復(fù)方薄樟桉油溶液的氣相色譜指紋圖譜研究

李丹，涂明珠，鄢雷娜，趙雯

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

復(fù)方薄樟桉油溶液，為局部外用藥，主要用于頭痛、皮膚瘙癢、蚊叮等。主要成分為薄荷腦、桉葉油、薄荷素油和樟腦。薄荷腦具有消炎止癢、消腫止痛的等功效；桉葉油主要成分為桉油精，具有抑菌、抗炎、松弛平滑肌等作用［1-4］；薄荷素油主要成分為薄荷腦、薄荷酮、胡薄荷酮、異薄荷酮等，具有清涼止癢、利膽、抗炎、抑菌、促透皮吸收等多種作用［5-8］；樟腦具有通竅、殺蟲、止痛等功效［9］。該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)》第12 冊(cè)［10］中，包括鑒別，檢查項(xiàng)和揮發(fā)油測(cè)定，檢驗(yàn)項(xiàng)目相對(duì)單一，缺乏專屬性，不能有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

復(fù)方薄樟桉油溶液組成復(fù)雜，其主成分薄荷素油功效成分較多，采用多成分質(zhì)量控制的方法能較全面評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量?！吨袊幍洹?020 年版［11］一部中采用指紋圖譜法對(duì)薄荷素油進(jìn)行質(zhì)量控制。谷俊峰等［12］建立了薄荷素油的氣相指紋圖譜法，以環(huán)己酮為參照物，標(biāo)定了14 個(gè)共有峰。陸繼偉等［13］建立了薄荷素油的氣相指紋圖譜法，以薄荷腦、薄荷酮、桉油精為參照物，對(duì)全譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，并采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀對(duì)峰進(jìn)行歸屬。陳在敏［14］采用特征圖譜結(jié)合多組分含量測(cè)定法對(duì)薄荷素油進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以薄荷酮為參照物，對(duì)11 個(gè)共有峰進(jìn)行相對(duì)特征圖譜鑒別，并對(duì)其中主要的6 個(gè)成分a-蒎烯、檸檬烯、薄荷醇等進(jìn)行含量測(cè)定。本研究建立了復(fù)方薄樟桉油溶液的氣相色譜指紋圖譜方法，并采用對(duì)照物質(zhì)對(duì)各個(gè)成分進(jìn)行歸屬，為復(fù)方薄樟桉油溶液的質(zhì)量控制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

7890A 型氣相色譜儀（FID 檢測(cè)器）（安捷倫科技有限公司）；儀器Nexis GC-2030 型氣相色譜儀（FID 檢測(cè)器）（島津公司）；HP-FFAP 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、DB-FFAP 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）；BT25S 型十萬分之一電子天平（賽多利斯）；ML204T 型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 材料

薄荷腦（含量以100.0%計(jì)，100 mg/支；批號(hào)：110728-201701，中國食品藥品檢定研究院）；（-）-薄荷酮（含量以98.5%計(jì)，0.2 mL/支，批號(hào)111705-201906，中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇（分析純，批號(hào)：202206301，上海振興化工一廠）；9 批復(fù)方薄樟桉油溶液樣品分別由海中華藥業(yè)南通有限公司、上海云峰藥業(yè)有限公司提供，詳見表1。

表1 9批樣品的詳細(xì)信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱HP-FFAP 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm× 0.25 μm），初始溫度60 ℃，保持4 min，以8 ℃/min的速率上升至140 ℃，保持4 min，再以6 ℃/min的速率上升至220 ℃，保持5 min。FID 檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃；氮?dú)庾鳛檩d氣，流速1 mL/min，直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1，詳見色譜圖1。

圖1 參照物溶液與供試品溶液的氣相色譜圖：A.混合參照物溶液；B.供試品溶液（處方1）；C.供試品溶液（處方2）

2.2 參照物溶液的制備

精密稱取薄荷腦對(duì)照品35.99 mg、（-）-薄荷酮對(duì)照品25.06 mg，置50 mL 容量中，加無水乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合參照物溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品約0.5 g（處方1）或0.4 g（處方2），精密稱定，置100 mL 量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 重復(fù)性考察

按“2.3”項(xiàng)供試品制備方法制備樣品6 份（上海中華藥業(yè)南通有限公司，批號(hào)：160222A），按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以薄荷腦為參照物，計(jì)算14 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果共有峰的相對(duì)峰面積RSD 均小于0.7%，相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.1%；經(jīng)相似度軟件計(jì)算，指紋圖譜的相似度為 0.999，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性考察

按“2.3”項(xiàng)供試品制備方法制備樣品（上海中華藥業(yè)南通有限公司，批號(hào)：160222A），于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以薄荷腦為參照物，計(jì)算共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果共有峰的相對(duì)峰面積RSD 均小于1.3%，相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.1%；經(jīng)中藥色譜指紋相似度計(jì)算軟件計(jì)算，指紋圖譜的相似度為0.999，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.6 耐用性考察

為考察本方法的耐用性的影響，按“2.3”項(xiàng)供試品制備方法制備樣品（上海中華藥業(yè)南通有限公司，批號(hào)：160222A），比較了不同品牌的儀器（Agilent 7890A 氣相色譜儀和島津GC-2030 型氣相色譜儀），不同膜厚的色譜柱（HP-FFAP：30 m×0.32 mm× 0.25 μm 和DB-FFAP：30 m×0.32 mm×0.5 μm），不同的分析人員，不同分析時(shí)間。結(jié)果經(jīng)相似度軟件計(jì)算，由不同的分析人員在不同品牌儀器、不同分析時(shí)間、不同膜厚的色譜柱上測(cè)得的相似度大于0.950。表明本方法的耐用性符合要求。

2.7 樣品測(cè)定及色譜峰歸屬

2.7.1 對(duì)照指紋圖譜的建立及色譜峰歸屬取9 批樣品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件與“2.3”項(xiàng)供試品溶液的制備方法測(cè)定，記錄色譜圖，將9 批次樣品的色譜圖的AIA 格式導(dǎo)入到國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”（簡稱相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)）中，扣除溶劑峰，剪切色譜保留時(shí)間前5 min，時(shí)間窗為0.1，以平均數(shù)為指標(biāo)，選用多點(diǎn)校正法對(duì)色譜峰進(jìn)行Mark 峰匹配，建立了復(fù)方薄樟桉油溶液指紋圖譜對(duì)照指紋圖譜，標(biāo)定了14 個(gè)共有峰見圖2。通過與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)了峰1、2、3、5、7、11、12、13、14 分別為β-蒎烯、檸檬烯、桉油精、（-）-薄荷酮、樟腦、薄荷腦、胡薄荷酮、桂皮醛、丁香酚；其余共有峰再與缺桉葉油的陰性、缺薄荷素油的陰性、桉葉油對(duì)照提取物以及薄荷素油對(duì)照提取物比對(duì)，峰4 歸屬于桉葉油，峰6、8、10 均歸屬于薄荷素油。

圖2 復(fù)方薄樟桉油溶液的對(duì)照指紋圖譜

2.7.2 樣品測(cè)定結(jié)果與分析將9 批復(fù)方薄樟桉油溶液樣品的色譜圖AIA 格式導(dǎo)入到相似度軟件中，剪切保留時(shí)間前5 min，進(jìn)行疊加，疊加圖見圖3，計(jì)算相似度，指紋圖譜相似度為 0.956～0.997 之間，復(fù)方薄樟桉油溶液樣品間的相似較高，均達(dá)到0.95，符合規(guī)定（見表2）。

圖3 9批樣品的GC指紋色譜圖疊加圖

表2 9批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

3.1 氣相色譜柱的選擇

本研究還考察了比較了DB-624（60 m×0.32 mm× 1.8 μm）、HP-INNOWAX（60 m×0.32 mm×0.5 μm）、DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）3 種不同型號(hào)的毛細(xì)管柱，均出現(xiàn)樟腦與薄荷酮兩個(gè)組分分離效果不佳的情況。

3.2 樣品測(cè)得結(jié)果比較

兩個(gè)廠家樣品中各組分的處方量不同：上海中華藥業(yè)南通有限公司按處方1 生產(chǎn)，上海中華藥業(yè)南通有限公司按處方2 生產(chǎn)，但兩個(gè)企業(yè)的9 批樣品的相似度均大于0.95，并沒有反映差異。分析原因可能與桉油精、薄荷腦、樟腦的特征峰權(quán)重太大有關(guān)，掩蓋了其他小的特征峰的差異，可以考慮只對(duì)峰3（桉油精）、峰7（樟腦）、峰11（薄荷腦）的相對(duì)峰面積進(jìn)行控制，其他的共有峰采用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定性。

3.3 參照物的選擇

本方法考慮到處方中既添加了薄荷腦又添加了薄荷素油，故選薄荷腦、（-）-薄荷酮兩個(gè)參照物。以薄荷腦為參照物是考慮到其位于色譜圖的中間位置，可以同時(shí)兼顧前、后兩個(gè)時(shí)間段，且峰面積與總峰面積占的30%左右，峰面積大，誤差小。以薄荷素油的特征性成分（-）-薄荷酮為參照物，提高了薄荷素油檢測(cè)的專屬性。