不同、各種抗體對(duì)各種修復(fù)液的敏感性不一致,并且與修復(fù)時(shí)間及溫度密切相關(guān)。微波熱修復(fù)是利用微波緩沖液的離子或極性分子高速運(yùn)動(dòng)的直接碰撞和高溫條件使醛-氨基、抗原與其他分子間的交聯(lián)或由蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)折疊成的三維結(jié)構(gòu)因水解而斷裂,暴露出被掩蓋的抗原決定簇[12-13]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討不同修復(fù)條件及修復(fù)液對(duì)廣譜細(xì)胞角蛋白CK 的陽性表達(dá)程度的影響,本實(shí)驗(yàn)通過利用先進(jìn)的圖像分析儀從數(shù)值上更加準(zhǔn)確地證明:應(yīng)用高溫高壓EDTA 修復(fù)液,可優(yōu)化CK 抗原修復(fù)效果。

    對(duì)于不同抗體,合理選擇抗原修復(fù)方法是一個(gè)需要在實(shí)際操作過程中反復(fù)摸索而不斷完善的過程,其主要目的是提高難以檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)的抗原檢測(cè)率和染色強(qiáng)度,為病理診斷提供準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的參考依據(jù),為臨床工作做出更好的指導(dǎo)作用。

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