液固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究

陳書明

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品園林學(xué)院，河南 三門峽 472000）

技術(shù)與應(yīng)用

液固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究

陳書明

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品園林學(xué)院，河南 三門峽 472000）

利用蘋果渣為原料，通過炭黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母的液固態(tài)混合發(fā)酵，制備蘋果渣多酶蛋白飼料。 研究表 明 ：液 體 培 養(yǎng) 的 重 要 參 數(shù) 是 溫 度 28℃ 、 接 種 量 12%、 蔗 糖 添 加 量 15g、 轉(zhuǎn) 速 180r/m in， 時(shí) 間 72h；液 體 培 養(yǎng) 產(chǎn) 物 短 期 儲(chǔ)藏，10℃效益高，長期儲(chǔ)藏，2℃～5℃效果好；固體發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵條件是：接種量 10%～14%，培養(yǎng)時(shí)間為 5～6d。 發(fā)酵產(chǎn)物 中 粗 蛋 白 、真 蛋 白 質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 提 高 了 103.1%、165.76%， 粗 纖 維 、 還 原 糖 則 降 低 了 42.51%、53.62%， 纖 維 素 酶 活 力 增加 了 3000U/g，果 膠酶活 力增 加了 50000U/g。 該方 法生 產(chǎn)的飼 料蛋 白符合 企業(yè) 植物發(fā) 酵蛋 白質(zhì)飼 料標(biāo) 準(zhǔn)。

液固態(tài)發(fā)酵；蘋果渣；蛋白飼料

蘋果渣是蘋果汁加工業(yè)的副產(chǎn)物，有高度的可生物降解性，會(huì)導(dǎo)致腐爛發(fā)臭的味道，影響水資源和生態(tài)系統(tǒng)，因此需要尋找合理的資源化利用途徑。 研究發(fā)現(xiàn)以蘋果渣為主要基質(zhì)原料，采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)可較大幅度地提高物料蛋白質(zhì)含量。但人們多致力于提高蘋果渣的蛋白質(zhì)含量，很少涉及抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解與低分子糖類的轉(zhuǎn)化；其次，存在如菌體生長較慢，種子培養(yǎng)基用量大，發(fā)酵時(shí)間長等問題，很難進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。

本文采用兩株高產(chǎn)酶菌株對(duì)蘋果渣進(jìn)行液固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)多酶蛋白飼料，對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)纖維素的生物降解、蛋白質(zhì)和酶含量的提高水平等進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蘋果渣：河南緣份果業(yè)有限公司；炭黑曲霉（編號(hào)：41254）、產(chǎn)朊假絲酵母（編號(hào)：31923）購于中國工業(yè)菌種保藏管理中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白飼料的制備

（1）黑曲霉的擴(kuò)培：

①活化：將保存的黑曲霉接到馬鈴薯培養(yǎng)基的搖瓶中，100-120r/min、28℃培養(yǎng)。

②一級(jí)擴(kuò)培：將活化后的菌液畫線到改良馬丁瓊脂斜面上，28℃培養(yǎng)靜置培養(yǎng)。

③二級(jí)擴(kuò)培：取一級(jí)擴(kuò)培時(shí)典型菌落接種到培養(yǎng)基中，28℃，120r/min 培養(yǎng)。

二級(jí)擴(kuò)培培養(yǎng)基：蛋白胨 3.0g；干果渣 5g，磷酸氫 二 鉀 1.0g； 酵 母 浸 出 粉 2.0g； 氯 化 鈣 0.5g； 葡 萄 糖20.0g；H2O1L。

（2）產(chǎn)朊假絲酵母的擴(kuò)培：

①菌種活化：將保存的產(chǎn)朊假絲酵母接種到50Be'麥芽汁培養(yǎng)基中，90r/min，30℃培養(yǎng) 4d。

②擴(kuò)培培養(yǎng)： 活化后的菌種接種到 YPD 培養(yǎng)基上，90r/min，30℃培養(yǎng)。

（3）液體培養(yǎng)（此階段為炭黑曲霉與穿軟假絲酵母的混合培養(yǎng)）：

把菌體調(diào)成濃度為 2×108/L， 按照 5%-10%的接種量接入。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：干蘋果渣 25g，蔗糖 10-20g，蛋白胨 3g，CaCl20.5g，酵母浸出粉 2.0g，KH2PO41g。 水1000mL。 90-180r/m，24-32℃培養(yǎng) 4d。

（4）固體發(fā)酵：

干 蘋 果 渣 500g， 麩 皮 100g， 尿 素 10g，KH2PO410g，水 700ml。 分 裝 于 4 個(gè) 5L 的 錐 形 瓶 中 。每個(gè)瓶中加（3）培養(yǎng)后的 60、100、140ml菌液，24℃培養(yǎng) 6d。

固體發(fā)酵結(jié)束，把發(fā)酵產(chǎn)物 50℃干燥至恒重。

1.2.2 生長曲線繪制：

（1）炭黑曲霉生長曲線

將裝有 50ml培養(yǎng)液的試管封口后置于振蕩培養(yǎng)箱中，在 28℃，90r/min 條件下培養(yǎng)，每 4h 取樣一次，共培養(yǎng) 36h。 將樣品試管培養(yǎng)物抽濾，然后將培養(yǎng)物附帶濾紙 （濾紙?jiān)诔闉V前進(jìn)行稱量， 質(zhì)量標(biāo)記為 m′）一起置于烘 箱中 105℃干燥置恒重，最 后用電子天平對(duì)其進(jìn)行稱量，質(zhì)量標(biāo)記為 m。 黑曲霉菌絲的干重M按照公式：

M=m-m′，計(jì)算。 以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，炭黑曲霉的干重為縱坐標(biāo)繪制炭黑曲霉的生長曲線（圖 1）。

（2）產(chǎn)朊假絲酵母生長曲線 在擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)，每 3h 取樣一次，共取樣 8 次，測(cè)定其在 600nm 下的吸光值，繪制種子生長曲線（圖 2）。本試驗(yàn)采用比濁法測(cè)定，由于細(xì)菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。 將所測(cè)得的光密度值（OD600）與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。

1.2.3 菌體和孢子計(jì)數(shù)：

根據(jù)菌體生長曲線，選擇對(duì)數(shù)生長期的菌種進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。方法是將擴(kuò)培結(jié)束的炭黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母經(jīng)過梯度稀釋，通過稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌活數(shù)。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取影響菌體生長的重要因素即溫度、接種量、轉(zhuǎn)速、蔗糖添加量 4 個(gè)因素，各取 3 個(gè)水平，測(cè)定液體培養(yǎng)過程中菌體數(shù)量，進(jìn)行 L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)因素和水平見表 1。

表1 液體培養(yǎng)的正交設(shè)計(jì)因素和水平

1.3 干飼料的理化測(cè)定：

粗 蛋 白 的 測(cè) 定 采 用 雙 縮 脲 法[1]。

真 蛋 白 的 測(cè) 定 采 用 改 進(jìn) 的 微 量 凱 氏 定 氮 法[2]。稱取固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物 5g，用 40mL 體積分?jǐn)?shù) 75%的乙醇浸提 24h，充分?jǐn)?拌、抽濾，濾渣 再 用 40mL 體積分?jǐn)?shù) 75%的乙醇反復(fù)洗滌 2 次，以洗去無機(jī)氮和尿素，同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)。 將沉淀物于 60℃下干燥至恒量，再用微量凱氏定氮法測(cè)定。

還原糖含量的測(cè)定 沸煮 30min，過濾，重復(fù) 3次，合并濾液，再用費(fèi)林法對(duì)溶液測(cè)定。

粗 纖 維 含 量 的 測(cè) 定 采 用 過 濾 法[3]。

灰 分 含 量 的 測(cè) 定 用[4]。

纖維素酶活力測(cè)定采用 3，5-二硝基水 楊 酸 法[5]。

果 膠 酶 活 力 采 用 黏 度 法[6]。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 種子生長曲線

由圖 1 可知，在 0-8h，炭黑曲霉干重增加緩慢，這說明該階段為孢子的萌發(fā)期，8-16h，干重迅速增加，之后干重值變化趨于平坦，這說明 8-16h 為炭黑曲霉的對(duì)數(shù)生長期，16-36h 為穩(wěn)定期。 在發(fā)酵過程中，為縮短菌體的適應(yīng)時(shí)間，選擇炭黑曲霉菌體繁殖最快，菌體最強(qiáng)壯的對(duì)數(shù)生長期末期的菌體進(jìn)行液體培養(yǎng)接種。

圖1 炭黑曲霉生長曲線

由圖 2可知， 產(chǎn)朊假絲酵母在培養(yǎng)的最初 6h生長緩慢， 之后到 12h 這段時(shí)間生長迅速，12-24h這段時(shí)間菌液的吸光度幾乎沒有變化。這說明在培養(yǎng)的前 5h是菌體的適應(yīng)階段， 之后進(jìn)入快速生長階段，是菌體的對(duì)數(shù)期生長期，此后，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，但是由于由于光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌與死菌，因此所測(cè)定的生長曲線的衰亡期不明顯，另外，如果菌體衰亡的特別多，菌體會(huì)破裂，這時(shí)吸光度值會(huì)減小的，因此說明該階段可能只是菌體的穩(wěn)定期，檢測(cè)沒有進(jìn)行到衰亡期。

圖2 產(chǎn)朊假絲酵母生長曲線

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)液體培養(yǎng)期菌種生長的影響

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在表1所確定的主要影響因素和水平的基礎(chǔ)上，按 L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，測(cè)定培養(yǎng)液中菌體數(shù)量。 正交數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表2。

表2 液體培養(yǎng)的正交試驗(yàn)結(jié)果和直觀分析表

從表 2 的 R 值可知，A＞D＞C＞B， 對(duì)菌體數(shù)量影響最大的因素是溫度，其次是蔗糖量，接種量相對(duì)較小 ，轉(zhuǎn) 速 影 響 最 小 。 最 優(yōu) 水 平 組 合 結(jié) 果 為 A2B2C3D2。而這個(gè)最優(yōu)水平組合在正交試驗(yàn)過程中是沒有進(jìn)行的，因此需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。 在進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，只對(duì)影響菌體數(shù)量的主要因素進(jìn)行驗(yàn)證，轉(zhuǎn)速作為影響最小的因素，不再驗(yàn)證。

2.2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長的影響

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定菌體的培養(yǎng)溫度為26、28、30℃，接種量取 10%，蔗糖量取 15g，轉(zhuǎn) 速 取180_r/min。 在培養(yǎng)的 48h、72h、96h 進(jìn)行取樣，通過平板菌落計(jì)數(shù)。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長的影響

圖 3 顯示，在 26、28℃培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)基內(nèi)的菌體數(shù)量增加，總體呈上升趨勢(shì)。 30℃條件下，開始的前 72h 菌體數(shù)量呈上升趨勢(shì)，但是，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長菌體數(shù)量呈下降趨勢(shì)，96h 檢測(cè)時(shí)與 72h 相比，下降近 7%。 這可能是由于剛開始時(shí)由于各種營養(yǎng)物質(zhì)充足，在適度較高的情況下有利于菌體的繁殖，后來隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)液內(nèi)積累了大量的菌體，但此時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)因逐漸消耗而不能滿足所有菌體的需要，從而導(dǎo)致一部分菌體的死亡。 在培養(yǎng)的 96_h內(nèi)，28℃較 26℃能培養(yǎng)更多數(shù)量的菌體， 所以最適的液體培養(yǎng)溫度是 28℃。

2.2.3 接種量對(duì)菌 體生長的影響

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定菌體的接種量設(shè)為8%、10%、12%，培養(yǎng)溫度為 28℃，蔗糖量取 15g，轉(zhuǎn)速取 180r/min。 在培養(yǎng)的 48h、72h、96h 進(jìn)行取樣，通過平板菌落計(jì)數(shù)。

圖4 接種量對(duì)菌體生長的影響

接種量的多少直接影響到菌種的生長速度。接種量小培養(yǎng)時(shí)間就要延長，由于目的菌群數(shù)量不足還容易感染雜菌，同時(shí)菌絲體容易抱團(tuán)生長導(dǎo)致團(tuán)中心缺氧而導(dǎo)致菌體數(shù)量增長緩慢；接種量大，如果培養(yǎng)時(shí)間過長將會(huì)導(dǎo)致菌體產(chǎn)生較多的有害物質(zhì)，對(duì)菌體的生長是不利的。

由圖 4 可知，8%、10%的接種量使液體培養(yǎng)時(shí)的菌體數(shù)量在培養(yǎng)的 96小時(shí)內(nèi)呈增加趨勢(shì)， 在接種后的 72h 內(nèi)，12%的在接種后 72h 呈增加趨勢(shì)，之后呈下降趨勢(shì)。 8%的接種量雖然整體呈增加趨勢(shì)，但總量低于 10%，可能的原因是炭黑曲霉再生長過程中由于接種量小而抱團(tuán)生長，再培養(yǎng)基內(nèi)溶氧量不高的情況下菌團(tuán)中間的菌體很難獲得足夠的氧氣而導(dǎo)致整體的菌體數(shù)量增加不多。 10%的接種量菌絲體呈分散狀生長，菌體缺氧現(xiàn)象不明顯。12%的也呈分散狀生長， 但是由于后期液體發(fā)粘，溶氧量下降， 導(dǎo)致在 72-96h 的這段時(shí)間內(nèi)有部分菌體因缺氧而死亡。

在培養(yǎng)的 96h 內(nèi)，接種量為 8%、10%、12%三者中，12%的接種量培養(yǎng) 72h 時(shí)菌體數(shù)目最多， 說明最好的接種量為 12%，培養(yǎng)時(shí)間是 72h。

2.2.4 蔗糖添加量對(duì)菌體生長的影響

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定菌體的蔗糖添加量設(shè)為 13、15、17，培 養(yǎng) 溫 度 為 28℃，接 種 量 取 12%，轉(zhuǎn)速取 180r/min。 在培養(yǎng)的 48h、72h、96h 進(jìn)行取樣，通過平板菌落計(jì)數(shù)。

圖5 蔗糖添加量對(duì)菌體生長的影響

圖 5 顯示，在培養(yǎng)的前 72h，添加 13、15、17g 蔗糖對(duì)菌體數(shù)量影響不明顯，在 72-96h，添加 17g 的菌體數(shù)量多于 13、15g 的， 并且培養(yǎng)基中添加 13、15g 的 ，菌 體數(shù) 量 有 所下 降 ，17g 的菌 體 數(shù) 量 變 化 不明顯。 這表明培養(yǎng)基中添加 17g蔗糖效果最好。

2.3 存儲(chǔ)條件對(duì)液體培養(yǎng)產(chǎn)物的影響

把炭黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母液體混合培養(yǎng)后，所得的菌體與培養(yǎng)基的液體混合物將作為進(jìn)一步蘋果汁固體發(fā)酵的發(fā)酵劑。 在實(shí)際生產(chǎn)中，發(fā)酵劑制備好后通常需要存儲(chǔ)和流通后被使用，因此研究存儲(chǔ)條件對(duì)發(fā)酵劑的有效使用是非常必要的。

因?yàn)閯傊苽浜玫陌l(fā)酵劑中的菌處于生理活性很旺的狀態(tài)，要使發(fā)酵劑能長期保存，必須使菌體生理活性降低而又不死亡，其中溫度是關(guān)鍵。 設(shè)定儲(chǔ)藏溫度分別為 2℃、5℃、10℃， 保藏 7、14、30d 后用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌體數(shù)量（發(fā)酵劑制備后迅速降溫至設(shè)定溫度進(jìn)行試驗(yàn)）。

圖6 存儲(chǔ)條件對(duì)菌體的影響

由圖 6 可知，在 2、5℃的條件下，發(fā)酵劑內(nèi)菌體數(shù)量變化趨勢(shì)不明顯，10℃的條件下， 菌體數(shù)量變化呈下降趨勢(shì)。 在存儲(chǔ)的前 14d，10℃與 2、5℃的菌體數(shù)量差異不大，之后 10℃的明顯低于 2、5℃的。這說明 10℃條件下適合短期存儲(chǔ)，2、5℃的條件適合長期存儲(chǔ)，考慮到制冷對(duì)能耗的消耗，長期存儲(chǔ)在5℃下是最合適的。

2.4 固體發(fā)酵條件的確定

接種量的減少意味著生產(chǎn)便利和發(fā)酵產(chǎn)量的增加，應(yīng)該在允許的范圍內(nèi)盡可能降低接種量。 但太少的接種量會(huì)使發(fā)酵時(shí)間延長，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，同時(shí)發(fā)揮不了菌種優(yōu)勢(shì)，容易感染其他雜菌，產(chǎn)生異味，影響產(chǎn)物品質(zhì)。

圖7 接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗蛋白含量的影響

圖 7 顯示，隨著接種量的加大，粗蛋白含量呈遞增趨勢(shì)；隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，粗蛋白含量也呈遞增趨勢(shì)；接 100m l發(fā)酵劑與接 140ml發(fā)酵劑在培養(yǎng) 6d 的情況下粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差不大，接 60m l發(fā)酵劑在培養(yǎng)時(shí)粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與 100、140 相比差異較大。由此可知，接 100m l或 140ml發(fā)酵劑是比較適合。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)生產(chǎn)至關(guān)重要，時(shí)間短，達(dá)不到理想的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而太長，則生產(chǎn)周期與成本增加。圖7顯示底物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)態(tài)變化。即隨發(fā)酵的進(jìn)行，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均迅速上升。 在接種量為 100、140ml的情況 下 ， 發(fā) 酵 的 4d 與 5d 相比，粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，發(fā)酵 5d 與 6d 差異不顯著。 綜合考慮發(fā)酵時(shí)間、接種量、成本等多種因素，當(dāng)接種量為 100ml時(shí)，發(fā) 酵 6d 效果較 好，接種量 140m l時(shí)，發(fā)酵 5d 效果較好。

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物主要成分測(cè)定和分析

對(duì)發(fā)酵原料和產(chǎn)物進(jìn)行主要成分測(cè)定，結(jié)果如表 3 所示。 由結(jié)果可知：以蘋果渣為主要原料，經(jīng)液固態(tài)混合發(fā)酵后，產(chǎn)物的主要成分發(fā)生明顯變化。粗 蛋 白 、 真 蛋 白 質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 提 高 了 103.1% 、165.76%，粗纖維、還原糖則 降低了 42.51%、53.62%，纖維素酶活力增加了 3000U/g， 果膠酶活力增加了50000U/g。 蛋白質(zhì)含量符合福建科佳奇邁生物工程有限公司的植物發(fā)酵蛋白質(zhì)飼料標(biāo)準(zhǔn)[7]。

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：1671-9123（2014）03-0106-04

2013-07-07

三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院橫向合作項(xiàng)目（SZY-2013-019）

陳書明（1980-），女，河南許昌人，三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院講師。