• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    趨化因子受體6基因敲除對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響

    2014-03-02 13:02:10張小娟任滿意曹曉青張春盛劉同寶
    中國循環(huán)雜志 2014年4期
    關(guān)鍵詞:趨化因子主動脈斑塊

    張小娟,任滿意,曹曉青,張春盛,劉同寶

    基礎(chǔ)與實驗研究

    趨化因子受體6基因敲除對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響

    張小娟,任滿意,曹曉青,張春盛,劉同寶

    目的:探討趨化因子受體6(CCR6)基因敲除對ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠主動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及其作用機制。

    方法:雜交培育CCR6基因敲除(CCR6-/-)ApoE-/-小鼠20只作為實驗組,普通CCR6+/+ApoE-/-小鼠20只作為對照組,給予高脂飲食。12周后將小鼠處死進行取材固定,主動脈根部冰凍切片進行蘇木素伊紅(HE)染色、油紅O染色及巨噬細胞和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的免疫組化染色,對斑塊的形態(tài)、面積及組成進行觀測。并培育巨噬細胞,進行了噻唑藍比色實驗及細胞遷移實驗,對機制進一步分析。

    結(jié)果:實驗組與對照組相比斑塊面積顯著減小[(8.3±1.9)% vs (16.1±2.0)%, P<0.05];實驗組與對照組相比主動脈根部脂質(zhì)沉積 [(14.4±2.1)% vs (28.5±3.4)%] 及主動脈大體脂質(zhì)沉積[(4.9±2.8)% vs (13.6±3.2)%] 均提示實驗組脂質(zhì)沉積顯著減?。≒<0.05);實驗組與對照組相比斑塊內(nèi)巨噬細胞[(18.9±2.8)% vs (35.7±4.5)%] 及MCP-1表達減少[(16.3±2.2) % vs (23.1±5.6)%]。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    結(jié)論:CCR6通過影響脂質(zhì)沉積、巨噬細胞增殖遷移促進動脈粥樣硬化的形成。

    動脈粥樣硬化;趨化因子受體6;巨噬細胞;單核細胞趨化蛋白1

    Methods: Our research included 2 groups, Experimental group, n=20 CCR6-/-ApoE-/-mice and Control group, n=20 CCR6+/+ApoE-/-mice. Both groups received high-fat diet for 12 weeks, and then, the aortic roots were collected for HE staining, the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in macrophages for immune-histochemisty staining, the macrophages were cultured for migration study, and the results were compared between 2 groups.

    Results: The plaque areas in Experimental group was signif i cantly smaller than those in Control group, (8.3±1.9) % vs (16.1±2.0) %, P<0.05. The Experimental group had less lipid deposition in aortic root, (14.4±2.1) % vs (28.5±3.4) %, and less lipid deposition in aorta (4.9±2.8) % vs (13.6±3.2) %, all P<0.05. The Experimental group showed less macrophages and lower MCP-1 expression in plaques, (18.9±2.8) % vs (35.7±4.5) % and (16.3±2.2) % vs (23.1±5.6) %, all P<0.05.

    Conclusion: CCR6 promotes atherogenesis plaque formation by lipid deposition and macrophage migration in ApoE-/-mice.

    (Chinese Circulation Journal, 2014,29:300.)

    動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種以脂質(zhì)斑塊在動脈壁聚積為特征的疾病,伴有動脈管壁增厚變硬、血管彈性減退及管腔縮窄。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化是一種巨噬細胞介導(dǎo)

    的,多種炎癥因子參與的炎癥性疾病[1]。血液中脂質(zhì)在管壁的過度沉積造成內(nèi)皮細胞損傷,單核細胞浸潤,當(dāng)單核細胞從損傷的內(nèi)皮細胞之間移行至內(nèi)膜下后,在各種炎癥介質(zhì)的刺激下活化為巨噬細胞,又是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟[2]。

    巨噬細胞遷移的過程以及導(dǎo)致其遷移的趨化因子及其受體已經(jīng)成為關(guān)注的焦點。趨化因子通過特異性地偶聯(lián)其在靶細胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體而調(diào)節(jié)白細胞的遷移。在眾多的趨化因子和受體中,趨化因子受體6 (chemokine receptor 6, CCR6)及其配體CC趨化因子配體20(C-C chemokine ligand 20,CCL20)被認為具備穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的功能,新近發(fā)現(xiàn)它們同樣能在炎癥中發(fā)揮作用[3]。本研究利用CCR6基因敲除(CCR6-/-)及載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠分析CCR6在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中發(fā)揮的作用。

    1 材料和方法

    1.1動物來源、飼養(yǎng)及分組

    動物模型的建立:于2012-03至2013-06,將清潔級6周齡雌性ApoE-/-小鼠(維通利華,北京,中國)和CCR6-/-小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor, Maine 04609 USA)進行雜交培養(yǎng),飼養(yǎng)于山東大學(xué)實驗動物中心。

    分 組:20只 8周 齡 的 雜 交 培 育 CCR6-/-ApoE-/-小鼠納入實驗為實驗組,對照組為20只普通CCR6+/+ApoE-/-小鼠。兩組小鼠均給予高脂飼料(含膽固醇0.15%,脂肪21%)喂養(yǎng)12周后,將小鼠處死并行血清血脂及主動脈病理學(xué)檢查。

    1.2檢測指標(biāo)

    蘇木素伊紅(HE)染色:取冰凍切片常規(guī)做HE染色,從每只小鼠主動脈根部連續(xù)切片,每間隔5張取l張,共取3張切片。在光學(xué)顯微鏡下觀察斑塊大小,用多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)軟件(ImagePro-Plus soft-ware)分別測出斑塊面積及血管內(nèi)、外膜長度,回歸標(biāo)準(zhǔn)圓形后計算斑塊面積與血管管腔面積之比。

    油紅O染色:制備冰凍切片,常規(guī)行油紅O染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量的多少。完整取下小鼠主動脈,剝離主動脈外膜,拋開主動脈行油紅O染色,ImagePro-Plus soft-ware計算脂質(zhì)與血管面積之比。

    免疫組化染色:冰凍切片晾干30 min,入蒸餾水中水化30 min,再入0.3%過氧化氫(H2O2)溶液內(nèi)室溫100 min。然后血清封閉1 h,以減少非特異性反應(yīng)。抗單核—巨噬細胞標(biāo)志物抗體(Monocyte/ Macrophage Marker,MOMA-2,1:200)檢測組織切片中巨噬細胞表達[4],抗單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)抗體(1:100)檢測組織切片中MCP-1表達。在光學(xué)顯微鏡下觀察棕黃色顆粒為陽性表達,采用ImagePro-Plus soft-ware做圖像數(shù)字采集及半定量分析。

    1.3細胞實驗

    細胞培養(yǎng):小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞購自American Type Culture Collection (ATCC,美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心),用含有10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI1640(GIBCO,Life Technologies,上海,中國)培養(yǎng)基在37℃、5%的二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d細胞長滿,即可傳代培養(yǎng)。

    蛋白質(zhì)印跡法(Western blot):細胞經(jīng)過裂解后,4℃,12 000 g離心10 min,二辛可寧酸法蛋白檢測(bicinchoninic acid protein assay, BCA)法定量檢測蛋白質(zhì)濃度[5]。加入蛋白上樣緩沖液,煮沸使蛋白質(zhì)變性。相同蛋白含量的提取液加入積層膠90 V,分離膠120 V,電泳分離細胞蛋白,200 mA將膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后,加入一抗(兔抗小鼠MCP-1濃度1:1000),4℃孵育6~12 h。TBST(Tris 25 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0.5%, pH=7.6)洗膜3次,每次5~10 min。加入二抗(山羊抗兔二抗1:20 000),室溫孵育2 h,Tris鹽水吐溫緩沖液(TBST)洗膜3次。最后加入顯影液,印記曝光于X光片上后,進行圖像分析。

    噻唑藍比色(MTT)實驗:將RAW264.7細胞消化成單細胞懸液,以每孔5 000個細胞的濃度將經(jīng)小分子干涉RNA(siRNA)干擾的細胞和對照組細胞分別加入96孔板,每孔200 μl。12 h后每孔均加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl,繼續(xù)孵育4 h后,棄上清液,加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),震蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解,選擇490 nm波長檢測每孔吸光度,并繪制生長曲線。

    細胞遷移(Transwell)實驗:24孔板內(nèi)每孔加有600 μl的培養(yǎng)基(含10%血清),后在細胞遷移的內(nèi)室分別加入經(jīng)或未經(jīng)siRNA處理的RAW264.7細胞(100 μl,含0.1%血清),放入培養(yǎng)箱,12 h后,取出細胞遷移,用棉簽擦去聚碳酸膜(PVPF膜)靠近內(nèi)室那一面的細胞,另一面的細胞用甲醛室溫固定30 min,結(jié)晶紫染色20 min,用清水洗3遍以上,后在顯微鏡下觀察細胞,記數(shù)。

    CCR6 siRNA干擾實驗:CCR6 siRNA試劑盒購

    自 Selleck (Houston, TX 77054 USA),500 μl Opti-MEM(GIBCO)稀釋siRNA (轉(zhuǎn)染細胞的終濃度為33 nM),500 μl Opti-MEM稀釋1.0 μl LipofectamineTM2000 (Invitrogen, Life Technologies,上海),輕輕吹吸3 次混勻,室溫下靜置5 min?;旌限D(zhuǎn)染試劑和siRNA 稀釋液,室溫下靜置20 min。轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細胞板中,1 ml/孔轉(zhuǎn)染6 h后換新鮮培養(yǎng)基。

    1.4統(tǒng)計學(xué)分析

    應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。測量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計量資料采用t檢驗,計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊形成

    HE染色結(jié)果表明,對照組可見小鼠主動脈根部形成大面積斑塊,占管腔面積為[(16.1±2.0)%],實驗組亦可見斑塊形成,但斑塊面積[(8.3±1.9)%]顯著少于對照組(圖1),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積

    油紅O染色發(fā)現(xiàn):對照組可見小鼠主動脈根部形成大面積斑塊,內(nèi)含大量紅染脂質(zhì),占斑塊面積的(28.5±3.4)%;實驗組亦可見斑塊形成,但斑塊內(nèi)紅染脂質(zhì)(14.4±2.1)%顯著少于對照組(圖2A),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。主動脈大體仍然可以發(fā)現(xiàn):對照組斑塊中的紅染面積[(13.6±3.2)%]顯著大于實驗組[(4.9±2.8)%](圖2B),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.3趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊內(nèi)巨噬細胞聚集

    單核—巨噬細胞表面特異性標(biāo)志抗原抗體染色結(jié)果:對照組可見小鼠主動脈根部單核—巨噬細胞[(35.7±4.5)%]表達強陽性,實驗組主動脈根部單核—巨噬細胞[(18.9±2.8)%]顯著減少(圖3),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.4趨化因子受體6 siRNA 抑制巨噬細胞增殖遷移

    噻唑藍比色實驗結(jié)果顯示,CCR6 siRNA干預(yù)6 h后,實驗組與對照組相比[(129.4±12.2)vs (113.8±9.4)] 和 CCR6 siRNA干 預(yù) 12 h [(147.2±13.5) vs(126.7±15.3)] ,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細胞遷移實驗結(jié)果顯示,CCR6 siRNA干預(yù)24 h后,實驗組與對照組相比能夠顯著抑制巨噬細胞的遷移(183.4±19.3 vs 122.8±8.7),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖1 兩組小鼠(n=20)主動脈根部蘇木素伊紅染色結(jié)果

    圖2 兩組小鼠(n=20)油紅O染色結(jié)果

    圖3 兩組小鼠(n=20)主動脈根部單核—巨噬細胞免疫組化染色結(jié)果

    2.5趨化因子受體6基因敲除抑制單核細胞趨化蛋白1表達

    MCP-1免疫組化研究結(jié)果表明,實驗組小鼠主動脈根部MCP-1[(16.3±2.2)%]表達顯著低于對照組[(23.1±5.6)%](圖4),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖4 趨化因子受體6促進單核細胞趨化蛋白1表達

    3 討論

    趨化因子(chemokines)是由小分子分泌蛋白組成的一個大的細胞因子超家族, 能趨化細胞作定向移動,在各種生物學(xué)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。趨化因子受體是異三聚體G蛋白耦聯(lián)受體,有7個跨膜區(qū)。根據(jù)受體結(jié)合的趨化因子種類的不同將受體分為4類:CR、CCR(CCR12CCR9) 、CXCR(CXCR12CXCR5)及CX3CR。

    CCR6是巨噬細胞炎癥蛋白3α(MIP-3α/ CCL20)的受體,CCR6表達于多種白細胞亞型,包括樹突狀細胞、B細胞、TH17細胞、NK細胞、中性粒細胞等[4,5]。Ruth等[6]的研究表明,CCL20-CCR6在體外實驗中能導(dǎo)致單核細胞的趨化;而Le Borgne等[7]的研究進一步表明,CCL20-CCR6能夠在體內(nèi)導(dǎo)致皮炎小鼠單核細胞的聚集。經(jīng)靜脈注射CCL20同樣引起單核巨噬細胞的聚集。對于靜止的單核巨噬細胞和中性粒細胞來說,CCR6的表達是低水平的,但是在動脈粥樣硬化相關(guān)細胞因子的刺激下CCR6的表達水平會迅速升高。最近研究甚至表明,CCR6在具有促炎作用的M1型和抗炎作用M2型兩種巨噬細胞上表達水平相當(dāng)。與健康動脈相比,無論是人的還是小鼠的動脈粥樣硬化的冠狀動脈和頸動脈中,CCR6和CCL20的表達均明顯升高[8,9]。

    本研究中,我們利用CCR6-/-敲基因小鼠第一次證明CCR6直接參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本研究完成CCR6-/-ApoE-/-雙敲小鼠模型的構(gòu)建,利用HE染色證明,與對照組相比,實驗組小鼠斑塊面積明顯減少,這說明CCR6的存在能夠促進斑塊的增長。對主動脈根部及主動脈大體進行油紅O染色,與對照組相比,實驗組小鼠斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減少,表明CCR6的存在直接或間接參與了脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運。

    為了進一步研究CCR6影響斑塊形成及發(fā)展的機制,我們對斑塊內(nèi)的巨噬細胞進行了免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,實驗組小鼠斑塊內(nèi)巨噬細胞含量明顯減少,這證明了CCR6在斑塊內(nèi)能夠促進巨噬細胞的遷移。為了進一步明確CCR6對巨噬細胞增殖遷移的促進作用,我們在體外應(yīng)用CCR6的siRNA阻斷CCR6的表達,結(jié)果表明阻斷CCR6后巨噬細胞增殖遷移活性均受到顯著影響。最后我們在體內(nèi)和體外檢測了MCP-1的表達,結(jié)果顯示阻斷CCR6后MCP-1表達顯著減少,在體內(nèi)體外均證明了這一結(jié)論。有研究表明,CCR6與其配體CCL20的結(jié)合能夠干擾血糖代謝并促進糖尿病的發(fā)病,而CCR6阻斷后能夠明顯抑制糖尿病的進展。此外作為趨化因子,CCR6參與多種細胞因子的代謝,所以其與內(nèi)分泌存在關(guān)系,在以后的實驗中我們將進一步在這一領(lǐng)域做出研究。

    動脈粥樣硬化已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的疾病[10,11],上述所有結(jié)果共同表明,CCR6在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用。這一發(fā)現(xiàn)將為動脈粥樣硬化性疾病的防治提供新的依據(jù)。

    [1] Ghattas A, Griffiths HR, Devitt A, et al. Monocytes in coronary artery disease and atherosclerosis: Where are we now? J Am Coll Cardiol, 2013, 62: 1541-1551.

    [2] Lu X, Kakkar V. Inflammasome and atherogenesis. Curr Pharm Des, 2014,20: 108-124.

    [3] Barth T, Schmidt D, Botteron C, et al. An early reduction in Treg cells correlates with enhanced local inflammation in cutaneous leishmaniasis in CCR6-deficient mice. PLoS One, 2012, 7: e44499.

    [4] Walker JM. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol, 1994, 32: 5-8.

    [5] Twentyman PR, Luscombe M. A study of some variables in a tetrazolium dye (MTT) based assay for cell growth and chemosensitivity. Br J Cancer, 1987, 56: 279-285.

    [6] Ruth JH, Shahrara S, Park CC, et al. Role of macrophage inflammatory protein-3alpha and its ligand CCR6 in rheumatoid arthritis. Lab Invest, 2003, 83: 579-588.

    [7] Le Borgne M, Etchart N, Goubier A, et al. Dendritic cells rapidly recruited into epithelial tissues via CCR6/CCL20 are responsible for CD8+ T cell crosspriming in vivo. Immunity, 2006, 24: 191-201.

    [8] Yilmaz A, Lipfert B, Cicha I, et al. Accumulation of immune cells and high expression of chemokines/chemokine receptors in the upstream shoulder of atherosclerotic carotid plaques. Exp Mol Pathol, 2007, 82: 245-255.

    [9] Calvayrac O, Rodriguez-Calvo R, Alonso J, et al. CCL20 is increased in hypercholesterolemic subjects and is upregulated by LDL in vascular smooth muscle cells: role of NF-kB. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011, 31: 2733-2741.

    [10] 華先平, 楊勇, 婁國平, 等. 瑞舒伐他汀對頸動脈粥樣硬化患者頸動脈內(nèi)中膜厚度及血清炎癥因子的影響. 中國循環(huán)雜志, 2011, 26: 198-201.

    [11] 柯元南. 動脈粥樣硬化的抗栓和抗凝治療. 中國循環(huán)雜志, 2007, 22: 476-478.

    Effect of Chemokine Receptor 6 Knock-out on Atherosclerosis Plaque Formation in ApoE-/-Mice

    ZHANG Xiao-juan, REN Man-yi, CAO Xiao-qing, ZHANG Chu-sheng, LIU Tong-bao.
    Department of Cardiology, Shandong Provincial Chest Hospital, Jinan (250014), Shandong, China

    Objective: To explore the effect of chemokine receptor 6 (CCR6) on atherosclerosis plaque formation in ApoE-/-mice.

    Atherosclerosis; Chemokine receptor 6; Macrophage; Monocyte chemoattractant protein-1

    2013-11-20)

    (編輯:漆利萍)

    250014 山東省濟南市,山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 山東省胸科醫(yī)院 心內(nèi)科

    張小娟 副主任醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病臨床研究 Email: zxj13791050365@163.com 通訊作者:劉同寶 Email: liutongbao@medmail.com.cn

    R541

    A

    1000-3614(2014)04-0300-04

    10.3969/j.issn.1000-3614.2014.04.016

    猜你喜歡
    趨化因子主動脈斑塊
    捕食-食餌系統(tǒng)在離散斑塊環(huán)境下強迫波的唯一性
    頸動脈的斑塊逆轉(zhuǎn)看“軟硬”
    自我保健(2021年2期)2021-11-30 10:12:31
    一篇文章了解頸動脈斑塊
    婦女之友(2021年9期)2021-09-26 14:29:36
    microRNA-146a與冠心病患者斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)性
    Stanford A型主動脈夾層手術(shù)中主動脈假腔插管的應(yīng)用
    趨化因子及其受體在腫瘤免疫中調(diào)節(jié)作用的新進展
    肝細胞癌患者血清趨化因子CXCR12和SA的表達及臨床意義
    趨化因子與術(shù)后疼痛
    護理干預(yù)預(yù)防主動脈夾層介入治療術(shù)后并發(fā)癥
    脊椎動物趨化因子受體CXCR基因分化研究
    观看美女的网站| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲在线自拍视频| 国产精品亚洲美女久久久| 国产高潮美女av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人特级av手机在线观看| 免费观看的影片在线观看| 国产精品永久免费网站| 亚洲色图av天堂| 一区二区三区高清视频在线| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美zozozo另类| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 特级一级黄色大片| 欧美日韩在线观看h| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 久久久久性生活片| 日韩大尺度精品在线看网址| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 看十八女毛片水多多多| 伦理电影大哥的女人| 日本黄大片高清| 久久精品国产自在天天线| 国产不卡一卡二| 久久久久久久久久黄片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美一区二区亚洲| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 最近中文字幕高清免费大全6| 99国产精品一区二区蜜桃av| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 国产精品国产高清国产av| 精品熟女少妇av免费看| 在线观看av片永久免费下载| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 99热网站在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 97热精品久久久久久| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产成人一区二区在线| 99视频精品全部免费 在线| 日韩av不卡免费在线播放| 免费av毛片视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品无大码| 久久久久久久久大av| av在线播放精品| 久99久视频精品免费| 极品教师在线视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 免费av观看视频| 一个人看的www免费观看视频| 国产免费一级a男人的天堂| 午夜福利18| 久久这里只有精品中国| 九九热线精品视视频播放| 夜夜爽天天搞| 国产成人aa在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品野战在线观看| 国产成人freesex在线 | 日韩高清综合在线| 最新在线观看一区二区三区| 久久人妻av系列| 亚洲最大成人中文| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产成年人精品一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 一本久久中文字幕| 一级av片app| 99精品在免费线老司机午夜| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 美女大奶头视频| 亚洲熟妇熟女久久| 色播亚洲综合网| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲欧美精品综合久久99| 99久久精品一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲av成人av| av视频在线观看入口| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 嫩草影院入口| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日本在线视频免费播放| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 97碰自拍视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美成人一区二区免费高清观看| 免费观看的影片在线观看| 精品日产1卡2卡| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美人与善性xxx| 在线a可以看的网站| 日本五十路高清| 国产亚洲91精品色在线| 最近手机中文字幕大全| 美女 人体艺术 gogo| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲欧美日韩东京热| 97碰自拍视频| 在线观看一区二区三区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 午夜视频国产福利| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 中国国产av一级| 日韩欧美精品免费久久| 能在线免费观看的黄片| 高清毛片免费看| 免费人成在线观看视频色| 看十八女毛片水多多多| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 亚洲自偷自拍三级| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日韩av在线大香蕉| 在线看三级毛片| 在线国产一区二区在线| 国产高清视频在线播放一区| 久久精品国产清高在天天线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久草成人影院| 久久久久久久久久成人| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲三级黄色毛片| 欧美人与善性xxx| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 九色成人免费人妻av| 丝袜美腿在线中文| 三级毛片av免费| 国产 一区 欧美 日韩| 久久亚洲国产成人精品v| 99久久九九国产精品国产免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲美女视频黄频| 亚洲国产欧美人成| 最后的刺客免费高清国语| 国产日本99.免费观看| 亚洲人成网站高清观看| 黄色一级大片看看| av在线蜜桃| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美日韩乱码在线| 可以在线观看的亚洲视频| a级一级毛片免费在线观看| 色在线成人网| 高清毛片免费观看视频网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 成人国产麻豆网| 久久九九热精品免费| 97超碰精品成人国产| 久久精品国产自在天天线| 亚洲最大成人手机在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲av.av天堂| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 简卡轻食公司| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲av美国av| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲国产高清在线一区二区三| 97在线视频观看| 免费看日本二区| 国产视频一区二区在线看| 久久精品综合一区二区三区| 久久草成人影院| 成人特级黄色片久久久久久久| 色综合站精品国产| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 日日啪夜夜撸| 亚洲av.av天堂| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩一区二区视频免费看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 波多野结衣高清无吗| 少妇的逼好多水| 精品久久久久久久末码| 人妻久久中文字幕网| 色5月婷婷丁香| 身体一侧抽搐| 在线免费观看的www视频| 一本久久中文字幕| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 日韩中字成人| 国产精品一区www在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 久久久久久久午夜电影| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| videossex国产| 免费av观看视频| 免费av毛片视频| 韩国av在线不卡| 99视频精品全部免费 在线| 舔av片在线| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产淫片久久久久久久久| 国产探花极品一区二区| 国产男人的电影天堂91| 亚洲美女搞黄在线观看 | 99久国产av精品| 日本黄大片高清| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人一区二区视频在线观看| www.色视频.com| 99热这里只有是精品在线观看| 高清午夜精品一区二区三区 | 色av中文字幕| av在线观看视频网站免费| 一级毛片我不卡| 国产伦在线观看视频一区| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久性生活片| 日韩欧美 国产精品| 免费搜索国产男女视频| 久久亚洲国产成人精品v| 99热只有精品国产| 欧美成人精品欧美一级黄| ponron亚洲| 欧美成人a在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲av美国av| 中文字幕免费在线视频6| 97碰自拍视频| 国产片特级美女逼逼视频| 国产黄片美女视频| 国产黄色小视频在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 一本一本综合久久| 国产高清不卡午夜福利| 丝袜美腿在线中文| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 我要看日韩黄色一级片| 99热这里只有是精品50| 久久久久久伊人网av| 欧美丝袜亚洲另类| 身体一侧抽搐| 插阴视频在线观看视频| 精品福利观看| 深爱激情五月婷婷| 真人做人爱边吃奶动态| 精品午夜福利在线看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 最新中文字幕久久久久| 成人二区视频| av在线蜜桃| 久久久久久久午夜电影| 欧美一级a爱片免费观看看| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产午夜福利久久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲精品成人久久久久久| 国产成人aa在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 午夜亚洲福利在线播放| 日韩成人伦理影院| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 最新在线观看一区二区三区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| av女优亚洲男人天堂| 三级经典国产精品| 久久韩国三级中文字幕| 色综合色国产| 我要搜黄色片| 日韩成人伦理影院| 黄色视频,在线免费观看| 可以在线观看毛片的网站| 久久精品国产清高在天天线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品av视频在线免费观看| 国产单亲对白刺激| 亚洲国产精品sss在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 色哟哟哟哟哟哟| 日韩高清综合在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 我要搜黄色片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 18禁在线播放成人免费| 亚洲性久久影院| 久久久久久久午夜电影| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美精品国产亚洲| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲18禁久久av| 亚洲第一电影网av| 久久久久久伊人网av| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美3d第一页| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久人人爽人人片av| 91久久精品电影网| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 99精品在免费线老司机午夜| 香蕉av资源在线| 内地一区二区视频在线| 久久亚洲精品不卡| 中文字幕免费在线视频6| 无遮挡黄片免费观看| 99热全是精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 在线免费十八禁| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美成人a在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 国产一区二区在线av高清观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 99热网站在线观看| av在线老鸭窝| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品电影一区二区三区| 五月玫瑰六月丁香| 联通29元200g的流量卡| 久久精品综合一区二区三区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 日韩强制内射视频| 91在线观看av| 久久久久久国产a免费观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | av.在线天堂| 欧美成人一区二区免费高清观看| 网址你懂的国产日韩在线| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美激情久久久久久爽电影| 免费搜索国产男女视频| 小说图片视频综合网站| 久久九九热精品免费| 成年女人看的毛片在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产熟女欧美一区二区| 老司机影院成人| 免费观看在线日韩| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美3d第一页| avwww免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲综合色惰| 天堂网av新在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩三级伦理在线观看| 青春草视频在线免费观看| 国产av不卡久久| av专区在线播放| 变态另类丝袜制服| 最近最新中文字幕大全电影3| 在线免费观看的www视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 长腿黑丝高跟| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产av在哪里看| 美女高潮的动态| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产日本99.免费观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 色av中文字幕| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲第一电影网av| 亚洲18禁久久av| 精品国内亚洲2022精品成人| 淫秽高清视频在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 99久久精品国产国产毛片| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲av免费高清在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 国产美女午夜福利| 欧美日韩在线观看h| 极品教师在线视频| 99热网站在线观看| 联通29元200g的流量卡| 亚洲av美国av| 波多野结衣巨乳人妻| 俄罗斯特黄特色一大片| 大香蕉久久网| 免费人成视频x8x8入口观看| 全区人妻精品视频| 麻豆成人午夜福利视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品午夜福利视频在线观看一区| 少妇丰满av| 高清毛片免费看| 最新中文字幕久久久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99热网站在线观看| 天堂影院成人在线观看| 波多野结衣高清作品| 免费人成在线观看视频色| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲性久久影院| 欧美激情在线99| 日本成人三级电影网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产高潮美女av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 五月伊人婷婷丁香| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲内射少妇av| 午夜日韩欧美国产| 亚洲七黄色美女视频| 欧美最新免费一区二区三区| 一本一本综合久久| 亚洲真实伦在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩制服骚丝袜av| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美一区二区亚洲| 亚洲专区国产一区二区| 1024手机看黄色片| av中文乱码字幕在线| 成人亚洲精品av一区二区| 国产高清激情床上av| 国产综合懂色| 91久久精品国产一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一级毛片我不卡| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品一二三区在线看| 男女下面进入的视频免费午夜| 观看免费一级毛片| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 久久国内精品自在自线图片| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产av麻豆久久久久久久| 我要搜黄色片| 国产精品亚洲一级av第二区| 午夜激情欧美在线| 久久亚洲精品不卡| 亚州av有码| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 三级经典国产精品| 成人av在线播放网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产大屁股一区二区在线视频| 九色成人免费人妻av| 欧美+日韩+精品| 亚洲五月天丁香| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成人鲁丝片一二三区免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美潮喷喷水| 搡老妇女老女人老熟妇| 插逼视频在线观看| 少妇熟女欧美另类| 国产伦精品一区二区三区视频9| 青春草视频在线免费观看| 久久综合国产亚洲精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产麻豆成人av免费视频| 国产 一区精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美性猛交黑人性爽| 99久久九九国产精品国产免费| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产三级在线视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 九九热线精品视视频播放| 国内精品一区二区在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 一级a爱片免费观看的视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 嫩草影院精品99| 波野结衣二区三区在线| 能在线免费观看的黄片| avwww免费| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美性感艳星| 全区人妻精品视频| 欧美丝袜亚洲另类| 99久久中文字幕三级久久日本| 日韩欧美在线乱码| 久久久久国内视频| av中文乱码字幕在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 成年女人永久免费观看视频| 看十八女毛片水多多多| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 亚洲自拍偷在线| 一级av片app| 久久久久久久久久黄片| 欧美人与善性xxx| 午夜福利视频1000在线观看| 色在线成人网| 精品一区二区三区av网在线观看| 天美传媒精品一区二区| 免费观看在线日韩| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚州av有码| 欧美人与善性xxx| 久久国内精品自在自线图片| 国产 一区精品| 午夜精品一区二区三区免费看| 男女之事视频高清在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 看免费成人av毛片| 国产精品一区www在线观看| 最新中文字幕久久久久| 麻豆一二三区av精品| 亚洲五月天丁香| 波多野结衣高清无吗| 精品久久久久久久久久久久久| 中文字幕熟女人妻在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 桃色一区二区三区在线观看| 黑人高潮一二区| 日韩国内少妇激情av| 国产欧美日韩一区二区精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲国产精品成人综合色| 精品人妻偷拍中文字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 丰满乱子伦码专区| 日本成人三级电影网站| 国产69精品久久久久777片| 色吧在线观看| 免费看光身美女| 成人av在线播放网站| 深夜a级毛片| 淫妇啪啪啪对白视频| 成人午夜高清在线视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产成人福利小说| 亚洲色图av天堂| 人妻少妇偷人精品九色| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成人av一区二区三区在线看| 特大巨黑吊av在线直播| 色综合站精品国产| 国产高清不卡午夜福利| 在线看三级毛片| 亚洲18禁久久av| 欧美激情国产日韩精品一区| 精品欧美国产一区二区三| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美最黄视频在线播放免费| 天天躁日日操中文字幕| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 色尼玛亚洲综合影院| 成人特级av手机在线观看| 全区人妻精品视频| 人妻久久中文字幕网| 久久久久久大精品| 精品熟女少妇av免费看| 国产91av在线免费观看| 嫩草影院精品99| 精品一区二区三区人妻视频| 成年av动漫网址| a级毛片免费高清观看在线播放| 中文亚洲av片在线观看爽| 如何舔出高潮| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲色图av天堂| 国产精品一二三区在线看| 免费高清视频大片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 女人被狂操c到高潮| 男女边吃奶边做爰视频| 全区人妻精品视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 天天躁日日操中文字幕| 亚洲乱码一区二区免费版| 黄色欧美视频在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 久久人妻av系列| 欧美在线一区亚洲| 国产高清视频在线播放一区| 日韩欧美国产在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产三级中文精品| 十八禁国产超污无遮挡网站| 色播亚洲综合网|