CD47在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中調(diào)控血管生成的作用研究＊

夏夢迪，謝席勝，馮勝剛

（1．瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，四川 瀘州646000；2．川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 南充637000）

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）被認(rèn)為是慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎衰（end stage renal disease，ESRD）的共同通路和最主要病理改變之一。RIF主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）在腎間質(zhì)過度沉積、腎小管間質(zhì)破壞和腎小管周圍毛細(xì)血管（peritubular capillary，PTC）丟失［1］。其中，PTC的喪失與RIF的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。TSP－1的常見受體CD47是一種整合素相關(guān)蛋白，分子量為40～55kDa。在RIF病變過程中TSP－1是否通過其受體CD47參與抑制血管生成，值得關(guān)注。本研究通過免疫組化檢測TSP－1、CD47、VEGF在單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型中的表達(dá)，并初步研究這些細(xì)胞因子與PTC的關(guān)系，探討TSP－1受體CD47在調(diào)控抑制血管生成的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1．1 試劑和儀器 3%戊巴比妥鈉（由川北醫(yī)學(xué)院動物中心提供）；TSP－1抗體（批號BA2130，購自博士德生物工程有限公司）；CD47（批號BS－2386R，購自博奧森生物技術(shù)有限公司）、VEGF（批號BA0407，購自博士德生物工程有限公司）、CD34（批號BA0532，購自博士德生物工程有限公司）。兔SP免疫組化染色試劑盒（北京中杉，批號SP－9001）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1．2 實驗動物和分組 清潔、健康SD大鼠75只，體重180～200g，購自川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SOR組）25只和模型組（UUO組）50只。UUO組隨機(jī)分為5個時間點，分別為術(shù)后3天、7天、14天、21天和28天，每小組10只。SOR組按相同時間點隨機(jī)分組，每組5只。

1．3 建立動物模型 術(shù)前使用5%水合氯醛，按6ml／kg腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠按右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上，局部剃毛后，常規(guī)碘酒、75%酒精消毒，選擇左側(cè)腹切口，逐層切開，進(jìn)入腹腔，分離左側(cè)輸尿管。用止血鉗夾閉輸尿管中段，并用4－0絲線于左側(cè)輸尿管兩端，兩次結(jié)扎其近腎盂段，剪斷輸尿管，連續(xù)縫合皮膚，即為UUO動物模型。SOR組只切開腹腔和游離左側(cè)輸尿管，不進(jìn)行結(jié)扎和剪斷。

1．4 病理檢查 各組大鼠處死后取左腎組織，保存于10%多聚甲醛液中固定48h，石蠟包埋切片，經(jīng)常規(guī)蘇木精－伊紅（HE）染色，觀察腎組織病理學(xué)改變。根據(jù)文獻(xiàn)描述方法，進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷半定量評分［2］和腎間質(zhì)浸潤炎細(xì)胞計數(shù)［3］。

1．5 免疫組化 采用SP法進(jìn)行檢測，觀察腎臟TSP－1、CD47、VEGF的表達(dá)。以CD34代表PTC的表達(dá)。4μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟下水，高壓鍋修復(fù)后滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。正常山羊血清37℃孵育封閉。加一抗4℃過夜。加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 37℃孵育。加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃孵育。期間均用pH＝7．2的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每次以PBS代替一抗作替代陰性對照。

采用Image Pro plus多媒體彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行分析。分別計算每例切片4個不重疊的400倍視野中，腎小管 TSP－1、CD47、VEGF、CD34陽性染色平均光密度值（integral optical density，IOD），取平均值，并做統(tǒng)計分析。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13．0軟件處理。資料采用ˉx±s表示。組間差異選單因素方差分析，用SNK檢驗法進(jìn)行組間兩兩比較。數(shù)據(jù)之間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 實驗動物存活情況 UUO組大鼠1只術(shù)后麻醉過度未清醒，2只于術(shù)后一天死亡，對其解剖發(fā)現(xiàn)腹腔出血嚴(yán)重，死亡可能與傷及腹腔血管有關(guān)。另5只分別于術(shù)后第2、7、8、11、17天進(jìn)食逐漸減少后相繼死亡，剖開腹腔可見明顯感染灶。SOR組1只大鼠術(shù)后未清醒，2只大鼠術(shù)后進(jìn)食減少，分別在第4天和第10天死亡。共統(tǒng)計納入大鼠64只（UUO組，n＝42；SOR組，n＝22）。

2．2 腎組織病理改變 HE染色顯示，SOR組腎皮、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，腎小管間質(zhì)及腎小球未見異常，無明顯充血及炎細(xì)胞浸潤。UUO術(shù)后3d可見腎小管明顯擴(kuò)張，空泡變性、炎癥細(xì)胞浸潤。UUO術(shù)后7d即可觀察到明顯的腎間質(zhì)纖維化的表現(xiàn)如腎間質(zhì)增寬、膠原沉積增加、腎小管萎縮等。術(shù)后14～21d，上述纖維化的征象更加明顯。腎小管損傷程度評分顯示，UUO各組較SOR組腎小管損傷評分隨時間延長逐漸升高，結(jié)果見圖1～3。

2．3 PTC（CD34）及VEGF的變化 免疫組化結(jié)果顯示，SOR組：腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)均正常，CD34在腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，VEGF廣泛存在于腎小管上皮細(xì)胞及細(xì)胞胞漿中；UUO 3天組：腎小管輕度擴(kuò)張，腎小球、腎小管CD34表達(dá)減弱，VEGF表達(dá)也較前減少；UUO 7天組：腎小管擴(kuò)張加劇，腎小管上皮細(xì)胞CD34、VEGF陽性表達(dá)進(jìn)一步減少；UUO 14天組：腎小管擴(kuò)張呈囊狀，部分小管壞死，很少部分腎小管表達(dá)CD34，VEGF也只少量表達(dá)；UUO 21天組：腎小管減少，間質(zhì)纖維化，殘存腎小管表達(dá)少量CD34，少許腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF；UUO 28天組：腎小球損傷輕微，腎小管減少，間質(zhì)纖維化，CD34在腎小球毛細(xì)血管表達(dá)，腎小管CD34和VEGF的表達(dá)極少，結(jié)果見表1。

2．4 TSP－1、CD47的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，SOR組：腎小管結(jié)構(gòu)正常，無TSP－1表達(dá)，無CD47表達(dá)；UUO 3天組：腎小管腫脹，部分腎小管上皮細(xì)胞胞漿中TSP－1和CD47表達(dá)；UUO 7天組：腎小管擴(kuò)張，部分空泡變性，大部分腎小管上皮細(xì)胞胞漿中TSP－1和CD47表達(dá)；UUO 14天組：腎小管擴(kuò)張呈囊狀，萎縮的腎小管上皮見TSP－1表達(dá)，部分壞死脫落到管腔的上皮細(xì)胞可見TSP－1陽性著色，萎縮的腎小管上皮有CD47表達(dá)，部分間質(zhì)見CD47表達(dá)；UUO 21天組：腎小管減少，腎小管上皮細(xì)胞和纖維化明顯的間質(zhì)TSP－1表達(dá)，纖維化的間質(zhì)CD47增加；UUO 24天組：腎小管減少，間質(zhì)纖維化顯著，TSP－1在纖維化顯著的間質(zhì)表達(dá)，CD47表達(dá)進(jìn)一步增加，結(jié)果見表1。

圖1 UUO大鼠腎組織病理改變（HE×100）Fig．1 Histological examination in rats with UUO（HE×100）

圖2 炎細(xì)胞計數(shù)變化Fig．2 Change of inflammatory cell

圖3 腎小管損傷評分Fig．3 Score of renal interstitial lesion

表1 各組大鼠腎小管免疫組化指標(biāo)積分光密度（IOD，±s）Table1 Immunohistochemical level of IOD in rats with UUO

表1 各組大鼠腎小管免疫組化指標(biāo)積分光密度（IOD，±s）Table1 Immunohistochemical level of IOD in rats with UUO

注：與假手術(shù)組相比：①P＜0．05，與 UUO 3天組相比：②P＜0．05；

組別 n CD34 Tsp－1 CD47 VEGF 22 12．00±1．94 0 0 86．19±13．22 UU O3天組 9 6．03±0．89① 6．96±2．24① 0．81±0．21① 56．62±5．34①UUO 7天組 9 4．24±0．53①② 11．95±1．99①② 1．39±0．19①② 41．08±3．30①②UUO 14天組 7 2．83±0．31①② 19．23±1．77①② 1．77±0．12①② 30．52±2．08①②UUO 21天組 8 1．80±0．33①② 27．51±3．78①② 2．40±0．25①② 21．66±2．64①②UUO 28天組 9 0．78±0．28①② 22．34±2．22①② 2．91±0．13①② 10．93±3．15 SOR組①②

2．5 相關(guān)性分析 相關(guān)分析顯示CD47的表達(dá)與CD34的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．925，P＜0．01），與VEGF表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．946，P＜0．01），見圖4。

圖4 相關(guān)性分析Fig．4 Correlation analysis

3 討論

UUO模型由于其造模簡便，重復(fù)性高，可在短期內(nèi)形成腎臟纖維化，是研究腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制的理想模型。隨著UUO時間的延長，病理切片顯示腎小管出現(xiàn)了變性和壞死，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，且后期出現(xiàn)纖維化，然而腎小球損傷指標(biāo)蛋白尿未出現(xiàn)明顯差異，該結(jié)果與既往文獻(xiàn)結(jié)果一致［4］。PTC病變與間質(zhì)炎癥以及隨后纖維化的發(fā)生密切相關(guān)［5］。

腎臟毛細(xì)血管網(wǎng)的退化起因于內(nèi)皮細(xì)胞丟失的增加以及損傷性的退化［6］。在這個過程中，具有促進(jìn)血管生成的VEGF及具有抑制血管生成的TSP－1的地位一直倍受關(guān)注［7］。TSP－1的抗血管生成功能主要歸因于3’N－末端I型凝血酶敏感蛋白重復(fù)序列（3TSR）和C－末端片段，分別通過兩個主要受體CD36和CD47發(fā)揮抗血管的生成作用［8］。研究發(fā)現(xiàn)，CD36是角膜中TSP－1抑制血管生成所必需的［9］，但在血管細(xì)胞中TSP－1抑制血管生成需要的受體是CD47而不是CD36［10］。隨著腎臟纖維化進(jìn)程的進(jìn)展，VEGF的表達(dá)逐漸下降，而TSP－1的表達(dá)卻逐漸增強(qiáng)，這與文獻(xiàn)報道一致［11］。TSP－1的受體CD47也在大鼠小管間質(zhì)大量表達(dá)，且其表達(dá)模式與TSP－1一致。相關(guān)性分析證實，CD47積分光密度與CD34積分光密度及VEGF積分光密度均呈負(fù)相關(guān)。

4 結(jié)論

TSP－1與它的受體CD47結(jié)合，可能通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞VEGF信號的傳導(dǎo)，參與了UUO大鼠模型RIF過程中PTC病變的發(fā)生和發(fā)展。TSP－1與其受體CD47在RIF過程中PTC病變中的作用，值得進(jìn)一步研究。

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