表面活性劑SDS輔助微波提取金佛手總黃酮工藝及抗氧化活性評價

趙麗麗，蔡露茜，葉競雄，馮 潔，趙玉玲,*

（1.浙江中鼎檢測技術(shù)有限公司，浙江 義烏 322000；2.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

表面活性劑SDS輔助微波提取金佛手總黃酮工藝及抗氧化活性評價

趙麗麗1，蔡露茜2，葉競雄2，馮 潔2，趙玉玲2,*

（1.浙江中鼎檢測技術(shù)有限公司，浙江 義烏 322000；2.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計，分別研究了表面活性劑十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）質(zhì)量分數(shù)、料液比、微波功率和微波時間對金佛手總黃酮提取量的影響。確定微波提取最佳工藝條件為表面活性劑SDS質(zhì)量分數(shù)0.6%、料液比1∶20（g/mL）、微波功率50 W、微波時間30 s，在此工藝條件下金佛手總黃酮提取量為18.706 0 mg/g。金佛手總黃酮對DPPH自由基和ABTS自由基清除率分別為79.15%和65.25%，其抗氧化活性略低于槲皮素。結(jié)果表明，金佛手總黃酮具有顯著抗氧化活性，可作為抗氧化劑應(yīng)用到食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。

金佛手總黃酮；表面活性劑SDS；微波提?。豢寡趸钚?/p>

佛手為蕓香科柑橘屬植物，主產(chǎn)于熱帶和亞熱帶，在我國浙江、福建、廣東、四川、云南等地均有栽培[1]?！敖鸱鹗帧笔侵府a(chǎn)于浙江金華的佛手。佛手主要化學(xué)成分為香豆素類和黃酮類[2-4]，具有舒肝和胃、行氣止痛、祛濕化痰等功效。黃酮類是指以黃酮（2-苯基-苯并-g-吡喃酮）為母體的一大類化合物，廣泛分布于植物界，是許多中草藥的有效成分。黃酮類化合物作為天然抗氧化劑中重要的一部分，其抗氧化方面的研究已經(jīng)有了很大的發(fā)展[5-10]。目前對金佛手的研究主要集中在化學(xué)成分、揮發(fā)油及佛手多糖等方面[11-12]，而對金佛手總黃酮的提取工藝及抗氧化活性評價則幾乎空白。

表面活性劑輔助微波提取植物中的總黃酮已見報道[13-15]，提取得到的總黃酮具有較強清除自由基的能力[16-18]，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上[19]，利用表面活性劑十二烷基磺酸鈉輔助微波提取金佛手中的總黃酮，采用單因素及正交試驗對提取條件進行優(yōu)化，并對其抗氧化活性進行了研究，旨在為金佛手的進一步開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

外觀如觀音手，色澤金黃油亮的成熟佛手鮮果，購自浙江金華花卉市場。

槲皮素標準品（純度＞98%） 中國食品藥品檢定研究院；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazolingsulfonic acid)，ABTS）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS） 美國Sigma公司；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、二氧化錳均為國產(chǎn)分析純；實驗用水為自動三重純水蒸餾器燒制蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

BS124S電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；Lambda25紫外-可見分光光度計 美國Perkin Elmer公司；KD23B-DA美的微波爐 佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司；R1001V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、DEF-300真空干燥箱 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Science-IID細胞破碎儀 上海京工實業(yè)有限公司；SZ-97A自動三重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 制樣

將新鮮金佛手削皮切小片，平鋪于托盤中，于53 ℃溫度條件下置于烘箱中放24 h。取出后，磨粉過60 目篩備用。

1.3.2 金佛手總黃酮的提取工藝

精密稱取金佛手粉1 g共9 份，按照一定料液比加入不同質(zhì)量分數(shù)SDS溶液浸泡24 h。在微波爐中進行提取，用真空泵抽提過濾，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮。濾液轉(zhuǎn)移入100 mL容量瓶，用體積分數(shù)60%乙醇溶液稀釋至刻度。

1.3.3 槲皮素標準溶液的配制

精密稱取槲皮素標準品0.050 0 g，用體積分數(shù)60%乙醇溶液溶解，在100 mL容量瓶中定容，搖勻，得到質(zhì)量濃度0.500 0 mg/mL的槲皮素標準液。

1.3.4 測定波長的選擇

分別取樣液和槲皮素標準液各10 mL于50 mL容量瓶中，用體積分數(shù)50%乙醇水溶液稀釋至約25 mL，加入1.4 mL亞硝酸鈉（質(zhì)量分數(shù)5%）搖勻，靜置6 min；然后加入1.4 mL硝酸鋁（質(zhì)量分數(shù)10%），搖勻，靜置6 min；最后加入10 mL氫氧化鈉（1 mol/L），然后補加50%乙醇溶液至刻度，靜置10 min。以50%乙醇溶液為空白參比，在紫外-可見分光光度計上掃描300～700 nm波長范圍內(nèi)的圖譜（圖1）。金佛手樣品液在250～350 nm波長范圍內(nèi)有最大吸收峰，槲皮素標準溶液在280～300 nm和320 nm左右波長處有吸收峰。黃酮類化合物具有羰基與兩芳香環(huán)形成的共軛體系，在紫外區(qū)產(chǎn)生特征吸收。故對提取樣品液選擇在吸收波長300 nm條件下定量測定。

圖1 槲皮素標準品（A）和金佛手樣液（B）的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of quercetin standard and flavonoids extracted from fingered citron

1.3.5 標準曲線及回歸方程的建立

分別取0、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mL槲皮素標準液于50 mL容量瓶中，按照1.3.4節(jié)的方法，以試劑做空白參比，紫外-可見分光光度計上測300 nm波長處吸光度，記錄數(shù)據(jù)。以槲皮素標準液質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.6 金佛手總黃酮提取量測定

分別取待測提取液各10 mL，按1.3.4節(jié)方法測定提取液的吸光度，根據(jù)標準曲線回歸方程及式（1）計算金佛手總黃酮提取量。

1.3.7 金佛手總黃酮提取的單因素試驗

1.3.7.1 SDS質(zhì)量分數(shù)對總黃酮提取量的影響

精密稱取金佛手粉1 g五份，以1∶15的料液比分別加入質(zhì)量分數(shù)為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的SDS溶液，浸泡24 h。微波功率50 W、微波時間50 s，過濾、定容，測定總黃酮提取量。

1.3.7.2 料液比對總黃酮提取量的影響

精密稱取金佛手粉1 g五份，以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的料液比加入質(zhì)量分數(shù)0.6%的SDS溶液，浸泡24 h。微波功率50 W、微波時間50 s，過濾、定容，測定總黃酮提取量。

1.3.7.3 微波功率對總黃酮提取量的影響

精密稱取金佛手粉1 g五份，以1∶15的料液比加入質(zhì)量分數(shù)0.6%的SDS溶液，浸泡24 h。微波功率分別為10、30、50、80、100 W，微波時間50 s，過濾、定容，測定總黃酮提取量。

1.3.7.4 微波時間對總黃酮提取量的影響

精密稱取金佛手粉1 g五份，以1∶15的料液比加入質(zhì)量分數(shù)0.6%的SDS溶液，浸泡24 h。微波功率50 W，微波時間分別為10、30、50、70、90 s，過濾、定容，測定總黃酮提取量。

1.3.8 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇SDS質(zhì)量分數(shù)、料液比、微波功率和微波時間4 個因素，按照正交試驗四因素三水平設(shè)計（表1），以金佛手中總黃酮提取量為指標，進行正交試驗。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.9 金佛手總黃酮抗氧化活性測定

1.3.9.1 金佛手總黃酮對DPPH自由基清除能力測定

佛手總黃酮清除自由基能力通過佛手黃酮與DPPH作用進行測定[20-21]。參照羅麗萍[22]的方法：準確配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液和質(zhì)量濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0 mg/L的金佛手黃酮溶液。比色管中準確量入2 mL DPPH溶液和2 mL金佛手黃酮溶液，25 ℃水浴中放置30 min，517 nm波長處測其吸光度。金佛手黃酮對DPPH自由基的清除率可用式（2）計算：

式中：Ai為2 mL金佛手黃酮溶液+2 mL DPPH溶液吸光度；Aj為2 mL金佛手黃酮溶液+2 mL 95%乙醇溶液吸光度；Ac為2 mL DPPH溶液+2 mL 95%乙醇溶液吸光度。

1.3.9.2 金佛手總黃酮對ABTS自由基清除能力的測定

黃酮類化合物的抗氧化活性測定采用ABTS方法[23]。具體步驟為：ABTS溶解在水中，最終濃度為7 mmol/L，加入適量的二氧化錳以產(chǎn)生ABTS自由基，含有ABTS自由基的溶液可在室溫下避光保存12 h以上，然后用針頭過濾器過濾，室溫下避光再保存6 h。ABTS自由基可在室溫下避光保存2 d以上。測定黃酮類化合物的抗氧化活性之前，先用乙醇稀釋ABTS自由基使之吸光度為0.70±0.02（25 ℃，734 nm波長處）。測試時，取1 mL稀釋ABTS自由基溶液加入到10 μL溶解在乙醇中的黃酮類化合物溶液中，2 min后記下吸光度。金佛手黃酮對ABTS自由基的清除率可用式（3）計算。

式中：Ai為10 μL金佛手黃酮溶液+1 mL ABTS溶液吸光度；Aj為10 μL金佛手黃酮溶液+1 mL 95%乙醇溶液吸光度；Ac為1 mL ABTS溶液+10 μL 95%乙醇溶液吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線方程

在0～0.20 mg/mL范圍內(nèi)，槲皮素質(zhì)量濃度與吸光度之間具有良好線性關(guān)系，線性相關(guān)性為0.999 8，線性回歸方程y=6.106 2x-0.010 3，其中x表示槲皮素質(zhì)量濃度，y表示300 nm波長處的吸光度。

2.2 金佛手總黃酮提取的單因素試驗

2.2.1 SDS質(zhì)量分數(shù)對金佛手總黃酮提取量的影響

圖2 SDS質(zhì)量分數(shù)對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of SDS concentration on the extraction efficiency of total flavonoids

由圖2可知，隨著SDS質(zhì)量分數(shù)的增加，金佛手總黃酮提取量逐漸增加，在SDS的質(zhì)量分數(shù)達到0.6%～0.8%時提取量達到最大值（平行測樣3 次），隨后，總黃酮提取量隨著SDS質(zhì)量分數(shù)增加而略有降低。其原因可能是隨著表面活性劑增加，溶液中膠束數(shù)量也在增加，從而增強了溶解能力，因此導(dǎo)致總黃酮提取量增加較快。由于金佛手中黃酮含量有限，因此當SDS質(zhì)量分數(shù)繼續(xù)增加時，則總黃酮提取量沒有增加?？紤]到經(jīng)濟性，選取SDS質(zhì)量分數(shù)為0.6%進行總黃酮的提取。

2.2.2 料液比對總黃酮提取量的影響

圖3 料液比對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction efficiency of total flavonoids

由圖3可知，最佳料液比是1∶20（g/mL）?？傸S酮提取量隨著液體含量的增加出現(xiàn)遞增的趨勢，但當料液比在1∶20之后時，提取量開始下降?？赡芤驗榻鸱鹗挚傸S酮中還存在棕櫚酸等水溶性物質(zhì)，若是溶液含水過少，則原料與溶液接觸面不夠，進而影響這部分黃酮類化合物的溶解及浸出。當液體含量過高時，溶劑吸收的能量增加，減少了金佛手原料對于能量的吸收而導(dǎo)致產(chǎn)率偏低，并且過多的溶劑會在后續(xù)的濃縮步驟中消耗過多的能量，因此選擇料液比1∶20進行黃酮的提取。

2.2.3 微波功率對總黃酮提取量的影響

圖4 微波功率對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of microwave power on the extraction yield of total flavonoids

由圖4可知，微波功率為30 W時的總黃酮提取量達到最大值。當微波功率大于30 W，提取量出現(xiàn)下降趨勢。其原因可能是隨著微波功率的升高，原材料破壁速度加快，黃酮溶出增加。但由于本研究使用的是普通微波爐，當微波功率增大時，一方面會有部分原料液損失，另一方面則是由于溫度過高會導(dǎo)致部分黃酮類化合物分解或者結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致總黃酮提取量降低。

2.2.4 微波時間對總黃酮提取量的影響

由圖5可知，最佳微波時間是50 s。微波時間越長，理論總黃酮提取量應(yīng)該越多，但是隨著微波時間的延長，提取容器中溫度的急劇上升也可能導(dǎo)致部分黃酮類化合物的損失。

圖5 微波時間對總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of microwave irradiation time on the extraction yield of total flavonoids

2.3 正交試驗

L9（34）正交試驗得到不同條件下佛手中總黃酮提取量及極差分析見表2，方差分析見表3。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

結(jié)果表明，4 種因素對金佛手總黃酮提取量的影響次序依次為：料液比（B）＞微波功率（D）＞SDS質(zhì)量分數(shù)（A）＞微波時間（C）。最佳工藝條件為：B3D1A1C2，即在SDS溶液質(zhì)量分數(shù)0.6%、料液比1∶20（g/mL）、微波爐中以30 W功率提取50 s的條件下，重復(fù)提取3 次，得到金佛手中總黃酮平均提取量為18.706 0 mg/g。

2.4 金佛手總黃酮抗氧化活性測定

2.4.1 金佛手總黃酮對DPPH自由基清除能力的測定

DPPH常用來篩選自由基清除劑以及評價物質(zhì)的抗氧化活性[24]。金佛手黃酮對DPPH自由基的清除作用如圖6所示。隨著金佛手黃酮及槲皮素質(zhì)量濃度的增加，對DPPH自由基清除率也在增加，在質(zhì)量濃度為20 mg/L時，清除率分別為79.15%和86.80%（有顯著性差異）。因此，金佛手黃酮對DPPH自由基具有良好的清除能力，清除效果略弱于槲皮素。

圖6 金佛手總黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical scavenging activity of total flavonoids from fingered citron

2.4.2 金佛手總黃酮對ABTS自由基清除能力的測定

生物樣品的總抗氧化能力通常用其對ABTS自由基的清除能力來表示。反應(yīng)中，ABTS首先經(jīng)過氧化生成穩(wěn)定的藍綠色ABTS水溶性自由基，待測物的加入可以使ABTS水溶性自由基的顏色減弱，其734 nm波長處的特征吸光度降低，根據(jù)吸光度的降低可以判斷待測物的總抗氧化能力[25]。金佛手總黃酮對ABTS自由基的清除能力如圖7所示。槲皮素和金佛手黃酮對ABTS自由基均有較強清除能力，且呈劑量依賴效應(yīng)，在質(zhì)量濃度為20 mg/L時，清除率分別為68.50%和65.25%（有顯著性差異）。由此可見，金佛手黃酮對ABTS自由基具有較強清除能力，清除效果略低于槲皮素。

圖7 金佛手總黃酮對ABTS自由基的清除作用Fig.7 ABTS radical scavenging activity of total flavonoids from fingered citron

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，表面活性劑輔助微波提取金佛手中總黃酮的最佳工藝條件為SDS質(zhì)量分數(shù)0.6%、料液比1∶20（g/mL）、微波功率30 W、微波時間50 s，在此條件下，金佛手中總黃酮提取量為18.706 0 mg/g，略低于已有研究[17]。分析可能是因為本研究中使用的是普通微波爐，無法對提取液進行長時間加熱，導(dǎo)致在提取過程中，提取液有所損失，總黃酮并無完全溶出；微波技術(shù)和超聲波技術(shù)的工作原理不同，也是導(dǎo)致SDS輔助微波提取金佛手中總黃酮得率較低的原因。對SDS輔助微波提取得到的金佛手總黃酮進行抗氧化活性檢測，發(fā)現(xiàn)金佛手黃酮具有較強的清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力，其抗氧化機理有待進一步研究。

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Microwave Extraction Assisted with the Surfactant Sodium Dodecyl Sulphate and Antioxidant Activity Evaluation of Total Flavonoids from Fingered Citron (Citrus medica var. sarcodactylis)

ZHAO Li-li1, CAI Lu-xi2, YE Jing-xiong2, FENG Jie2, ZHAO Yu-ling2,*
(1. Zhejiang Zhongding Detect Technology Co. Ltd., Yiwu 322000, China; 2. College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China)

In the present study, the impacts of SDS concentration, material-to-liquid ratio, microwave power, and irradiation time on the extraction of total flavonoids from the fruits of fingered citron (Citrus medica var. sarcodactylis) were explored by single factor and orthogonal array designs. Results indicated that the optimal extraction conditions were determined as follows: SDS concentration, 0.6%; material-to-liquid ratio, 1:20 (g/mL); microwave power, 50 W; and irradiation time, 30 s. The yield of total flavonoids under the optimized conditions was 18.706 0 mg/g. The total flavonoids scavenged 79.15% of DPPH radical and 65.25% of ABTS radical, showing a slightly weaker radical scavenging activity than quercetin. Therefore, the total flavonoids from fingered citron have potent antioxidant activity and can be used as antioxidants in the food and medicine fields.

total flavonoids from fingered citron; SDS; microwave extraction; antioxidant activity

R284.2

A

1002-6630（2014）18-0047-05

10.7506/spkx1002-6630-201418009

2014-01-03

浙江省自然科學(xué)基金項目（Q12C050001）；金華市科學(xué)技術(shù)研究計劃項目（2012-3-073）；浙江師范大學(xué)博士科研啟動基金項目（ZC304009077）；浙江師范大學(xué)開放實驗項目（72）

趙麗麗（1983—），女，工程師，碩士，研究方向為生化檢測。E-mail：zlili0307@163.com

*通信作者：趙玉玲（1977—），女，講師，博士，研究方向為生物無機化學(xué)。E-mail：yulingzhao@zjnu.cn