感染對(duì)糖尿病大鼠病理狀態(tài)的影響＊

王彥江，謝席勝，馮勝剛，龍瓊先

（川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院 1．腎內(nèi)科，2．病理科，四川 南充637000）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一。然而其發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明。因此，建立理想的DM實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究DKD發(fā)病及防治機(jī)制的重要手段。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DM大鼠常常發(fā)生感染，并且DM模型大鼠的腎臟病變?cè)谔蕹腥厩昂蟠嬖诓町悾F(xiàn)將我們的研究報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠100只，8周齡，體重（200±20）g，購(gòu)自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（川）2008－1B。適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，12h晝夜交替，自由進(jìn)水進(jìn)食。動(dòng)物室溫度控制在21℃～25℃，濕度控制在65%～69%。

1．2 實(shí)驗(yàn)試劑 廣衡電子計(jì)重秤（廣衡電子衡器有限公司生產(chǎn)），編號(hào)：粵制00000547，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；大鼠代謝籠（北京萊爾凈化設(shè)備有限公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司，美國(guó)），規(guī)格：1g／瓶（滅菌裝），2～8℃保存，購(gòu)自北京市博愛(ài)港商貿(mào)有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉，購(gòu)自北京市博愛(ài)港商貿(mào)有限公司；三諾安穩(wěn)血糖儀以及三諾安慰血糖試紙（長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司）；75%消毒酒精；高爾寶目測(cè)尿糖試紙（廣州市花都高爾寶生物技術(shù)有限公司）；肌酐試劑盒、尿素氮試劑盒（上?？迫A生物工程股份有限公司）；HITACHI全自動(dòng)生化分析儀（日立儀器（蘇州）有限公司）：儀器型號(hào)：7600－010，由南充市中心醫(yī)院提供。全自動(dòng)尿液干化學(xué)分析儀（日本京都），儀器型號(hào)：AX－4280由南充市中心醫(yī)院提供。HM315輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（廣州市炳陽(yáng)生物科技有限公司）：型號(hào)：HM315，由南充市中心醫(yī)院病理科提供；BMJ－A型包埋機(jī)及病理組織包埋冷卻臺(tái)（常州市中威電子儀器有限公司）：型號(hào)：BMJ－A型，由南充市中心醫(yī)院病理科提供。

2 實(shí)驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)方法

2．1 實(shí)驗(yàn)分組及造模 雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（10只）和實(shí)驗(yàn)組（90只）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，造模前將大鼠禁食 12h［2］，將 STZ 用 0．01mmol／L、PH為4．5的檸檬酸鈉緩沖液配成1%的濃度，以65mg／kg體質(zhì)量行一次性腹腔注射［1］，正常對(duì)照組則注射等量的檸檬酸鹽緩沖液腹腔注射。DM造模標(biāo)準(zhǔn)［2］：72小時(shí)后檢測(cè)空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），以FBG≥16．7mmol的大鼠視為造模成功。根據(jù)造模標(biāo)準(zhǔn)，從實(shí)驗(yàn)組篩選出DM模型大鼠。通過(guò)對(duì)腎臟、肺臟的解剖發(fā)現(xiàn)以及小便常規(guī)是否存在著尿路感染等指標(biāo)判定大鼠是否有感染的發(fā)生。以此，在隨后的實(shí)驗(yàn)研究中，將感染大鼠排除在外。

2．2 指標(biāo)檢測(cè)及方法

2．2．1 一般情況 觀(guān)察各組大鼠的一般狀況，如進(jìn)食、飲水量、小便量，色以及氣味等。

2．2．2 生化指標(biāo)檢測(cè) 采用血糖儀及配套血糖試紙進(jìn)行血糖監(jiān)測(cè)，檢測(cè)前禁食8小時(shí)，各組大鼠經(jīng)剪尾尖放血法檢測(cè)FPG；采用肌氨酸氧化酶法和紫外－谷氨酸脫氫酶法檢測(cè)分別測(cè)定血清肌酐及尿素氮指標(biāo)；采用尿糖試紙對(duì)尿糖水平進(jìn)行半定量檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束前24小時(shí)，將大鼠放入代謝籠中，收集各組大鼠尿液，記錄尿量并送至我院檢驗(yàn)科做尿常規(guī)及24小時(shí)尿蛋白定量檢測(cè)。

2．2．3 腎臟肥大指數(shù)（kidney hypertrophy index，KHI） 全部大鼠摘取左腎，用分析天平稱(chēng)重，計(jì)算KHI，KHI＝［腎重（g）／體重（g）］×1000‰。

2．2．4 普通光學(xué)顯微鏡觀(guān)察 采用3%的戊巴比妥鈉，按0．1ml／100g體質(zhì)量腹腔注射麻醉后，處死大鼠。收取各組大鼠的腎臟及肺臟標(biāo)本，將腎臟稱(chēng)重后去除包膜。此時(shí)，將肺臟以及去除包膜的腎臟浸泡于10%中性甲醛溶液，固定12小時(shí)，作常規(guī)石蠟包埋組織塊，5μm超薄切片，腎臟、肺臟行HE染色，光鏡下觀(guān)察腎臟、肺臟的病理改變。每張片子隨機(jī)選取20個(gè)腎小球，每個(gè)腎小球按標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分，然后取20個(gè)記分的均值作為該片腎小球系膜增生分級(jí)數(shù)。0級(jí)：正常腎小球（記0分）；Ⅰ 級(jí)：增生的系膜組織對(duì)腎小球毛細(xì)血管袢無(wú)明顯影響，系膜增生寬度小于毛細(xì)血管直徑，呈節(jié)段性分布（記2分）；Ⅱ級(jí)：增生的系膜組織對(duì)腎小球毛細(xì)血管袢有一定的壓迫和破壞作用，系膜增生寬度大于毛細(xì)血管直徑，呈彌漫性分布（記4分）；Ⅲ級(jí)：增生的系膜組織對(duì)腎小球毛細(xì)血袢有一定的壓迫和破壞作用，系膜增生呈結(jié)節(jié)狀或團(tuán)塊狀，彌漫性分布且階段性加重［3］。采用 WinROOF圖像處理軟件（MitaniCorp．）評(píng)估小管間質(zhì)的損害程度［4］，每張切片選取10個(gè)視野，計(jì)算皮質(zhì)部每一視野中小管擴(kuò)張、間質(zhì)浸潤(rùn)以及纖維化區(qū)域所占的百分率。得分情況為0～5分：0，正常間質(zhì)；1，＜10%的區(qū)域損傷；2，11%～25%的區(qū)域損傷；3，26%～50%的區(qū)域損傷；51%～75%的區(qū)域損傷；＞76%的區(qū)域損傷。

2．3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，計(jì)量資料以表示，兩組之間的均值比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0．05，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 各組大鼠一般情況 腹腔注射STZ誘導(dǎo)后，正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，反應(yīng)靈敏，毛色光滑；DM組大鼠毛色粗糙，精神較差，反應(yīng)較遲鈍，活動(dòng)差，脊柱呈弓背樣彎曲。并且，DM組大鼠尿液的泡沫較多，酸臭味更加明顯。正常對(duì)照組大鼠無(wú)感染的發(fā)生，DM組大鼠感染的發(fā)生率為35．7%，并且DM組大鼠常常合并多種感染發(fā)生，其中有2只為尿路感染合并腎膿腫及肺部感染，有3只為單純性尿路感染，有6只為單純性腎膿腫，有1只為單純性肺部感染。DM模型中感染大鼠的死亡率為80%。如圖1所示，正常對(duì)照組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜分布正常，毛細(xì)血管腔開(kāi)放，肺間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。發(fā)生肺部感染的DM大鼠的肺臟表現(xiàn)為嚴(yán)重的肺水腫，病理表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜明顯增厚，肺泡間隔增寬，間質(zhì)中膠原和彈性蛋白含量增多，部分肺泡腔萎縮甚至塌陷，部分肺泡腔內(nèi)有多量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)片狀壞死。發(fā)生尿路感染大鼠的尿常規(guī)表現(xiàn)為較高的紅細(xì)胞及白細(xì)胞水平，腎臟病理中可見(jiàn)大量的炎癥細(xì)胞中浸潤(rùn)，膿腫及壞死形成等。解剖時(shí)也發(fā)現(xiàn)，發(fā)生尿路感染的大鼠腎臟與周?chē)M織界限模糊，有膿腔存在等。與正常對(duì)照組相比，DM組大鼠的進(jìn)食量、尿量以及飲水量均顯著增加；然而，與剔除感染前相比，剔除后的DM組大鼠的進(jìn)食量較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），結(jié)果見(jiàn)表1。

3．2 各組大鼠血糖情況 與正常對(duì)照組相比，DM組大鼠的FPG水平顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）；與剔除感染前相比，剔除后DM組大鼠的FPG水平稍低，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），見(jiàn)表2。

3．3 各組大鼠體重、腎功情況 與正常對(duì)照組相比，DM組大鼠的體重水平較低，而KHI較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與剔除感染前組相比，剔除感染后DM組大鼠的KHI較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與正常對(duì)照組相比，DM組大鼠的肌酐和尿素氮水平均較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與剔除感染前組相比，剔除感染后DM組大鼠的肌酐及尿素氮水平較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

表1 剔除感染前后各組大鼠的一般情況Table 1 General situation of rats of all groups before and after the removal of infection

圖1 各組大鼠的肺臟及病理Figure 1 Lungs and pathology of rats of groups

表2 剔除感染前后各組大鼠的FPG及尿糖水平Table 2 Level of FPG and urinary glucose in rats of all groups before and after the removal of infection

3．4 各組大鼠尿常規(guī)及24小時(shí)尿蛋白定量 與對(duì)照組相比，DM組大鼠尿常規(guī)中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞水平以及24小時(shí)尿蛋白定量均顯著增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）；與剔除感染前組相比，剔除感染后DM組大鼠尿常規(guī)中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞水平較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。與剔除感染前相比，剔除感染后DM組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量水平較低，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 A 剔除感染前后各組大鼠的體重及KHI水平Figure 2A Level of Weight and KHI in rats of all groups before and after the removal of infection

圖2 B 剔除感染前后各組大鼠的腎功水平Figure 2B Level of renal function in rats of all groups before and after the removal of infection

表3 剔除感染前后各組大鼠的尿常規(guī)及24小時(shí)尿蛋白定量情況Table 3 Urine routine and 24－h(huán)our urinary protein excretion in rats of all groups before and after the removal of infection

3．5 各組大鼠的腎臟病理情況 解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組及DM非感染大鼠的腎臟與周?chē)M織的解剖層次結(jié)構(gòu)清晰，易于分離。DM感染大鼠的腎臟體積明顯增大，腎臟與周?chē)M織廣泛粘連，表面凹凸不平，呈顆粒狀，切開(kāi)時(shí)發(fā)現(xiàn)腎臟上下極常存在單個(gè)或多個(gè)膿腔，內(nèi)含乳白色液體，見(jiàn)圖3。正常對(duì)照組的腎組織病理未見(jiàn)明顯病變；DM非感染大鼠腎病理：系膜基質(zhì)輕度增生，可見(jiàn)少許腎小管上皮細(xì)胞空泡變性；然而，同期的DM感染大鼠腎病理表現(xiàn)為系膜基質(zhì)中度增生，Cap袢開(kāi)放尚可，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性及壞死，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，伴出血壞死以及膿腫形成（圖4）。與正常對(duì)照組相比，DM組大鼠腎臟的系膜增生程度以及小管間質(zhì)損害程度均較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。同時(shí)，與剔除感染前組相比，剔除感染后DM組大鼠的腎臟系膜增生程度評(píng)分以及小管間質(zhì)損害程度評(píng)分均較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

DM患者由于存在血糖升高、蛋白質(zhì)代謝紊亂、免疫功能低下以及機(jī)體抵抗力降低等諸多因素，因此DM患者極易發(fā)生各種感染。DM合并感染的發(fā)生率為32．7%～90．5%［5］，其中泌尿系統(tǒng)感染占36．1%，呼吸系統(tǒng)感染占24．6%，其次為皮膚及軟組織感染，

表4 剔除感染前后各組大鼠腎臟的病理評(píng)分Table 4 Renal pathological score of rats of all groups before and after the removal of infection

胃腸道及其他感染等［6］。在我們的研究中，DM組大鼠感染的發(fā)生率為35．7%，并且DM組大鼠常常合并多種感染發(fā)生，其中有2只為尿路感染合并腎膿腫及肺部感染，有3只為單純性尿路感染，有6只為單純性腎膿腫，有1只為單純性肺部感染，而正常對(duì)照組則無(wú)感染的發(fā)生。DM模型中感染大鼠的死亡率為80%。發(fā)生肺臟感染的大鼠表現(xiàn)為肺臟的極度水腫，肺病理也表現(xiàn)為大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膿腫及壞死形成等。發(fā)生尿路感染的大鼠表現(xiàn)，尿常規(guī)表現(xiàn)紅細(xì)胞及白細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加，解剖結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎臟存在彌漫性的水腫和大量膿腔。同時(shí)，病理結(jié)果也證實(shí)感染大鼠腎臟組織中存在嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及壞死膿腫形成等。

5 結(jié)論

圖3 各組大鼠腎臟外觀(guān)Figure 3 Kidney appearance of rats of all groups

圖4 各組大鼠腎臟病理Figure 4 Renal pathology of rats of all groups

我們的研究發(fā)現(xiàn)，剔除感染后DM組大鼠的進(jìn)食量明顯增加，而在KHI、肌酐及尿素氮水平、尿常規(guī)中的紅細(xì)胞及白細(xì)胞方面以及腎臟系膜增生程度評(píng)分和小管間質(zhì)損害程度評(píng)分方面均降低。并且，剔除感染后，DM組大鼠的24小時(shí)尿蛋白定量方面有所降低。DM大鼠與人類(lèi)糖尿病一樣同樣容易發(fā)生感染，且感染部位以腎臟、尿路和肺部為主。DM足病患者尿蛋白的排泄量隨著足部感染程度的加重而增多［7］。在慢性乙肝病毒感染及人免疫缺陷病毒感染患者中，活動(dòng)性炎癥可引起并加重尿蛋白排泄，同時(shí)適度控制感染會(huì)減少尿蛋白排泄［8］。由此推測(cè)，感染可能是加重腎病進(jìn)展的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。

［1］ Sarabeth Graham，Yves Gorin，Hanna E，etal．Abundance of TRPC6protein in glomerular mesangial cells is decreased by ROS and PKC in diabetes［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2011，301：C304－C315．

［2］ YANG Yu－xi，HUANG Song－min，YAN Xiao－yong，etal．Re－lationship Between Activation of Mannan－binding Lectin Complement and NF－kB in diabetic Nephrology［J］．J Sichuan Univ（Med sci Edi），2011，42（4）：490－493．

［3］ 楊俏玲，何蘭杰，李紅兵，等．羅格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎臟病理的影響及其機(jī)制探討［J］．寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29（4）：347－349．

［4］ Yoshihiro Kuno，Masayuki Iyoda，Takanori Shibata，etal．Sildenafil，aphosphodiesterase type 5inhibitor，attenuates diabetic nephropathy in non－insulin－dependent Otsuka Long－Evans Tokushima Fatty rats［J］．British Journal of Pharmacology，2011，162 1389－1400．

［5］ 王清泉．糖尿病合并肺感染研究進(jìn)展［J］．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，16（32）：4901－4902．

［6］ 王曉黎，張 錦．糖尿病合并感染及其高危因素分析［J］．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2012，24（3）：257－258．

［7］ 劉 宏，張杉杉，顧雪明，等．糖尿病足病尿蛋白排泄及其與感染程度關(guān)系研究［J］．中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2012，32（10）：779－782．

［8］ Kilic M，Taskin E，Sen Y，etal．Microalbuminuria in chronic hepatitis B infection［J］．Indian Pediatr，2010，47（6）：511－515．