他汀類(lèi)藥物穩(wěn)定載脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用

周曉斌，楊麗霞，郭明，劉莉，郭瑞威，梁星

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

他汀類(lèi)藥物穩(wěn)定載脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用

周曉斌，楊麗霞，郭明，劉莉，郭瑞威，梁星

目的：明確他汀類(lèi)藥物在載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠中穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用。

方法：將24只8周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=12）和他汀組（n=12），高脂飼養(yǎng)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。他汀組用阿托伐他汀[10 mg/（kg.d）]灌胃，8周后處死所有小鼠取主動(dòng)脈弓制成石蠟切片，行蘇木素伊紅染色、免疫組化、天狼星紅染色，評(píng)估斑塊的相對(duì)面積、斑塊穩(wěn)定性（用纖維帽厚度/內(nèi)膜中層厚度表示）、斑塊易損指數(shù)[VI＝（脂質(zhì)空泡+巨噬細(xì)胞）/（平滑肌細(xì)胞+膠原纖維）]。

結(jié)果：與對(duì)照組相比，他汀組小鼠的斑塊相對(duì)面積減小[（0.36±0.09）vs （0.46±0.09），P＜0.01]，纖維帽厚度/內(nèi)膜中層厚度增加[（71.52±16.48）vs （51.93±21.94），P＜0.05]，易損指數(shù)降低[（2.73±2.02）vs （8.94±0.67），P＜0.05）。他汀組斑塊內(nèi)含有較少的脂質(zhì)空泡[（0.51±0.11）vs（0.62±0.10），P＜0.05]和巨噬細(xì)胞[（0.06±0.04）vs（0.09±0.04），P＜0.05]，較多的平滑肌纖維[（0.18±0.05） vs （0.10±0.06），P＜0.01]和膠原纖維[（0.08±0.06） vs（0.03±0.04），P＜0.05]。

結(jié)論：他汀類(lèi)藥物增加ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。

他??；冠狀動(dòng)脈粥樣硬化；不穩(wěn)定斑塊

Methods: A total of 24 ApoE-/-mice at 8 weeks of age were used, the atherosclerosis model was established by high fat diet for 8 weeks and the mice were randomized into 2 groups. Statin group, the mice were lavaged with atorvastatin 10 mg/(kg.d) and Control group, the mice received normal saline. n=12 in each group. The HE staining, Sirius red staining and immuneohistochemistry staining were respectively conducted to evaluate the relative plaque area, the fi brous cap thickness/tunica intima media thickness (FCT/IMT) and the plaque vulnerability index (VI), VI = lipoid vesicles+ macrophages/smooth muscle cells + collagen.

Results: Compared with Control group, Statin group showed smaller plague area (0.46±0.09) vs (0.36±0.09), P<0.01, higher ratio of FCT/IMT (51.93±21.94) vs (71.52±16.48), P<0.05, and decreased VI (8.94±0.67) vs (2.73±2.02), P<0.05. Compared with Control group, the plaque in Statin group had less lipoid vesicles (0.62±0.10) vs (0.51±0.11), less macrophages (0.09±0.04) vs (0.06±0.04), all P<0.05 and more smooth muscle cells (0.10±0.06) vs (0.18±0.05), P<0.01, more collagen (0.03±0.04) vs (0.08±0.06), P<0.05.

Conclusion: Statin increased the stability of the atherosclerosis plaque in ApoE-/-mice.

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:296.)

急性冠狀動(dòng)脈（冠脈）綜合征主要?dú)w咎于易損斑塊的破裂，對(duì)易損斑塊研究是目前心血管領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。病理學(xué)研究證明，易損斑塊的特點(diǎn)是斑塊中膠原和平滑肌細(xì)胞減少，纖維帽變薄，脂質(zhì)池周?chē)写罅康幕罨奘杉?xì)胞浸潤(rùn)。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)提示，目前唯一公認(rèn)的穩(wěn)定斑塊的藥物為他汀類(lèi)藥物，但對(duì)其穩(wěn)定斑塊的機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論，本研究評(píng)估了阿托伐他汀干預(yù)載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用，試圖探討他汀類(lèi)藥物穩(wěn)定斑塊的機(jī)制。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料：2011-01至2012-05，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為8周齡ApoE-/-雄性小鼠24只，平均體重（23.39±1.12）g，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（京）2009-007。

主要試劑：阿托伐他汀原藥（美國(guó)輝瑞公司贊助），蘇木素伊紅（成都科龍化工公司），SV-0002免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），DAB 顯色液（ZLI-9032，北京中杉金橋），巨噬細(xì)胞抗體 MAC387（Abcom公司，美國(guó)），平滑肌細(xì)胞抗體 α-actin（Santa Cruz公司，美國(guó)），天狼星紅-飽和苦味酸液（成都科龍化工公司），天青石藍(lán)液（成都科龍化工公司）。主要儀器設(shè)備：石蠟切片機(jī)（A130328，中國(guó)），熒光倒置顯微鏡（Leica DMIRB，德國(guó)），Leica DFC圖像采集軟件（Leica microsystems，德國(guó)），圖像分析軟件IPP 6.0（Media Cybernetics，美國(guó)）。

動(dòng)物飼養(yǎng)：用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)8周齡的ApoE-/-小鼠，1周后開(kāi)始高脂飼養(yǎng)，高脂飼料配方為普通飼料+1.25%膽固醇+15%豬油。小鼠飼養(yǎng)條件：清潔（SPF級(jí)）動(dòng)物房，溫度18～22℃，濕度50%～60%，12 h/12 h光照/黑暗交替實(shí)驗(yàn)環(huán)境飼養(yǎng)。保持室內(nèi)空氣新鮮，氨濃度不超過(guò)20 ppm，換氣次數(shù)應(yīng)10～20次/h。墊料選用闊葉林木的鋸末，經(jīng)消毒滅菌處理后使用，每日更換墊料。飲水標(biāo)準(zhǔn)不低于城市生活飲水的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，用飲水瓶給水，每日換水。

試驗(yàn)分組與干預(yù)：用隨機(jī)數(shù)字法將24只ApoE-/-小鼠分為對(duì)照組和他汀組，每組各12只。從第9周齡開(kāi)始干預(yù)，他汀組用阿托伐他汀[10 mg/（kg.d）]灌胃，對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃，每日灌胃量定為3 ml，每晚1次。每周稱(chēng)體重以調(diào)整小鼠的給藥濃度。第17周齡末處死所有小鼠。

制作標(biāo)本：取小鼠主動(dòng)脈弓，用新鮮配制好的4%多聚甲酫固定。制成石蠟切片，每張切片厚度為10 μm。每隔相鄰的10張切片取1張做蘇木素伊紅染色。主要步驟為：脫蠟至水，蘇木素染色 5 min，1%鹽酸乙醇分化1～3 s，0.5%伊紅液染色 1～3 min，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。根據(jù)蘇木素伊紅染色結(jié)果，每只小鼠選取斑塊面積最大的1張切片測(cè)量斑塊相對(duì)面積，纖維帽厚度/內(nèi)膜中層厚度和脂質(zhì)空泡相對(duì)面積，其后連續(xù)的3張切片分別做巨噬細(xì)胞免疫組化，平滑肌細(xì)胞免疫組化，膠原纖維天狼星紅染色。

免疫組化主要步驟：脫蠟至水后，3%H2O2覆蓋組織5 min去除過(guò)氧化物酶。微波抗原修復(fù)，溫度嚴(yán)格控制在92～96℃。室溫下封閉20 min。每個(gè)組織區(qū)域加入1:200稀釋的抗體30 μl，陰性對(duì)照加入等量的蒸餾水，4℃過(guò)夜。加入聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG（SV-0002），37℃孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色后蘇木素復(fù)染10 min。脫水透明，中性樹(shù)膠封片。

天狼星紅染色：石蠟切片脫蠟至水，加入天青石藍(lán)液10 min，蒸餾水沖洗3次，天狼星紅飽和苦味酸液1 h，蘇木素液淡染細(xì)胞核，無(wú)水乙醇分化與脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

IPP圖像分析：斑塊相對(duì)面積＝斑塊面積/血管腔面積，斑塊穩(wěn)定性＝纖維帽厚度/內(nèi)膜中層厚度，纖維帽厚度＜65 μm定義為不穩(wěn)定斑塊，脂質(zhì)空泡相對(duì)含量＝脂質(zhì)空泡面積/斑塊面積，組織相對(duì)表達(dá)＝斑塊內(nèi)目標(biāo)細(xì)胞累積光密度值/斑塊面積，易損指數(shù)（VI）＝（巨噬細(xì)胞+脂質(zhì)空泡）/（平滑肌細(xì)胞+膠原纖維）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間均值比較采用成組t檢驗(yàn)，方差不齊選擇t′檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈斑塊面積比較

顯微鏡下觀察，他汀組與對(duì)照組皆有斑塊生長(zhǎng)。對(duì)照組的動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，斑塊面積較大，斑塊周?chē)梢?jiàn)明顯的上皮細(xì)胞增生；他汀組的動(dòng)脈內(nèi)膜稍增厚，斑塊面積較?。▓D1）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示他汀組斑塊面積小于對(duì)照組[（0.36±0.09）vs （0.46±0.09），t=2.850，P＜0.01）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1

表1 兩組小鼠主動(dòng)脈斑塊數(shù)據(jù)匯總

2.2兩組小鼠主動(dòng)脈斑塊的穩(wěn)定性比較

用纖維帽厚度/內(nèi)膜中層厚度代表斑塊的穩(wěn)定性，他汀組小鼠的斑塊穩(wěn)定性大于對(duì)照組 [（0.56±0.09）vs（0.26±0.13），t=-6.913，P＜0.01]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。根據(jù)纖維帽厚度＜65 μm定義為不穩(wěn)定斑塊[1]，他汀組主要為穩(wěn)定斑塊（51.93±21.94） μm，對(duì)照組主要為不穩(wěn)定斑塊（71.52±16.48） μm，t=-2.318，P＜0.05，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1

2.3兩組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)空泡含量的比較

分析蘇木素伊紅染色結(jié)果（圖2），脂質(zhì)空泡的含量間接代表脂質(zhì)的相對(duì)含量，他汀組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)空泡明顯少于對(duì)照組[（0.51±0.11） vs（0.62±0.09），t=2.597，P＜0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1

2.4兩組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量的比較

免疫組化結(jié)果顯示：斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞被染色黃褐色（圖3箭頭所指）。對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈斑塊斑塊內(nèi)大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，多分布于斑塊的肩部，而他汀組小鼠主動(dòng)脈斑塊斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞較少。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：他汀組巨噬細(xì)胞的含量少于對(duì)照組[（0.06±0.04）vs （0.09±0.04），t=2.083，P＜0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1

2.5兩組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞數(shù)量的比較

斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞后被染成褐色（圖4箭頭所指），顯微鏡下觀察，對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈斑塊纖維帽內(nèi)平滑肌層菲薄，而他汀組纖維帽內(nèi)含有較厚的平滑肌層。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，他汀組斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞含量明顯多于對(duì)照組[（0.18±0.05）vs （0.10±0.06）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.445，P＜0.01）。表1

2.6兩組小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)膠原纖維含量的比較

用天狼星紅染色顯示膠原成份，斑塊內(nèi)Ⅰ型膠原纖維被染成紅色和黃色，Ⅲ型膠原纖維被染成綠色（圖5箭頭所示），他汀組含有豐富的膠原成分。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：他汀組的膠原含量明顯多于對(duì)照組[（0.08±0.06）vs（0.03±0.04）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t'=-2.388，P＜0.05）。表1

圖1 兩組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)斑塊相對(duì)面積比較（×100）

圖2 兩組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)空泡含量比較（×100）

圖3 兩組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量比較（×100）

圖4 兩組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞含量比較（×100）

圖5 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)膠原含量比較（×100）

2.7兩組小鼠的易損指數(shù)比較

與對(duì)照組相比，他汀組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定的成份（如脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞）含量減少，增加斑塊穩(wěn)定性的成份（如平滑肌細(xì)胞和膠原纖維）增多。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，他汀組斑塊易損指數(shù)明顯低于對(duì)照組[（2.73±2.02）vs（8.94±0.67），t'=2.417，P＜0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1

3 討論

本研究采用斑塊相對(duì)面積，纖維帽厚度/內(nèi)膜中層厚度，易損指數(shù)等指標(biāo)來(lái)評(píng)估易損斑塊，從脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和膠原纖維等角度探討他汀穩(wěn)定斑塊的作用機(jī)制。

他汀可減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小及增加斑塊的穩(wěn)定性。Insull等[2]證明他汀可減少冠心病患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的大小；臨床研究證明他汀可明顯減少斑塊的黃色病變期（不穩(wěn)定斑塊），從而發(fā)揮穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用[3]，Takarada等[4]證實(shí)他汀可增加心肌梗塞患者斑塊纖維帽厚度。以上試驗(yàn)證明了他汀對(duì)人動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用，但無(wú)法對(duì)斑塊大小及穩(wěn)定性做精確直接的測(cè)量。我們對(duì)斑塊穩(wěn)定性的評(píng)估不僅從斑塊大小的水平上采用了纖維帽厚度和纖維帽厚度/內(nèi)膜中層厚度的指標(biāo)，而且從斑塊組成成分的角度上引入了易損指數(shù)的指標(biāo)[5]，從兩個(gè)層面證實(shí)了他汀對(duì)斑塊易損性的影響。通過(guò)8周的干預(yù)，他汀使ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊的相對(duì)面積減少了21.7%，同時(shí)使斑塊的穩(wěn)定性增加了37.7%。

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊影響穩(wěn)定性的重要成分為脂質(zhì)，主要包括兩部分：脂質(zhì)池和攝取了脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞（即泡沫細(xì)胞）。Tsuchiya等[6]研究證明了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與他汀的干預(yù)有直接關(guān)系。本研究證明他汀明顯減少ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞的含量，從而增加了斑塊的穩(wěn)定性。此作用可能得益于他汀的調(diào)脂機(jī)制，即降低血清低密度脂蛋白膽固醇的濃度，減少脂質(zhì)在斑塊內(nèi)的沉積；也可能通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞的促炎癥、斑塊破裂以及血栓的作用，達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

平滑肌細(xì)胞和膠原纖維共同構(gòu)成了斑塊內(nèi)的“鋼性骨架”，維持斑塊的穩(wěn)定性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：他汀增加了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞和膠原纖維的含量。其抗動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)機(jī)制可能與下列因素有關(guān)：疾病初期，他汀抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡，抑制斑塊的形成；疾病發(fā)展期，他汀抑制巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，同時(shí)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)和分泌組織型金屬蛋白酶抑制物因子-1，以抑制膠原降解，從而使斑塊趨于穩(wěn)定。

綜上所述，大劑量他汀可減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的正性重構(gòu)，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；他汀可能通過(guò)多種機(jī)制減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)和沉積和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，增加了平滑肌細(xì)胞和膠原的含量，從而降低了斑塊的易損性。本研究進(jìn)一步為他汀穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的機(jī)制提供了多角度的思考，但對(duì)這一機(jī)理的全面而深入的闡釋尚需要更多證據(jù)的支持。

[1] Burke AP, Farb A, Malcom GT, et al. Coronary risk factors and plaque morphology in men with coronary disease who died suddenly. N Engl J Med, 1997, 336: 1276-1282.

[2] Insull W Jr. The pathology of atherosclerosis: plaque development and plaque responses to medical treatment. Am J Med, 2009, 122(1 Suppl): S3-S14.

[3] Hirayama A, Saito S, Ueda Y, et al. Plaque-stabilizing effect of atorvastatin is stronger for plaques evaluated as more unstable by angioscopy and intravenous ultrasound. Circ J, 2011, 75: 1448-1454.

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Statin Stabilized the Atherosclerosis Plaque in Apo-lipoprotein E Gene Knockout Mice

ZHOU Xiao-bin, YANG Li-xia, GUO Ming, LIU Li, GUO Rui-wei, LIANG Xing.
Department of Cardiology, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming (650032), Yunnan, China Corresponding Author: YANG Li-xia, E-mail:doctorylixia@aliyun.com

Objective: To clarify the plaque stabilization effect of statin in the apo-lipoprotein E gene knockout (ApoE-/-) mice.

Statin; Atherosclerosis; Vulnerable plague

2013-09-26）

（助理編輯：許菁）

650032 云南省昆明市，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院 心血管內(nèi)科（周曉斌、楊麗霞、郭瑞威、梁星）；武警云南省總隊(duì)醫(yī)院（郭明、劉莉）

周曉斌 碩士研究生 主要從事心血管病基礎(chǔ)研究 Email: doctorzhouxiaobin@163.com. 通訊作者：楊麗霞 Email: doctorylixia@aliyun.com

R54

A

1000-3614（2014）04-0296-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.04.015