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    趨化因子受體6基因敲除對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響

    2014-03-02 13:02:10張小娟任滿意曹曉青張春盛劉同寶
    中國循環(huán)雜志 2014年4期
    關(guān)鍵詞:趨化因子主動脈斑塊

    張小娟,任滿意,曹曉青,張春盛,劉同寶

    基礎(chǔ)與實驗研究

    趨化因子受體6基因敲除對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響

    張小娟,任滿意,曹曉青,張春盛,劉同寶

    目的:探討趨化因子受體6(CCR6)基因敲除對ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠主動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及其作用機制。

    方法:雜交培育CCR6基因敲除(CCR6-/-)ApoE-/-小鼠20只作為實驗組,普通CCR6+/+ApoE-/-小鼠20只作為對照組,給予高脂飲食。12周后將小鼠處死進行取材固定,主動脈根部冰凍切片進行蘇木素伊紅(HE)染色、油紅O染色及巨噬細胞和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的免疫組化染色,對斑塊的形態(tài)、面積及組成進行觀測。并培育巨噬細胞,進行了噻唑藍比色實驗及細胞遷移實驗,對機制進一步分析。

    結(jié)果:實驗組與對照組相比斑塊面積顯著減小[(8.3±1.9)% vs (16.1±2.0)%, P<0.05];實驗組與對照組相比主動脈根部脂質(zhì)沉積 [(14.4±2.1)% vs (28.5±3.4)%] 及主動脈大體脂質(zhì)沉積[(4.9±2.8)% vs (13.6±3.2)%] 均提示實驗組脂質(zhì)沉積顯著減?。≒<0.05);實驗組與對照組相比斑塊內(nèi)巨噬細胞[(18.9±2.8)% vs (35.7±4.5)%] 及MCP-1表達減少[(16.3±2.2) % vs (23.1±5.6)%]。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    結(jié)論:CCR6通過影響脂質(zhì)沉積、巨噬細胞增殖遷移促進動脈粥樣硬化的形成。

    動脈粥樣硬化;趨化因子受體6;巨噬細胞;單核細胞趨化蛋白1

    Methods: Our research included 2 groups, Experimental group, n=20 CCR6-/-ApoE-/-mice and Control group, n=20 CCR6+/+ApoE-/-mice. Both groups received high-fat diet for 12 weeks, and then, the aortic roots were collected for HE staining, the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in macrophages for immune-histochemisty staining, the macrophages were cultured for migration study, and the results were compared between 2 groups.

    Results: The plaque areas in Experimental group was signif i cantly smaller than those in Control group, (8.3±1.9) % vs (16.1±2.0) %, P<0.05. The Experimental group had less lipid deposition in aortic root, (14.4±2.1) % vs (28.5±3.4) %, and less lipid deposition in aorta (4.9±2.8) % vs (13.6±3.2) %, all P<0.05. The Experimental group showed less macrophages and lower MCP-1 expression in plaques, (18.9±2.8) % vs (35.7±4.5) % and (16.3±2.2) % vs (23.1±5.6) %, all P<0.05.

    Conclusion: CCR6 promotes atherogenesis plaque formation by lipid deposition and macrophage migration in ApoE-/-mice.

    (Chinese Circulation Journal, 2014,29:300.)

    動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種以脂質(zhì)斑塊在動脈壁聚積為特征的疾病,伴有動脈管壁增厚變硬、血管彈性減退及管腔縮窄。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化是一種巨噬細胞介導(dǎo)

    的,多種炎癥因子參與的炎癥性疾病[1]。血液中脂質(zhì)在管壁的過度沉積造成內(nèi)皮細胞損傷,單核細胞浸潤,當(dāng)單核細胞從損傷的內(nèi)皮細胞之間移行至內(nèi)膜下后,在各種炎癥介質(zhì)的刺激下活化為巨噬細胞,又是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟[2]。

    巨噬細胞遷移的過程以及導(dǎo)致其遷移的趨化因子及其受體已經(jīng)成為關(guān)注的焦點。趨化因子通過特異性地偶聯(lián)其在靶細胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體而調(diào)節(jié)白細胞的遷移。在眾多的趨化因子和受體中,趨化因子受體6 (chemokine receptor 6, CCR6)及其配體CC趨化因子配體20(C-C chemokine ligand 20,CCL20)被認為具備穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的功能,新近發(fā)現(xiàn)它們同樣能在炎癥中發(fā)揮作用[3]。本研究利用CCR6基因敲除(CCR6-/-)及載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠分析CCR6在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中發(fā)揮的作用。

    1 材料和方法

    1.1動物來源、飼養(yǎng)及分組

    動物模型的建立:于2012-03至2013-06,將清潔級6周齡雌性ApoE-/-小鼠(維通利華,北京,中國)和CCR6-/-小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor, Maine 04609 USA)進行雜交培養(yǎng),飼養(yǎng)于山東大學(xué)實驗動物中心。

    分 組:20只 8周 齡 的 雜 交 培 育 CCR6-/-ApoE-/-小鼠納入實驗為實驗組,對照組為20只普通CCR6+/+ApoE-/-小鼠。兩組小鼠均給予高脂飼料(含膽固醇0.15%,脂肪21%)喂養(yǎng)12周后,將小鼠處死并行血清血脂及主動脈病理學(xué)檢查。

    1.2檢測指標(biāo)

    蘇木素伊紅(HE)染色:取冰凍切片常規(guī)做HE染色,從每只小鼠主動脈根部連續(xù)切片,每間隔5張取l張,共取3張切片。在光學(xué)顯微鏡下觀察斑塊大小,用多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)軟件(ImagePro-Plus soft-ware)分別測出斑塊面積及血管內(nèi)、外膜長度,回歸標(biāo)準(zhǔn)圓形后計算斑塊面積與血管管腔面積之比。

    油紅O染色:制備冰凍切片,常規(guī)行油紅O染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量的多少。完整取下小鼠主動脈,剝離主動脈外膜,拋開主動脈行油紅O染色,ImagePro-Plus soft-ware計算脂質(zhì)與血管面積之比。

    免疫組化染色:冰凍切片晾干30 min,入蒸餾水中水化30 min,再入0.3%過氧化氫(H2O2)溶液內(nèi)室溫100 min。然后血清封閉1 h,以減少非特異性反應(yīng)。抗單核—巨噬細胞標(biāo)志物抗體(Monocyte/ Macrophage Marker,MOMA-2,1:200)檢測組織切片中巨噬細胞表達[4],抗單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)抗體(1:100)檢測組織切片中MCP-1表達。在光學(xué)顯微鏡下觀察棕黃色顆粒為陽性表達,采用ImagePro-Plus soft-ware做圖像數(shù)字采集及半定量分析。

    1.3細胞實驗

    細胞培養(yǎng):小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞購自American Type Culture Collection (ATCC,美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心),用含有10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI1640(GIBCO,Life Technologies,上海,中國)培養(yǎng)基在37℃、5%的二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d細胞長滿,即可傳代培養(yǎng)。

    蛋白質(zhì)印跡法(Western blot):細胞經(jīng)過裂解后,4℃,12 000 g離心10 min,二辛可寧酸法蛋白檢測(bicinchoninic acid protein assay, BCA)法定量檢測蛋白質(zhì)濃度[5]。加入蛋白上樣緩沖液,煮沸使蛋白質(zhì)變性。相同蛋白含量的提取液加入積層膠90 V,分離膠120 V,電泳分離細胞蛋白,200 mA將膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后,加入一抗(兔抗小鼠MCP-1濃度1:1000),4℃孵育6~12 h。TBST(Tris 25 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0.5%, pH=7.6)洗膜3次,每次5~10 min。加入二抗(山羊抗兔二抗1:20 000),室溫孵育2 h,Tris鹽水吐溫緩沖液(TBST)洗膜3次。最后加入顯影液,印記曝光于X光片上后,進行圖像分析。

    噻唑藍比色(MTT)實驗:將RAW264.7細胞消化成單細胞懸液,以每孔5 000個細胞的濃度將經(jīng)小分子干涉RNA(siRNA)干擾的細胞和對照組細胞分別加入96孔板,每孔200 μl。12 h后每孔均加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl,繼續(xù)孵育4 h后,棄上清液,加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),震蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解,選擇490 nm波長檢測每孔吸光度,并繪制生長曲線。

    細胞遷移(Transwell)實驗:24孔板內(nèi)每孔加有600 μl的培養(yǎng)基(含10%血清),后在細胞遷移的內(nèi)室分別加入經(jīng)或未經(jīng)siRNA處理的RAW264.7細胞(100 μl,含0.1%血清),放入培養(yǎng)箱,12 h后,取出細胞遷移,用棉簽擦去聚碳酸膜(PVPF膜)靠近內(nèi)室那一面的細胞,另一面的細胞用甲醛室溫固定30 min,結(jié)晶紫染色20 min,用清水洗3遍以上,后在顯微鏡下觀察細胞,記數(shù)。

    CCR6 siRNA干擾實驗:CCR6 siRNA試劑盒購

    自 Selleck (Houston, TX 77054 USA),500 μl Opti-MEM(GIBCO)稀釋siRNA (轉(zhuǎn)染細胞的終濃度為33 nM),500 μl Opti-MEM稀釋1.0 μl LipofectamineTM2000 (Invitrogen, Life Technologies,上海),輕輕吹吸3 次混勻,室溫下靜置5 min?;旌限D(zhuǎn)染試劑和siRNA 稀釋液,室溫下靜置20 min。轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細胞板中,1 ml/孔轉(zhuǎn)染6 h后換新鮮培養(yǎng)基。

    1.4統(tǒng)計學(xué)分析

    應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。測量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計量資料采用t檢驗,計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊形成

    HE染色結(jié)果表明,對照組可見小鼠主動脈根部形成大面積斑塊,占管腔面積為[(16.1±2.0)%],實驗組亦可見斑塊形成,但斑塊面積[(8.3±1.9)%]顯著少于對照組(圖1),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積

    油紅O染色發(fā)現(xiàn):對照組可見小鼠主動脈根部形成大面積斑塊,內(nèi)含大量紅染脂質(zhì),占斑塊面積的(28.5±3.4)%;實驗組亦可見斑塊形成,但斑塊內(nèi)紅染脂質(zhì)(14.4±2.1)%顯著少于對照組(圖2A),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。主動脈大體仍然可以發(fā)現(xiàn):對照組斑塊中的紅染面積[(13.6±3.2)%]顯著大于實驗組[(4.9±2.8)%](圖2B),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.3趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊內(nèi)巨噬細胞聚集

    單核—巨噬細胞表面特異性標(biāo)志抗原抗體染色結(jié)果:對照組可見小鼠主動脈根部單核—巨噬細胞[(35.7±4.5)%]表達強陽性,實驗組主動脈根部單核—巨噬細胞[(18.9±2.8)%]顯著減少(圖3),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.4趨化因子受體6 siRNA 抑制巨噬細胞增殖遷移

    噻唑藍比色實驗結(jié)果顯示,CCR6 siRNA干預(yù)6 h后,實驗組與對照組相比[(129.4±12.2)vs (113.8±9.4)] 和 CCR6 siRNA干 預(yù) 12 h [(147.2±13.5) vs(126.7±15.3)] ,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細胞遷移實驗結(jié)果顯示,CCR6 siRNA干預(yù)24 h后,實驗組與對照組相比能夠顯著抑制巨噬細胞的遷移(183.4±19.3 vs 122.8±8.7),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖1 兩組小鼠(n=20)主動脈根部蘇木素伊紅染色結(jié)果

    圖2 兩組小鼠(n=20)油紅O染色結(jié)果

    圖3 兩組小鼠(n=20)主動脈根部單核—巨噬細胞免疫組化染色結(jié)果

    2.5趨化因子受體6基因敲除抑制單核細胞趨化蛋白1表達

    MCP-1免疫組化研究結(jié)果表明,實驗組小鼠主動脈根部MCP-1[(16.3±2.2)%]表達顯著低于對照組[(23.1±5.6)%](圖4),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖4 趨化因子受體6促進單核細胞趨化蛋白1表達

    3 討論

    趨化因子(chemokines)是由小分子分泌蛋白組成的一個大的細胞因子超家族, 能趨化細胞作定向移動,在各種生物學(xué)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。趨化因子受體是異三聚體G蛋白耦聯(lián)受體,有7個跨膜區(qū)。根據(jù)受體結(jié)合的趨化因子種類的不同將受體分為4類:CR、CCR(CCR12CCR9) 、CXCR(CXCR12CXCR5)及CX3CR。

    CCR6是巨噬細胞炎癥蛋白3α(MIP-3α/ CCL20)的受體,CCR6表達于多種白細胞亞型,包括樹突狀細胞、B細胞、TH17細胞、NK細胞、中性粒細胞等[4,5]。Ruth等[6]的研究表明,CCL20-CCR6在體外實驗中能導(dǎo)致單核細胞的趨化;而Le Borgne等[7]的研究進一步表明,CCL20-CCR6能夠在體內(nèi)導(dǎo)致皮炎小鼠單核細胞的聚集。經(jīng)靜脈注射CCL20同樣引起單核巨噬細胞的聚集。對于靜止的單核巨噬細胞和中性粒細胞來說,CCR6的表達是低水平的,但是在動脈粥樣硬化相關(guān)細胞因子的刺激下CCR6的表達水平會迅速升高。最近研究甚至表明,CCR6在具有促炎作用的M1型和抗炎作用M2型兩種巨噬細胞上表達水平相當(dāng)。與健康動脈相比,無論是人的還是小鼠的動脈粥樣硬化的冠狀動脈和頸動脈中,CCR6和CCL20的表達均明顯升高[8,9]。

    本研究中,我們利用CCR6-/-敲基因小鼠第一次證明CCR6直接參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本研究完成CCR6-/-ApoE-/-雙敲小鼠模型的構(gòu)建,利用HE染色證明,與對照組相比,實驗組小鼠斑塊面積明顯減少,這說明CCR6的存在能夠促進斑塊的增長。對主動脈根部及主動脈大體進行油紅O染色,與對照組相比,實驗組小鼠斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減少,表明CCR6的存在直接或間接參與了脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運。

    為了進一步研究CCR6影響斑塊形成及發(fā)展的機制,我們對斑塊內(nèi)的巨噬細胞進行了免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,實驗組小鼠斑塊內(nèi)巨噬細胞含量明顯減少,這證明了CCR6在斑塊內(nèi)能夠促進巨噬細胞的遷移。為了進一步明確CCR6對巨噬細胞增殖遷移的促進作用,我們在體外應(yīng)用CCR6的siRNA阻斷CCR6的表達,結(jié)果表明阻斷CCR6后巨噬細胞增殖遷移活性均受到顯著影響。最后我們在體內(nèi)和體外檢測了MCP-1的表達,結(jié)果顯示阻斷CCR6后MCP-1表達顯著減少,在體內(nèi)體外均證明了這一結(jié)論。有研究表明,CCR6與其配體CCL20的結(jié)合能夠干擾血糖代謝并促進糖尿病的發(fā)病,而CCR6阻斷后能夠明顯抑制糖尿病的進展。此外作為趨化因子,CCR6參與多種細胞因子的代謝,所以其與內(nèi)分泌存在關(guān)系,在以后的實驗中我們將進一步在這一領(lǐng)域做出研究。

    動脈粥樣硬化已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的疾病[10,11],上述所有結(jié)果共同表明,CCR6在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用。這一發(fā)現(xiàn)將為動脈粥樣硬化性疾病的防治提供新的依據(jù)。

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    Effect of Chemokine Receptor 6 Knock-out on Atherosclerosis Plaque Formation in ApoE-/-Mice

    ZHANG Xiao-juan, REN Man-yi, CAO Xiao-qing, ZHANG Chu-sheng, LIU Tong-bao.
    Department of Cardiology, Shandong Provincial Chest Hospital, Jinan (250014), Shandong, China

    Objective: To explore the effect of chemokine receptor 6 (CCR6) on atherosclerosis plaque formation in ApoE-/-mice.

    Atherosclerosis; Chemokine receptor 6; Macrophage; Monocyte chemoattractant protein-1

    2013-11-20)

    (編輯:漆利萍)

    250014 山東省濟南市,山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 山東省胸科醫(yī)院 心內(nèi)科

    張小娟 副主任醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病臨床研究 Email: zxj13791050365@163.com 通訊作者:劉同寶 Email: liutongbao@medmail.com.cn

    R541

    A

    1000-3614(2014)04-0300-04

    10.3969/j.issn.1000-3614.2014.04.016

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