水通道蛋白在大鼠前列腺的表達及意義

裴利軍，姜 睿，粟宏偉，鄧青富，楊海帆，程 勇，朱永生

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科，四川 瀘州646000）

前列腺是男性重要的附屬性腺器官，其發(fā)生、發(fā)育及分泌功能均受雄激素的調(diào)控［1，2］。前列腺液約占精液的20%～40%［3］，性腺機能減退及老年相關(guān)性男性不育與前列腺液的分泌減少及理化性質(zhì)改變有關(guān)［4］。良性前列腺增生和前列腺癌等前列腺疾病的發(fā)生、發(fā)展均與雄激素關(guān)系密切。迄今為止，雄激素在生理和病理條件下對前列腺生長發(fā)育及分泌的調(diào)控機制仍未完全闡明。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一個膜通道蛋白家族，可促進水和小分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運，廣泛存在于人體各種組織器官，對于維持細胞內(nèi)外水平衡及細胞分泌功能具有重要作用［5］。本文通過免疫組化和免疫印跡方法研究AQP1、3和4在大鼠前列腺的表達，以及雄激素對其表達的影響，探討AQPs在前列腺中的功能，為研究前列腺疾病的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與分組及去勢大鼠模型制備 健康雄性8周齡SD大鼠30只，體重280～300g，由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～25℃，12h光照，晝夜交替，正常飲食，自由飲水，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為3組：A組（對照組，n＝10）、B組（去勢組，n＝10）、C組（去勢＋睪酮替代組，n＝10）。1%戊巴比妥鈉30mg／kg腹腔注射麻醉，取下腹正中切口，A組只切開腹腔，不切除睪丸，B組和C組均切除雙側(cè)睪丸。術(shù)后第二天開始，C組給予丙酸睪丸酮5mg／kg皮下注射，1次／d，對照組和去勢組給予等量生理鹽水注射，2周后尾靜脈取血測定血睪酮濃度。

1．2 主要試劑與儀器 兔抗大鼠 AQP1、AQP3、AQP4多克隆抗體均購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，ECL化學發(fā)光液購自美國Millipore公司，丙酸睪丸酮購自美國Sigma公司。RM6280c型多通道生理信號采集處理系統(tǒng)為成都儀器廠生產(chǎn)，電泳槽和蛋白成像儀為美國Bio－Rad公司生產(chǎn)。

1．3 前列腺液的收集與標本制備 前列腺液的收集采用Knee RA［6］所描述的方法。1%戊巴比妥鈉麻醉后，取下腹正中切口，顯露前列腺后外側(cè)盆神經(jīng)，連接RM6280c型多通道生理信號采集處理系統(tǒng)電極，調(diào)整參數(shù)為波幅0．8ms、頻率16Hz、電壓8～12v，給予持續(xù)脈沖式電刺激，可見大鼠陰莖充血并緩慢勃起，直到前列腺液噴出。為避免尿液污染前列腺液，電刺激前先用注射器抽空膀胱內(nèi)尿液。收集前列腺液并稱重，切取腹側(cè)前列腺，剔除周圍結(jié)締組織，稱前列腺濕重并計算前列腺與體重比值，切除的標本－70℃保存。

1．4 免疫組化檢測AQP1、3、4在大鼠前列腺的表達免疫組化采用SP法。4%多聚甲醛固定標本，常規(guī)石蠟包埋，4μm 連續(xù)切片，梯度酒精脫蠟至水，10mmol／L檸檬酸緩沖液（pH 6．0）微波修復抗原3min，室溫冷卻，PBS漂洗，滴加1%BSA，室溫封閉2h，棄封閉液，滴加兔抗大鼠 AQP1（1∶100）、AQP3（1∶100）、AQP4（1∶100）抗體，置于濕盒內(nèi)4℃過夜，PBS漂洗3次×5min，滴加0．3%H2O2，室溫15min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗3次×5min，滴加辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，室溫孵育15min，PBS漂洗3次×5min，DAB顯色，光學顯微鏡下觀察染色強度，蘇木素復染，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。

1．5 免疫印跡檢測大鼠前列腺AQP1、3、4的表達標本剪碎液氮中研磨，加入預冷的組織裂解液（每1ml裂解液含磷酸酶抑制劑10μl，蛋白酶抑制劑5μl，100mmol／L PMSF 5？l），12000×g 4℃離心5min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，加5×上樣緩沖液，100℃沸水中變性5min，自然冷卻。以40？g蛋白上樣，12%SDS－PAGE分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到0．2μm孔徑PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加兔抗大鼠 AQP1（1∶1000）、AQP3（1∶1000）、AQP4（1∶2000）多克隆抗體孵育，4℃過夜，TBST洗膜3次×10min，加辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（1∶5000）室溫孵育1h，TBST洗膜3次×10min，滴加ECL化學發(fā)光液，Bio－Rad蛋白成像儀顯像。條帶灰度值采用Quantity One4．6．2軟件分析，以β－actin作為內(nèi)參。

1．6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠生理指標比較 B組大鼠血睪酮水平［（13．07±1．83）nmol／L］較 A 組［（92．37±16．23）nmol／L］顯著減低（P＜0．05），C組血睪酮［（88．09±13．24）nmol／L］與A組比較無統(tǒng)計學差異。B組前列腺液重量［（1．14±0．4）mg］較 A 組［（13．57±2．72）mg］顯著降低（P＜0．05），C組前列腺液重量［（14．43±2．87）mg］與A組比較無顯著差異。B組前列腺與體重比值（0．27±0．12）較 A 組（1．91±0．07）顯著降低（P＜0．05），C組前列腺與體重比值（1．85±0．10）與A組比較無顯著差異，見表1。

表1 各組生理指標比較（±s）Table 1 Comparison of physiological index in each group

表1 各組生理指標比較（±s）Table 1 Comparison of physiological index in each group

注：與A組比較，①P＜0．05

Group n Serum Level of testosterone（nmol／L）Weight of prostate fluid（mg）Ratio between prostate and body weight（mg／g×100%）A 10 92．37±16．23 13．57±2．72 1．91±0．07 B 10 13．07±1．83① 1．14±0．14① 0．27±0．12①C 10 88．09±13．24 14．43±2．87 1．85±0．10

2．2 AQP1、3和4在大鼠前列腺的表達定位 免疫組化結(jié)果顯示，AQP1主要在大鼠前列腺間質(zhì)的小動脈、小靜脈壁表達，在前列腺腺泡上皮未見表達，見圖1。AQP3主要在前列腺腺泡上皮細胞膜表達，見圖2。AQP4則更多的在腺泡上皮靠近基底膜處表達，見圖3。形態(tài)學觀察可見B組前列腺的間質(zhì)出現(xiàn)萎縮，腺上皮層變薄。

圖1 AQP1在各組大鼠前列腺的表達（免疫組化×400）Figure 1 Expression of AQP1in prostate of each group （immunohistochemistry×400）

圖2 AQP3在各組大鼠前列腺的表達（免疫組化×400）Figure 2 Expression of AQP3in prostate of each group（immunohistochemistry×400）

圖3 AQP4在各組大鼠前列腺的表達（免疫組化×400）Figure 3 Expression of AQP4in prostate of each group（immunohistochemistry×400）

2．3 AQP1、3、4在大鼠前列腺的表達定量分析 免疫印跡結(jié)果顯示，B組AQP1蛋白表達較A組顯著降低（P＜0．05），C組與 A組比較無統(tǒng)計學差異，B組AQP3的表達較A組顯著降低（P＜0．05），C組與A組無統(tǒng)計學差異，各組中AQP4的表達無明顯變化（圖4），蛋白表達的相對灰度值，見表2。

3 討論

水的跨細胞膜轉(zhuǎn)運是維持細胞賴以生存的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，近年研究顯示，大量水的跨細胞膜轉(zhuǎn)運依靠AQPs。迄今為止發(fā)現(xiàn)并成功克隆了13個水通道蛋白亞型，AQP0～12。其中AQP0、1、2、4、5、6和8對水具有通透性，AQP3、7、9和10對水和甘油具有通透性，AQP11和12具有與其它AQP亞型不同的原始結(jié)構(gòu)［7～9］。AQPs廣泛分布于人體多種組織器官中，特別是分泌功能旺盛的器官，在生理和多種病理情況下，AQPs均具有重要功能。據(jù)報道，在人類腎臟集合管上皮細胞AQP2表達較豐富，可促進腎小管對水的重吸收，在尿液濃縮過程中起重要作用［10］。AQP3基因敲除后的裸鼠，其皮膚表皮的水合作用明顯減低［11］，AQPs可引起顱腦損傷后腦水腫的發(fā) 生［12］。Park［13］發(fā) 現(xiàn) 在 雌 性 大 鼠 的 陰 道 壁 存 在AQP1、2及3的表達，AQP1主要在陰道粘膜下層的毛細血管和小靜脈壁表達，AQP2、3主要在陰道粘膜上皮細胞表達，大鼠性喚起時AQP1、2的表達由細胞器膜向細胞膜轉(zhuǎn)移，表明AQP1、2在大鼠性喚起時可從陰道粘膜下小血管中轉(zhuǎn)運大量液體到陰道，從而引起陰道潤滑，并提出AQP2的表達受雌激素的調(diào)控。另有報道，高血糖可誘導雌性大鼠陰道壁中AQP1、2、3的低表達，是引起糖尿病大鼠陰道潤滑下降的主要原因［14，15］。

表2 AQP1、3和4在各組前列腺的表達（與β－actin的相對灰度值，±s）Table 2 Expression of AQP1，3and 4in prostate of each group

表2 AQP1、3和4在各組前列腺的表達（與β－actin的相對灰度值，±s）Table 2 Expression of AQP1，3and 4in prostate of each group

注：與A組比較，①P＜0．05

Group n Relative greyvalue AQP1 AQP3 AP4 A 10 119．83±23．67 122．6±23．10 108．92±9．87 B 10 41．12±10．09① 71．8±10．08① 100．31±23．76 C 10 109．72±14．83 124．78±13．54 113．68±17．02

圖4 免疫印跡檢測AQP1、AQP3和AQP4在大鼠前列腺的表達Figure 4 Expression of AQP1，AQP3and AQP4in prostate of rats by Western Blotting

隨著對AQPs研究的深入，發(fā)現(xiàn)在男性生殖道中有多種AQP亞型的表達，其表達部位和功能具有組織特異性。例如在人類輸精管上皮細胞膜的刷狀緣可見AQP1，2的表達。含有精子的睪丸液和附睪液從附睪管輸出后，近50%～90%的液體成分在輸精管中重吸收，從而使精子濃度急劇升高，推測AQP1、2參與了輸精管液體重吸收過程中［16，17］。AQP1在小鼠輸精管、精囊腺和前列腺中均有表達［18］，在人類精囊腺內(nèi)皮細胞和前列腺毛細血管內(nèi)皮細胞也可檢測到AQP1的表達，但在附睪組織中未見表達，表明AQP1可能參與了精囊液和前列腺液的分泌［19］。Wang［20］等發(fā)現(xiàn)在人類前列腺腺泡基底膜及中間層細胞中AQP3大量表達，這也是具有分泌功能的柱狀細胞含量最多的部位，而在間質(zhì)細胞無表達，表明AQP3也可能參與前列腺分泌功能。AQP9在人和大鼠附睪輸出管和輸精管上皮細胞腔面細胞膜表達豐富，有利于對輸精管內(nèi)液體成分的重吸收，增加精子濃度，同時也表達在前列腺上皮細胞膜，參與前列腺液的分泌，但在精囊腺中無表達，雄激素可誘導AQP9在前列腺的高表達［21］。這些研究表明AQPs在男性生殖道及附屬性腺中液體的重吸收和分泌具有重要作用。

4 結(jié)論

在大鼠前列腺中，AQP1、3和4均有表達，免疫組化顯示AQP1主要在前列腺間質(zhì)的小動脈和小靜脈壁表達，而在具有分泌功能的前列腺腺泡上皮細胞未見表達，去勢大鼠前列腺間質(zhì)及上皮細胞出現(xiàn)不同程度萎縮，重量顯著減少，免疫印跡檢測AQP1表達顯著降低，推測AQP1可能與前列腺細胞代謝和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān)，對前列腺的生長發(fā)育，維持正常的結(jié)構(gòu)具有重要作用。AQP3、4均在前列腺腺泡上皮豐富表達，但AQP3主要在上皮細胞膜表達，而AQP4更多地表達在靠近基底膜的腺上皮，AQP3、4可能均與前列腺分泌功能有關(guān)。去勢大鼠前列腺液分泌顯著減少，免疫印跡顯示AQP3表達顯著降低，而AQP4的表達未受影響，表明雄激素降低后前列腺液分泌減少與AQP3的表達降低有關(guān)，與AQP4無關(guān)。

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