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    CD47在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中調(diào)控血管生成的作用研究*

    2014-02-27 07:46:48夏夢迪謝席勝馮勝剛
    西部醫(yī)學(xué) 2014年11期

    夏夢迪,謝席勝,馮勝剛

    (1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科,四川 瀘州646000;2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科,四川 南充637000)

    腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)被認(rèn)為是慢性腎臟病進展到終末期腎衰(end stage renal disease,ESRD)的共同通路和最主要病理改變之一。RIF主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)在腎間質(zhì)過度沉積、腎小管間質(zhì)破壞和腎小管周圍毛細(xì)血管(peritubular capillary,PTC)丟失[1]。其中,PTC的喪失與RIF的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。TSP-1的常見受體CD47是一種整合素相關(guān)蛋白,分子量為40~55kDa。在RIF病變過程中TSP-1是否通過其受體CD47參與抑制血管生成,值得關(guān)注。本研究通過免疫組化檢測TSP-1、CD47、VEGF在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型中的表達(dá),并初步研究這些細(xì)胞因子與PTC的關(guān)系,探討TSP-1受體CD47在調(diào)控抑制血管生成的作用及機制。

    1 材料和方法

    1.1 試劑和儀器 3%戊巴比妥鈉(由川北醫(yī)學(xué)院動物中心提供);TSP-1抗體(批號BA2130,購自博士德生物工程有限公司);CD47(批號BS-2386R,購自博奧森生物技術(shù)有限公司)、VEGF(批號BA0407,購自博士德生物工程有限公司)、CD34(批號BA0532,購自博士德生物工程有限公司)。兔SP免疫組化染色試劑盒(北京中杉,批號SP-9001);DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

    1.2 實驗動物和分組 清潔、健康SD大鼠75只,體重180~200g,購自川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。將大鼠隨機分為假手術(shù)組(SOR組)25只和模型組(UUO組)50只。UUO組隨機分為5個時間點,分別為術(shù)后3天、7天、14天、21天和28天,每小組10只。SOR組按相同時間點隨機分組,每組5只。

    1.3 建立動物模型 術(shù)前使用5%水合氯醛,按6ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠按右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上,局部剃毛后,常規(guī)碘酒、75%酒精消毒,選擇左側(cè)腹切口,逐層切開,進入腹腔,分離左側(cè)輸尿管。用止血鉗夾閉輸尿管中段,并用4-0絲線于左側(cè)輸尿管兩端,兩次結(jié)扎其近腎盂段,剪斷輸尿管,連續(xù)縫合皮膚,即為UUO動物模型。SOR組只切開腹腔和游離左側(cè)輸尿管,不進行結(jié)扎和剪斷。

    1.4 病理檢查 各組大鼠處死后取左腎組織,保存于10%多聚甲醛液中固定48h,石蠟包埋切片,經(jīng)常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察腎組織病理學(xué)改變。根據(jù)文獻(xiàn)描述方法,進行腎小管間質(zhì)損傷半定量評分[2]和腎間質(zhì)浸潤炎細(xì)胞計數(shù)[3]。

    1.5 免疫組化 采用SP法進行檢測,觀察腎臟TSP-1、CD47、VEGF的表達(dá)。以CD34代表PTC的表達(dá)。4μm石蠟切片,常規(guī)脫蠟下水,高壓鍋修復(fù)后滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。正常山羊血清37℃孵育封閉。加一抗4℃過夜。加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 37℃孵育。加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃孵育。期間均用pH=7.2的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。每次以PBS代替一抗作替代陰性對照。

    采用Image Pro plus多媒體彩色病理圖像分析軟件進行分析。分別計算每例切片4個不重疊的400倍視野中,腎小管 TSP-1、CD47、VEGF、CD34陽性染色平均光密度值(integral optical density,IOD),取平均值,并做統(tǒng)計分析。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件處理。資料采用ˉx±s表示。組間差異選單因素方差分析,用SNK檢驗法進行組間兩兩比較。數(shù)據(jù)之間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 實驗動物存活情況 UUO組大鼠1只術(shù)后麻醉過度未清醒,2只于術(shù)后一天死亡,對其解剖發(fā)現(xiàn)腹腔出血嚴(yán)重,死亡可能與傷及腹腔血管有關(guān)。另5只分別于術(shù)后第2、7、8、11、17天進食逐漸減少后相繼死亡,剖開腹腔可見明顯感染灶。SOR組1只大鼠術(shù)后未清醒,2只大鼠術(shù)后進食減少,分別在第4天和第10天死亡。共統(tǒng)計納入大鼠64只(UUO組,n=42;SOR組,n=22)。

    2.2 腎組織病理改變 HE染色顯示,SOR組腎皮、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)正常,腎小管間質(zhì)及腎小球未見異常,無明顯充血及炎細(xì)胞浸潤。UUO術(shù)后3d可見腎小管明顯擴張,空泡變性、炎癥細(xì)胞浸潤。UUO術(shù)后7d即可觀察到明顯的腎間質(zhì)纖維化的表現(xiàn)如腎間質(zhì)增寬、膠原沉積增加、腎小管萎縮等。術(shù)后14~21d,上述纖維化的征象更加明顯。腎小管損傷程度評分顯示,UUO各組較SOR組腎小管損傷評分隨時間延長逐漸升高,結(jié)果見圖1~3。

    2.3 PTC(CD34)及VEGF的變化 免疫組化結(jié)果顯示,SOR組:腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)均正常,CD34在腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá),VEGF廣泛存在于腎小管上皮細(xì)胞及細(xì)胞胞漿中;UUO 3天組:腎小管輕度擴張,腎小球、腎小管CD34表達(dá)減弱,VEGF表達(dá)也較前減少;UUO 7天組:腎小管擴張加劇,腎小管上皮細(xì)胞CD34、VEGF陽性表達(dá)進一步減少;UUO 14天組:腎小管擴張呈囊狀,部分小管壞死,很少部分腎小管表達(dá)CD34,VEGF也只少量表達(dá);UUO 21天組:腎小管減少,間質(zhì)纖維化,殘存腎小管表達(dá)少量CD34,少許腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF;UUO 28天組:腎小球損傷輕微,腎小管減少,間質(zhì)纖維化,CD34在腎小球毛細(xì)血管表達(dá),腎小管CD34和VEGF的表達(dá)極少,結(jié)果見表1。

    2.4 TSP-1、CD47的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示,SOR組:腎小管結(jié)構(gòu)正常,無TSP-1表達(dá),無CD47表達(dá);UUO 3天組:腎小管腫脹,部分腎小管上皮細(xì)胞胞漿中TSP-1和CD47表達(dá);UUO 7天組:腎小管擴張,部分空泡變性,大部分腎小管上皮細(xì)胞胞漿中TSP-1和CD47表達(dá);UUO 14天組:腎小管擴張呈囊狀,萎縮的腎小管上皮見TSP-1表達(dá),部分壞死脫落到管腔的上皮細(xì)胞可見TSP-1陽性著色,萎縮的腎小管上皮有CD47表達(dá),部分間質(zhì)見CD47表達(dá);UUO 21天組:腎小管減少,腎小管上皮細(xì)胞和纖維化明顯的間質(zhì)TSP-1表達(dá),纖維化的間質(zhì)CD47增加;UUO 24天組:腎小管減少,間質(zhì)纖維化顯著,TSP-1在纖維化顯著的間質(zhì)表達(dá),CD47表達(dá)進一步增加,結(jié)果見表1。

    圖1 UUO大鼠腎組織病理改變(HE×100)Fig.1 Histological examination in rats with UUO(HE×100)

    圖2 炎細(xì)胞計數(shù)變化Fig.2 Change of inflammatory cell

    圖3 腎小管損傷評分Fig.3 Score of renal interstitial lesion

    表1 各組大鼠腎小管免疫組化指標(biāo)積分光密度(IOD,±s)Table1 Immunohistochemical level of IOD in rats with UUO

    表1 各組大鼠腎小管免疫組化指標(biāo)積分光密度(IOD,±s)Table1 Immunohistochemical level of IOD in rats with UUO

    注:與假手術(shù)組相比:①P<0.05,與 UUO 3天組相比:②P<0.05;

    組別 n CD34 Tsp-1 CD47 VEGF 22 12.00±1.94 0 0 86.19±13.22 UU O3天組 9 6.03±0.89① 6.96±2.24① 0.81±0.21① 56.62±5.34①UUO 7天組 9 4.24±0.53①② 11.95±1.99①② 1.39±0.19①② 41.08±3.30①②UUO 14天組 7 2.83±0.31①② 19.23±1.77①② 1.77±0.12①② 30.52±2.08①②UUO 21天組 8 1.80±0.33①② 27.51±3.78①② 2.40±0.25①② 21.66±2.64①②UUO 28天組 9 0.78±0.28①② 22.34±2.22①② 2.91±0.13①② 10.93±3.15 SOR組①②

    2.5 相關(guān)性分析 相關(guān)分析顯示CD47的表達(dá)與CD34的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.925,P<0.01),與VEGF表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)(r=-0.946,P<0.01),見圖4。

    圖4 相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis

    3 討論

    UUO模型由于其造模簡便,重復(fù)性高,可在短期內(nèi)形成腎臟纖維化,是研究腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機制的理想模型。隨著UUO時間的延長,病理切片顯示腎小管出現(xiàn)了變性和壞死,間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤,且后期出現(xiàn)纖維化,然而腎小球損傷指標(biāo)蛋白尿未出現(xiàn)明顯差異,該結(jié)果與既往文獻(xiàn)結(jié)果一致[4]。PTC病變與間質(zhì)炎癥以及隨后纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[5]。

    腎臟毛細(xì)血管網(wǎng)的退化起因于內(nèi)皮細(xì)胞丟失的增加以及損傷性的退化[6]。在這個過程中,具有促進血管生成的VEGF及具有抑制血管生成的TSP-1的地位一直倍受關(guān)注[7]。TSP-1的抗血管生成功能主要歸因于3’N-末端I型凝血酶敏感蛋白重復(fù)序列(3TSR)和C-末端片段,分別通過兩個主要受體CD36和CD47發(fā)揮抗血管的生成作用[8]。研究發(fā)現(xiàn),CD36是角膜中TSP-1抑制血管生成所必需的[9],但在血管細(xì)胞中TSP-1抑制血管生成需要的受體是CD47而不是CD36[10]。隨著腎臟纖維化進程的進展,VEGF的表達(dá)逐漸下降,而TSP-1的表達(dá)卻逐漸增強,這與文獻(xiàn)報道一致[11]。TSP-1的受體CD47也在大鼠小管間質(zhì)大量表達(dá),且其表達(dá)模式與TSP-1一致。相關(guān)性分析證實,CD47積分光密度與CD34積分光密度及VEGF積分光密度均呈負(fù)相關(guān)。

    4 結(jié)論

    TSP-1與它的受體CD47結(jié)合,可能通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞VEGF信號的傳導(dǎo),參與了UUO大鼠模型RIF過程中PTC病變的發(fā)生和發(fā)展。TSP-1與其受體CD47在RIF過程中PTC病變中的作用,值得進一步研究。

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