抗氰新藥DDD和4－二甲基氨基苯酚對大鼠高鐵血紅蛋白濃度的影響＊

林 海，蔡 穎，但國蓉，董兆君

（1．第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院醫(yī)教部，重慶400037；2．第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院，重慶400038）

氫氰酸（hydrogen cyanide，HCN）、氰化鈉（sodi －um cyanide，NaCN）、氰 化 鉀 （potassium cyanide，KCN）是劇毒的化學(xué)物質(zhì)，因其分子中都含有氰基（CN），故又稱作氰類化合物。此類化合物是非常重要的工業(yè)原料，在冶金、制藥、塑料、化纖、制革等行業(yè)有廣泛的用途。因化學(xué)泄露而導(dǎo)致的人員傷亡事故時有發(fā)生。HCN和氯化氫（cyanogen chloride）又是外軍裝備速殺型化學(xué)戰(zhàn)劑，其毒性大、作用快，能在短時間內(nèi)造成大批人員中毒死亡，被視為大規(guī)模殺傷性武器［1－3］。因此，對氰中毒的防治研究一直是軍事醫(yī)學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)的重點方向。迄今效果較佳的抗氰藥物是高鐵血紅蛋白（methemoglobin，MHb）形成劑，主要的有亞硝酸鈉（亞硝酸鈉）、亞硝酸異戊酯（amyl nitrite）、4－二 甲 基 氨 基 苯 酚 （4－diaminophenol，4－DMAP）和對氨基苯丙酮（P－Aminopropiophene）作用快，抗氰能力都強，但需要消耗大量的血紅蛋白，容易造成缺氧而加重病情的發(fā)展，甚至有造成MeHb血癥的危險，尤其不適用于火災(zāi)現(xiàn)場氰中毒救治［4～9］。因此，尋找新型抗氰藥物是當(dāng)前該領(lǐng)域的重大任務(wù)。本單位自本世紀(jì)初發(fā)展了新一代抗氰藥物DDD，它能利用全新的概念清除體內(nèi)的游離氰離子。前期試驗業(yè)已證實效果良好，尤其在中毒前用藥時能發(fā)揮極好地預(yù)防效果。但該化合物是否也能形成MHb，是該化合物能否發(fā)展成為新型抗氰藥物的前提。為此，我們以wistar大白鼠為實驗對象，以4－DMAP為實驗對照，比較二者在常氧和缺氧條件下形成MeHb的能力，其結(jié)果對于闡明該藥的藥理學(xué)特征，保證其臨床安全應(yīng)用具有重要意義。

1 材料和方法

1．1 試劑和儀器 鐵氰化鉀 K3［Fe（CN）6］購自美國Fluka公司，臨用前新鮮配制。DDD為第三軍醫(yī)大學(xué)防化教研室合成，4－DMAP由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所提供，純度大于95%，新鮮配制。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。752型分光光度計為上海滬奧明科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1．2 動物及實驗分組 wistar大白鼠雌雄各半，體質(zhì)量241±5g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，常規(guī)飲料喂養(yǎng)。選取大鼠40只隨機分為AB兩大組，各下設(shè)對照、10min、30min和60min四個亞組。對A組大鼠，按照5ml／kg容積通過灌胃針給予DDD（100mg／kg）。0min組大鼠則以同法給予蒸餾水；對于B組大鼠，按照5ml／kg容積通過腹腔注射4－DMAP（3mg／kg）。0min組大鼠則以同法給予蒸餾水。于設(shè)定的時間點處死動物，取全血，測定MeHb含量。再取大鼠30只，隨機分成C、D、E、F、G、H等組，每組5只。C、D、E組分別以灌胃法給予 DDD 50、100、150mg／kg；F、G、H 組則分別以腹腔注射法給予4－DMAP 1．0、2．0和3．0mg／kg。同樣于設(shè)定的時間點處死動物，取全血，測定MeHb含量。

1．3 Hb和 MHb測定 Hb測定按照文獻(xiàn)［7］報道方法進(jìn)行，稍加改進(jìn)。試管中加入血紅蛋白測試液（0．05g氫氧化鈉，0．20g高鐵氰人鉀0．14g磷酸氫二鉀，1ml Triton X－100，加蒸餾水至1000ml）5ml，吸取20ul紅細(xì)胞懸液，擦去吸管外血液后，輕輕加于試管底部，混勻后作用5min，540nm比色得吸光度。計算血紅蛋白 Hb總量（g／L）＝A×251×64458／44000＝A×36717。

高鐵血紅蛋白測定，血樣稀釋：取1離心管加入5ml的1／60磷酸鹽溶液和血樣50ul即成。取兩只容量為1．5ml的EP反應(yīng)管，分別標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)管和測定管。各加入1ml稀釋血樣，以1／60磷酸鹽溶液調(diào)零。測定管比色OD630nm值記為A1，加入中性氰化鈉溶液1滴混勻，2min后比色得OD630nm值記為A2．標(biāo)準(zhǔn)管先加入10%鐵氰化鉀溶液1滴混勻，2min后測OD630nm值，記為A3。再加入中性氰化鈉溶液1滴，混勻，2min后比色測OD630nm值，記為A4。所得結(jié)果按照下式計算：MHb%＝（A1－A2）／（A3－A4）×100%，MeHb含量（g／100ml）＝Hb含量×MHb%。

2 結(jié)果

灌胃DDD大鼠在觀察時間內(nèi)無任何異常表現(xiàn)。腹腔注射4－DMAP的大鼠除在5～30min內(nèi)活動減少外，也未出現(xiàn)其他異常表現(xiàn)。

2．1 時間－效應(yīng)結(jié)果 如表1所示，大鼠以DDD處理后60min內(nèi)，血液MeHb含量略有波動，但未出現(xiàn)有統(tǒng)計意義的變化。而腹腔注射4－DMAP的大鼠，10min血液 MeHb顯著升高，30min達(dá)到最高值。60min時血液MeHb含量有所下降，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照水平。10、30、60min分別為對照的 3．58、9．32、8．02倍。

表1 DDD和4－DMAP對大鼠血液MeHb含量的影響［±s，n＝5（×10－2）］Table 1 Effect of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

表1 DDD和4－DMAP對大鼠血液MeHb含量的影響［±s，n＝5（×10－2）］Table 1 Effect of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

注：與對照組比較①P＜0．05

組別 對照 給藥后時間（min）10 30 60 2．87±0．32 2．42±0．19 2．56±0．41 A 2．24±0．25 B 2．41±0．32 8．62±0．93①①19．33±4．12①

2．2 劑量－效應(yīng)結(jié)果 表2所列為給藥30min后，DDD和4－DMAP對大鼠血液MeHb濃度的影響。由表中數(shù)據(jù)可見，DDD在所選劑量范圍內(nèi)不明顯改變血液MeHb濃度。4－DMAP與DDD不同，血液 MeHb濃度隨著用藥劑量的增加而升高。若以表1的對照組結(jié)果（2．41）為基點進(jìn)行計算，當(dāng)劑量為1．0、2．0、3．0mg／kg時 的 MeHb 濃 度 分 別 升 高 6．63、8．32、11．89倍。

表2 不同劑量DDD和4－DMAP對大鼠血液MeHb含量的影響［±s，n＝5（×10－2）］Table 2 Effect of different doses of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

表2 不同劑量DDD和4－DMAP對大鼠血液MeHb含量的影響［±s，n＝5（×10－2）］Table 2 Effect of different doses of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

藥物 劑量分組A B C A 2．35±0．44 2．42±0．19 2．71±0．42 D E F B 18．54±2．93 22．47±3．67 31．08±4．04

3 討論

分子中含有氰基的化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱為氰類化合物，包括前述的氰化氫（HCN）、氰化鈉（NaCN）、氰化鉀（KCN）和氯化氰（CNC1）等。HCN、NaCN、KCN 是用途非常廣泛的化工原料，可以作為原材料，也可以作為中間體。其生產(chǎn)、儲存量及市場需求非常巨大。因保管、運輸使用不當(dāng)所造成的泄露事故屢見不鮮。HCN和CNC1則是外軍裝備的化學(xué)戰(zhàn)劑。雖然有國際禁止化學(xué)武器公約的限制，世界各國均承諾不生產(chǎn)、儲存和使用化學(xué)武器，但由于氰類毒劑制造方法非常簡單，生產(chǎn)成本低，隱蔽性很大且殺傷力極強，在未來戰(zhàn)爭中使用的可能性仍然很大。因此，對化學(xué)戰(zhàn)劑，特別是對氰類戰(zhàn)劑的防護是當(dāng)前國內(nèi)外軍事醫(yī)學(xué)的研究重點。

真核細(xì)胞線粒體的細(xì)胞呼吸鏈?zhǔn)怯梢幌盗械倪f氫體和電子傳遞體（eletron transfer）組成的一個連續(xù)反應(yīng)體系。其主要職責(zé)是負(fù)責(zé)將底物脫下的氫原子交給氧生成水，同時生成三磷酸腺苷（ATP）。其主要的限速酶是位于呼吸鏈最后的細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome oxidase，COX）。COX 的催化過程如同戲劇般地復(fù)雜和奇妙，歷經(jīng)多次電子轉(zhuǎn)移之后，最終使一個氧氣分子還原為兩個水分子。期間凈利用了還原的細(xì)胞色素c提供的4個電子（e）。消耗了8個質(zhì)子，但又產(chǎn)生了4個質(zhì)子。而這些電子的傳遞過程離不開血紅素A。

COX的血紅素A是一個具有卟啉結(jié)構(gòu)的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四個吡咯環(huán)上的氮原子與一個亞鐵離子配位結(jié)合，珠蛋白肽鏈中第8位的一個組氨酸殘基中的吲哚側(cè)鏈上的氮原子從卟啉分子平面的上方與亞鐵離子（Fe2＋）配位結(jié)合。Fe2＋能結(jié)合分子氧，而對CN的其親和力。外源性氰化物進(jìn)入體內(nèi)后很快解離除CN－，后者通過彌散作用進(jìn)入線粒體并迅速與COX的Fe2＋或者Fe3＋結(jié)合，使之喪失傳遞e的能力。這就是氰化物中毒的本質(zhì)［8］。

迄今為止，國外自上世紀(jì)50年代開始研究，70年代到高峰：我國自上世紀(jì)80年代開始研究，90年代達(dá)到高峰。迄今已研發(fā)了四代抗氰藥物：①第一代以美蘭和硫代硫酸鈉為代表。美蘭臨床科用于治療尿路結(jié)石、治療閉塞性脈管炎等。也用于治療氰化物中毒，但用量大，需要靜脈注射，且有惡心、腹痛、心前區(qū)痛、眩暈、頭痛、出汗和神志不清等不良反應(yīng)。后者能結(jié)合氰離子，臨床效果也不錯。但該藥也只能靜脈注射，用量同樣很大。②第二代是亞硝酸鹽類化合物，主要有亞硝酸鈉和亞硝酸異戊枉費。前者只能靜脈滴注，后者只能經(jīng)呼吸道吸入使用。二者有共同的作用原理，即可以措施體內(nèi)的血紅蛋白轉(zhuǎn)化為MeHb。MeHb即可競爭氰離子，從而發(fā)揮抗氰作用。但他們都有很明顯的心血管副作用，可能導(dǎo)致血管擴張和血壓劇變。加之其結(jié)合氰離子并不牢固，其效果不穩(wěn)定，容易臨床癥狀的反復(fù)，逐漸引起眾的厭棄。③第三代是氨基酚類化合物，以4－DMAP和PAPP為代表。它們與亞硝酸鹽類比較有明顯的優(yōu)勢：可以肌肉注射，也可以口服，適用比較方便；吸收極為迅速，即使在發(fā)生休克時然可以在5min內(nèi)達(dá)到需要的血藥濃度；在體內(nèi)的半衰期比較長，維持藥效時間比較久。救治氰中毒時，4－DMAP只需注射一次；預(yù)防氰中毒時，PAPP可以預(yù)防12h［9］。④第四代即目前各國正在研究開發(fā)的新型的或新作用原理的抗氰藥物。DDD即為其中之一，其設(shè)計思路是為機體提供一種能結(jié)合氰離子的前體物質(zhì)，待其進(jìn)入體內(nèi)后可自動轉(zhuǎn)化為能結(jié)合氰離子的物質(zhì)?？梢?，氨基酚類抗氰藥物雖然抗氰效果好，但由于其能消耗大量血紅蛋白，有不適合于缺氧環(huán)境的致命弱點，也有形成極高M(jìn)eHb血癥的風(fēng)險。因此，新設(shè)計的DDD必須具備不形成MeHb的特性。

實驗結(jié)果顯示，正常大鼠血液存在一定濃度的MeHb，其含量不越過3%。給予4－DMAP后血液MeHb含量迅速升高，30min達(dá)到高峰，60min雖然有所下降，但仍遠(yuǎn)高于對照水平。這與早期結(jié)果基本吻合，也是4－DMAP 具有良好抗氰效果的基礎(chǔ)［7，10～14］。但從表1數(shù)據(jù)可以看出，口服DDD后60min內(nèi)大鼠血液MeHb濃度基本不受影響。這說明DDD不具備形成MeHb的能力。從理論上分析，4－DMAP是一個含有苯基的化合物，具有很強氧化還原活性，所以能夠促使血紅蛋白之血紅素A的鐵離子（Fe2＋）轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3＋。但DDD不具備氧化還原活性的結(jié)構(gòu)，它只能提供一個巰基。所以沒有使血紅蛋白轉(zhuǎn)化為MeHb的可能。在50、100、150mg／kg三中劑量時，它都沒引起大鼠血液MeHb濃度的明顯變化。因此，可以基本上判斷該藥于MeHb形成沒有因果關(guān)系。但是，能夠促使血液氰離子排泄而具有抗氰作用的藥物還很多，如硫代硫酸鈉、羥鈷胺素等。DDD的藥效評估尚需其他的試驗結(jié)果予以證實。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，4－DMAP是 MeHb形成劑，DDD不具備形成MeHb的能力。

［1］ 歐陽子倩，王延治．全身中毒性毒劑［M］．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1985：346．

［2］ Laquer W．Postmodern terrorism［J］．Foreign Affairs，1996，76：24－361．

［3］ Rhee J，Jung J，Yeom H．Distribution of cyanide in heart blood，peripheral blood and gastric contents in 21cyanide related fatalities［J］．Forensic Sci Int，2011，210（1－3）：12－15．

［4］ Leavesley HB Li L，Mukhopadhyay S，et al．Nitrite－mediated antagonism of cyanide inhibition of cytochrome c oxidase in dopamine enurons［J］．Toxicol Sci，2010，115（2）：569－576．

［5］ Aslan A，Osmanagaoglu S．Cavolli R，et al．Sodium nitroprusside infusion prevents hypothyroidism in patients undergoing coronary artery bypass grafting：aprospective randomized clinical trial［J］．J Cardiovasc Med（Hagerstown），2010；11（8）：575－582．

［6］ 耿 煜，刁天喜．美國應(yīng)對化學(xué)戰(zhàn)劑突發(fā)事件的緊急公共衛(wèi)生保障研究［J］．中國衛(wèi)生事業(yè)管理，2005：（4）：198－201．

［7］ 葉華虎，袁菊芳，王艷靜，等．缺氧環(huán)境下氰化物的毒性變化及4－DMAP的解毒效果研究［J］．解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2006，31（11）：1090－1092．

［8］ Keilin D．Cytochrome and intracellular oxidase．Proc R Soc，1930，B106：418－444．

［9］ Kerger H，Dodidou P，Passani－Kruppa D，et al．Excessive methaemoglobinaemia and multi－organ failure following 4－DMAP antidote therapy［J］．Resuscitation，2005，66（2）：231－235．

［10］ 孫曉紅，于澤欽，杜先林，等．MeHb形成劑的作用比較［J］．中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，1998，（3）：18－20．

［11］ 邢小喜，何 悅，葉 楓，等．4－對二甲氨基酚和缺氧對犬高鐵血紅蛋白及心電信號的影響［J］．局解手術(shù)學(xué)雜志，2011，20（3）：255－257．

［12］ 葉華虎，袁菊芳，鄧?yán)^先，等．缺氧環(huán)境下4－DMAP形成高鐵血紅蛋白的藥效學(xué)特征［J］．解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2006，31（11）：1090－1092．

［13］ 袁菊芳，葉華虎，李奇慧，等．金秀4－DMAP對缺氧紅細(xì)胞生成高鐵血紅蛋白的效應(yīng)特點［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，25（14）：1227－1229．

［14］ Lawson－Smith P，Olsen NV，Hyldegaard O．Hyperbaric oxygen therapy or hydroxycobalamin attenuates surges in brain interstitial lactate and glucose；and hyperbaric oxygen improves respiratory status in cyanide－intoxicated rats［J］．Undersea Hyperb Med，2011，38（4）：223－237．