小干擾RNA阻斷周期蛋白依賴激酶4對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

常軍 劉玲芳 鄭殊娟 張嬋

1.四川省婦幼保健院婦科，四川 成都 610045；2.重慶市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400014

小干擾RNA阻斷周期蛋白依賴激酶4對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

常軍1 劉玲芳1 鄭殊娟1 張嬋2

1.四川省婦幼保健院婦科，四川 成都 610045；2.重慶市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400014

背景與目的：細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的重要激酶之一，有實(shí)驗(yàn)報(bào)道其在子宮內(nèi)膜癌中呈高表達(dá)，但是其在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其可能機(jī)制還不十分明確。本研究旨在通過(guò)小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默CDK4表達(dá)，并檢測(cè)其對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能機(jī)制。方法：將化學(xué)合成的CDK4-siRNA轉(zhuǎn)染至HEC-1B細(xì)胞；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中CDK4的mRNA表達(dá)量變化；Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞CDK4、視母細(xì)胞瘤基因(retinoblastoma gene，Rb)及其下游p-Rb的蛋白表達(dá)量的變化；分別采用CCK-8法、流式細(xì)胞儀、Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖、周期、凋亡以及侵襲能力的變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后HEC-1B細(xì)胞中CDK4 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.01)；抑制CDK4表達(dá)后，抑制HEC-1B細(xì)胞的增殖及侵襲，轉(zhuǎn)染si-CDK4組細(xì)胞發(fā)生侵襲數(shù)為(117±21)個(gè)，而轉(zhuǎn)染si-control組及未處理組分別為(269±39)個(gè)和(262±35)個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染后早期凋亡率為(21.7±3.5)%，較未處理組［(12.4±2.1)%］和si-control組［(11.8±1.9)%］明顯增加(P＜0.01)；細(xì)胞周期分布發(fā)生變化，G1期比例增加(P＜0.01)，S期細(xì)胞比例降低(P＜0.01)；進(jìn)一步的Western blot結(jié)果顯示，抑制CDK4表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)p-Rb表達(dá)下降，但是總Rb表達(dá)無(wú)明顯變化。結(jié)論：針對(duì)CDK4基因的特異性小RNA干擾片段能夠下調(diào)CDK4基因在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)，抑制腫瘤生物學(xué)進(jìn)程。

子宮內(nèi)膜癌；RNA干擾；細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4；視母細(xì)胞瘤基因

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是危害女性健康的三大惡性生殖道腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制及治療的研究一直是婦科腫瘤學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。據(jù)2011年資料統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)北京、上海等發(fā)達(dá)城市，EC的發(fā)病率已經(jīng)躍居?jì)D女生殖道惡性腫瘤的首位［1］。

細(xì)胞周期的紊亂是腫瘤發(fā)生的基本特性之一，近年多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與周期調(diào)控相關(guān)的基因的表達(dá)異常介導(dǎo)了腫瘤的發(fā)生，如細(xì)胞周期蛋白D(cyclin D，CCND)、細(xì)胞周期蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDKs)、p53、p16、p27以及視母細(xì)胞瘤基因 (retinoblastoma，Rb)等［2］。CDK4是一類絲/蘇氨酸激酶，是細(xì)胞周期重要調(diào)控分子之一，它能夠特異地與周期蛋白D結(jié)合形成復(fù)合物，磷酸化下游的Rb，介導(dǎo)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化［3-4］。Berthet等［5］的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，同時(shí)敲除CDK2和CDK4基因的小鼠具有胚胎致死性，并且心臟發(fā)育結(jié)構(gòu)異常，將獲得的胚胎成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其增殖能力明顯受到抑制。目前，多項(xiàng)研究證實(shí)在EC組織中存在CDK4異常激活［6］，并且與腫瘤組織的臨床分期呈正相關(guān)，提示CDK4在EC的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)靶向CDK4的RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)阻斷細(xì)胞中該基因的表達(dá)，進(jìn)一步探討CDK4對(duì)EC細(xì)胞的生物學(xué)行為影響及其可能機(jī)制，為EC的分子生物治療提供一個(gè)新的分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1材料

人EC細(xì)胞株HEC-1B購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；新生胎牛血清購(gòu)于美國(guó)PAA公司；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶購(gòu)買自美國(guó)Hyclone公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染試劑、si-CDK4/sicontrol干擾片段購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，為了提高轉(zhuǎn)染效率，該公司提供的是4段CDK4干擾片段的混合體，其基因序列分別為：si-CDK4(1)：5’-GCAAAGACCUACUUCU GAA-3’，si-CDK4(2)：5’-GAAGAAGACUGG CCUAGAG-3’；si-CDK4(3)：5’-UAACAGAU A U C G A U G A A C U-3’，s i-C D K 4(4)：5’-GGCCUUGCCCGCAUCUAUA-3’；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所Dojindo；凋亡試劑盒PE Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；PI購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；RNasA購(gòu)自美國(guó)Boehringer Mannheim公司；Transwell小室(8.0 μm孔徑)以及Matrigel膠均購(gòu)自美國(guó)BD公司；CDK4、Rb、p-Rb以及GAPDH的一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；X線片為柯達(dá)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

由于約80%的EC患者屬于子宮內(nèi)膜樣腺癌(Ⅰ型EC)，故本實(shí)驗(yàn)選用子宮內(nèi)膜樣腺癌組織分離出的永生細(xì)胞株HEC-1B進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(http://www.atcc.org)。HEC-1B細(xì)胞用含10%胎牛血清、10 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。0.25%胰酶消化、傳代。轉(zhuǎn)染前1 d，以適合的密度傳代細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將化學(xué)合成的CDK6的siRNA按照Dhamafect 1轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染至HEC-1B細(xì)胞中。根據(jù)處理方式的不同，細(xì)胞分為3組：si-CDK4組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-CDK4)；si-con組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-control片段)；untreated組(細(xì)胞僅轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染試劑)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后CDK4表達(dá)量的變化

轉(zhuǎn)染換液后48 h，運(yùn)用TRIzol法分別提取3組細(xì)胞的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，應(yīng)用PRISM 7000型定量PCR儀(Applied Biosystemss)進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參。檢測(cè)引物設(shè)計(jì)CDK4順義鏈：5’- ACCAGATGGCACTTACACCC-3’，CDK4反義鏈：5’-TCCACAGAAGAGAGGCTT TCG-3’；GAPDH順義鏈：5’-TCAACGACCACT TTGTCAAGCTCA-3’；GADPH反義鏈：5’-GCTGGTGGTCCAG GGGTCTTACT-3’。PCR反應(yīng)條件為95 ℃變性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸20 s，循環(huán)40次，PCR擴(kuò)增結(jié)束后繪制熔解曲線，對(duì)目的基因的表達(dá)采用 2-ΔΔCt法行相對(duì)定量分析。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

取轉(zhuǎn)染后24 h的HEC-1B細(xì)胞，離心(1000 r/ min，半徑10 cm，5 min)后重懸于新鮮完全培養(yǎng)基，鋪于96孔板中，每個(gè)處理組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔鋪5 000個(gè)細(xì)胞(100 μL/孔)，采用CCK-8試劑盒分別檢測(cè)0、24、48和72 h時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性，在檢測(cè)前2 h在每孔加入10 mL CCK-8液，37 ℃溫育2 h后，用自動(dòng)酶標(biāo)平板閱讀儀于450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化

轉(zhuǎn)染換液后16 h，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞饑餓24 h后加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h后胰酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次。再將細(xì)胞重懸于100 μL PBS中，緩慢加入400 μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇，室溫固定1 h后離心(1000 r/min，半徑10 cm，5 min)去乙醇。PBS洗滌細(xì)胞2次后再次重懸于100 μL PBS，分別加入50 μg/mL的PI和100 μg/mL的RNase A，4 ℃避光溫育30 min，補(bǔ)加400 μL PBS過(guò)濾后480 nm波長(zhǎng)進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h (3%血清培養(yǎng))，用不含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次。將5×105個(gè)細(xì)胞重懸于100 μL結(jié)合緩沖液中。加入5 μL PE標(biāo)記的 Annexin-V和5 μL 7AAD染料，輕輕混勻后室溫避光反應(yīng)15 min。補(bǔ)加200 μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。注意設(shè)置陰性對(duì)照和單陽(yáng)對(duì)照，利用陰性對(duì)照組圈定細(xì)胞群，利用單陽(yáng)對(duì)照調(diào)節(jié)補(bǔ)償。Annexin-V(+)/7AAD(-)代表早期凋亡，Annexin-V(+)/7AAD(+)代表晚期凋亡和壞死，AnnexinV(-)/7AAD(-)代表陰性未凋亡，AnnexinV(-)/7AAD(+)代表機(jī)械損傷。本實(shí)驗(yàn)中選取AnnexinV(+)/7AAD(-)的細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞比例，繪制統(tǒng)計(jì)圖。

1.2.6 體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力變化

將凍存于-20 ℃的Matrigel膠4 ℃過(guò)夜融化，用4 ℃預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至1 mg/mL，冰上操作。將40 μL稀釋后的Matrigel膠包被小室多聚碳酸酯膜的上室面，37 ℃溫育3～5 h，膠凝固后備用；細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，取4×105個(gè)細(xì)胞重懸于400 μL無(wú)血清的培養(yǎng)基中，將細(xì)胞混合液加入到Matrigel膠的上層；小室的下層中加入含20% FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)24 h后，取出小室，吸出小室中培養(yǎng)基，小心擦去上層細(xì)胞，PBS洗2次，甲醇室溫固定10 min，0.5%結(jié)晶紫染色5 min，清水輕輕浸洗數(shù)次，倒置晾干，刀片揭膜，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)6個(gè)視野穿膜細(xì)胞并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平變化

提取各組細(xì)胞中的總蛋白并用BCA法測(cè)蛋白濃度，取30 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)硝酸纖維膜(PVDF膜)后5%脫脂牛奶封閉1 h，分別與CDK4、Rb、p-Rb(1∶1 000)、GAPDH(1∶20 000)蛋白特異性一抗稀釋液4 ℃溫育過(guò)夜，TBST緩沖液漂洗5次，每次5 min，加入相應(yīng)濃度的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液，室溫1 h，TBST緩沖液漂洗5次，每次5 min，用ECL化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，暗室下顯影。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有研究均設(shè)3份平行試驗(yàn)，采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示，兩組間數(shù)據(jù)比較，采用t檢驗(yàn)分析，兩組以上數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染后CDK4及其下游基因在HEC-1B細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HEC-1B細(xì)胞中CDK4的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果如圖1A所示，si-CDK4組HEC-1B細(xì)胞中CDK4的mRNA表達(dá)水平與untreated組及si-con組相比，分別下降約35% (P＜0.001)和40% (P＜0.001)；而HEC-1B細(xì)胞的si-con組和untreated組CDK4表達(dá)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明轉(zhuǎn)染干擾片段si-CDK4后，明顯抑制了CDK4在HEC-1B細(xì)胞中表達(dá)。同時(shí)，我們運(yùn)用Western blot法檢測(cè)了轉(zhuǎn)染后CDK4及其下游基因Rb及p-Rb蛋白表達(dá)變化。結(jié)果如圖1B所示，拮抗CDK4表達(dá)后，細(xì)胞中CDK4及p-Rb表達(dá)量均明顯降低，但是總的Rb表達(dá)無(wú)明顯變化(圖1B)。

圖1 HEC-1B轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)CDK4及其下游基因表達(dá)Fig. 1 The expression of CDK4 and its downstream genes in HEC-1B cells upon transfection.

2.2 si-CDK4抑制HEC-1B細(xì)胞增殖

運(yùn)用CCK-8法，我們分別檢測(cè)了0 、24 、48及72 h時(shí)各組細(xì)胞的增殖活性，并繪制了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)染48 h后，si-CDK4組細(xì)胞的增殖能力較untreated組和si-con組細(xì)胞明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而untreated組和si-con組間細(xì)胞的增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 si-CDK4對(duì)HEC-1B細(xì)胞增殖活性的影響Fig. 2 Effects of CDK4 siRNA on the proliferation of HEC-1B cells.

2.3 低表達(dá)CDK4后HEC-1B細(xì)胞周期分布發(fā)生改變

為了進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)染CDK4干擾質(zhì)粒后對(duì)細(xì)胞周期的影響，我們運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析了轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的分布情況。如圖3所示，si-CDK4組細(xì)胞中G1期比例為(64.9±4.1)%，較untreated組［(52.1±1.6)%］和si-con組［(51.4±1.3)%］明顯升高(P＜0.001)，而S期細(xì)胞［(25.7±2.1)%］較untreated組［(37.2±3.3)%］和si-con組［(38.5±2.8)%］則明顯減少(P＜0.001)，untreated組與si-con組細(xì)胞間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明si-CDK4能明顯抑制HEC-1B細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，阻滯細(xì)胞的周期進(jìn)程。

2.4 低表達(dá)CDK4促進(jìn)HEC-1B細(xì)胞的凋亡

HEC-1B細(xì)胞中si-CDK4組細(xì)胞的早期凋亡率為(21.7±3.5)%，較untreated組［(12.4±2.1)%］和si-con組［(11.8±1.9)%］明顯增加(P＜0.01)，而untreated組和si-con組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明抑制細(xì)胞中CDK4的表達(dá)能夠明顯促進(jìn)HEC-1B細(xì)胞中的早期凋亡的發(fā)生。

2.5 si-CDK4抑制HEC-1B細(xì)胞的侵襲

運(yùn)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)CDK4對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，si-CDK4組平均穿膜細(xì)胞細(xì)胞數(shù)(117±25)個(gè)明顯少于untreated組(269±39)個(gè)和si-control組(262±35)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而si-con組和untreated組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明si-CDK4能抑制HEC-1B細(xì)胞的體外侵襲。

圖3 si-CDK4對(duì)HEC-1B細(xì)胞周期分布的影響Fig. 3 Effects of si-CDK4 on the cell cycle distribution of HEC-1B cells.

圖4 CDK4表達(dá)抑制對(duì)HEC-1B細(xì)胞凋亡的影響Fig. 4 Effects of CDK4 suppression on the HEC-1B cell apoptosis.

圖5 轉(zhuǎn)染si-CDK4后對(duì)HEC-1B細(xì)胞侵襲能力的變化Fig. 5 Effects of si-CDK4 on the invasion of HEC-1B cells(crystal violet staining, ×100)

3 討 論

2001年，Elbashir等［7］將體外合成的siRNA片段運(yùn)用于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，抑制其體內(nèi)特異基因的表達(dá)，之后越來(lái)越多的學(xué)者將siRNA運(yùn)用于人類疾病治療實(shí)驗(yàn)中。Kosciolek等［8］發(fā)現(xiàn)siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，RNA干擾的效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴性的，具有分子藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，這將為腫瘤的分子治療提供新的平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)將CDK4-siRNA片段經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功地轉(zhuǎn)染至人ECHEC-1B細(xì)胞中，RT-PCR法及免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中CDK4的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下降，表明干擾片段在EC細(xì)胞中成功發(fā)揮作用，有效抑制細(xì)胞內(nèi)CDK4的表達(dá)。

細(xì)胞周期的有序調(diào)控是保證細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)的基本過(guò)程，細(xì)胞無(wú)限增殖將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。G1/S期及G2/M期轉(zhuǎn)化位點(diǎn)是細(xì)胞周期進(jìn)行自控性調(diào)控的關(guān)鍵位點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞周期將停滯于限制點(diǎn)內(nèi)，完成細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的自我修復(fù)，一旦這一調(diào)控失控，有可能導(dǎo)致細(xì)胞不斷的自我增殖而介導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化［9］。其中CDK4介導(dǎo)了細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化，細(xì)胞中CDK4表達(dá)上調(diào)，將加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。李洪國(guó)等［10］的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，運(yùn)用米非司酮處理人EC細(xì)胞HHUA，能夠明顯抑制細(xì)胞內(nèi)CDK4以及環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase，Cox-2)的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及裸鼠內(nèi)腫瘤的增長(zhǎng)，表明CDK4在EC的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要作用。

為進(jìn)一步研究CDK4基因在EC生物學(xué)過(guò)程中的可能作用，我們對(duì)轉(zhuǎn)染CDK4干擾片段的細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)行為檢測(cè)，比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。結(jié)果顯示，拮抗CDK4表達(dá)后，HEC-1B細(xì)胞的增殖能力明顯下降，細(xì)胞的周期分布發(fā)生改變，處于G1期細(xì)胞比例增加，而處于S期的細(xì)胞比例下降，細(xì)胞的凋亡比例增加。這與Tran等［11］的結(jié)果一致，他們證實(shí)青蒿素能夠通過(guò)抑制細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-kappaB，NF-κB)信號(hào)通路活性，抑制CDK4表達(dá)，從而誘導(dǎo)EC細(xì)胞Ishikawa細(xì)胞周期停滯，表明CDK4在EC細(xì)胞中擔(dān)當(dāng)原癌基因，抑制其表達(dá)能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)。同時(shí)這一生物學(xué)過(guò)程可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞中p-Rb表達(dá)相關(guān)，抑制CDK4表達(dá)，細(xì)胞中p-Rb表達(dá)下降，從而抑制下游與周期相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，抑制細(xì)胞中CDK4表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)p-Rb表達(dá)下降，但是總Rb表達(dá)并不受影響。

此外，本實(shí)驗(yàn)中體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，沉默CDK4基因表達(dá)可明顯降低EC細(xì)胞的體外侵襲能力，這可能是抑制了細(xì)胞中細(xì)絲蛋白A(filamin A，F(xiàn)LNa)的表達(dá)有關(guān)。Zhi等［12］的實(shí)驗(yàn)表明，抑制CDK4表達(dá)能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231中FLNa蛋白1459號(hào)位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化，抑制其表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。FLNa是一類小GTP蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白重塑、絲狀偽足以及包膜褶皺的形成［13］，這些都是細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲的重要步驟。因此，抑制其表達(dá)能夠明顯抑制上述生物學(xué)過(guò)程而抑制細(xì)胞的侵襲和遷移，但是CDK4在細(xì)胞中調(diào)節(jié)的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，運(yùn)用特異性的siRNA能夠有效地沉默CDK4基因在EC細(xì)胞中的表達(dá)，為研究其功能提供一個(gè)理想的技術(shù)平臺(tái)；沉默CDK4基因在EC細(xì)胞中的表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)G1期細(xì)胞停滯及凋亡，降低細(xì)胞的侵襲能力，這將為進(jìn)一步開(kāi)展EC的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。

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Effects of a small interfering RNA targeting CDK4 gene on the biological functions of endometrial cancer cells

CHANG Jun1, LIU Fang-ling1, ZHENG Shu-juan1, ZHANG Chan2(1.Department of Gynecology, the Sichuan Maternity and Child Health Hospital, Chengdu Sichuang 610045, China; 2.Department of Gynecology and Obstetrics, the Third People’s hospital of Chongqing Municipality, Chongqing 400014, China)

CHANG Jun E-mail: changjun505@126.com

Background and purpose:Cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) is a kind of protein kinases regulating the cell cycle progression, which has been reported to be overexpressed in endometrial carcinoma tissues. But the role of CDK4 in endometrial carcinogenesis and relative mechanisms has not been identi fi ed yet. In this study, we used a small interfering RNA targeting CDK4, and explored the effects of CDK4 on endometrial cancer cells HEC-1B biological function and relative mechanisms.Methods:The chemically synthesized small interfering RNA targeting CDK4 (si-CDK4) was transiently transfected into HEC-1B cells; the quantitative real time-PCR assays and Western blot assays were performed to explore the mRNA and protein expression levels of CDK4 and its downstream genes, Rb and p-Rb, in HEC-1B cells upon transfection; Moreover, the CCK-8, fl ow cytometry (FCM) and invasion assays were performed to indentify the effects of si-CDK4 on the proliferation, cell cycle distribution, apoptosis and invasion abilities of HEC-1B cells, respectively.Results:The results showed that the mRNA and protein expressions of CDK4 were suppressed in HEC-1B cells upon transfection with si-CDK4 (P＜0.01); Suppression of CDK4 inhibited cell proliferation and invasion of HEC-1B cells; the number of cells migrating through the transwell membrane in si-CDK4 group was 117±21, which was much fewer than the cells in si-control (269±39) and untreated groups (262±35) (P＜0.01); the early apoptosis rate of cells treated with si-CDK4 ［(21.7±3.5)%］was much higher than the untreated［(12.4±2.1)%］and si-control groups ［(11.8±1.9)%］(P＜0.01); moreover, suppression of CDK4 increased cells in G1phase (P＜0.01) and correspondingly decreased cells in S phase (P＜0.01); further Western blot results showed that suppression of CDK4 down-regulated the expression of p-Rb in cells, but did not in fl uence the expression of total Rb.Conclusion:CDK4-siRNA speci fi cally and ef fi ciently blocks the constitutively activated CDK4 in human endometrial cancer cells HEC-1B, resulting in tumor suppression.

Endometrial carcinoma; RNA interference; Cyclin-dependent kinase 4; Retinoblastoma

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.04.009

R737.33

A

1007-3639(2014)04-0292-07

2014-01-08

2014-03-05）

常軍 E-mail:changjun505@126.com