CD47在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中調(diào)控血管生成的作用研究＊

夏夢迪，謝席勝，馮勝剛

（1．瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，四川 瀘州646000；2．川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 南充637000）

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）被認(rèn)為是慢性腎臟病進展到終末期腎衰（end stage renal disease，ESRD）的共同通路和最主要病理改變之一。RIF主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）在腎間質(zhì)過度沉積、腎小管間質(zhì)破壞和腎小管周圍毛細(xì)血管（peritubular capillary，PTC）丟失［1］。其中，PTC的喪失與RIF的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。TSP－1的常見受體CD47是一種整合素相關(guān)蛋白，分子量為40～55kDa。在RIF病變過程中TSP－1是否通過其受體CD47參與抑制血管生成，值得關(guān)注。本研究通過免疫組化檢測TSP－1、CD47、VEGF在單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型中的表達(dá)，并初步研究這些細(xì)胞因子與PTC的關(guān)系，探討TSP－1受體CD47在調(diào)控抑制血管生成的作用及機制。

1 材料和方法

1．1 試劑和儀器 3%戊巴比妥鈉（由川北醫(yī)學(xué)院動物中心提供）；TSP－1抗體（批號BA2130，購自博士德生物工程有限公司）；CD47（批號BS－2386R，購自博奧森生物技術(shù)有限公司）、VEGF（批號BA0407，購自博士德生物工程有限公司）、CD34（批號BA0532，購自博士德生物工程有限公司）。兔SP免疫組化染色試劑盒（北京中杉，批號SP－9001）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1．2 實驗動物和分組 清潔、健康SD大鼠75只，體重180～200g，購自川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。將大鼠隨機分為假手術(shù)組（SOR組）25只和模型組（UUO組）50只。UUO組隨機分為5個時間點，分別為術(shù)后3天、7天、14天、21天和28天，每小組10只。SOR組按相同時間點隨機分組，每組5只。

1．3 建立動物模型 術(shù)前使用5%水合氯醛，按6ml／kg腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠按右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上，局部剃毛后，常規(guī)碘酒、75%酒精消毒，選擇左側(cè)腹切口，逐層切開，進入腹腔，分離左側(cè)輸尿管。用止血鉗夾閉輸尿管中段，并用4－0絲線于左側(cè)輸尿管兩端，兩次結(jié)扎其近腎盂段，剪斷輸尿管，連續(xù)縫合皮膚，即為UUO動物模型。SOR組只切開腹腔和游離左側(cè)輸尿管，不進行結(jié)扎和剪斷。

1．4 病理檢查 各組大鼠處死后取左腎組織，保存于10%多聚甲醛液中固定48h，石蠟包埋切片，經(jīng)常規(guī)蘇木精－伊紅（HE）染色，觀察腎組織病理學(xué)改變。根據(jù)文獻(xiàn)描述方法，進行腎小管間質(zhì)損傷半定量評分［2］和腎間質(zhì)浸潤炎細(xì)胞計數(shù)［3］。

1．5 免疫組化 采用SP法進行檢測，觀察腎臟TSP－1、CD47、VEGF的表達(dá)。以CD34代表PTC的表達(dá)。4μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟下水，高壓鍋修復(fù)后滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。正常山羊血清37℃孵育封閉。加一抗4℃過夜。加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 37℃孵育。加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃孵育。期間均用pH＝7．2的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每次以PBS代替一抗作替代陰性對照。

采用Image Pro plus多媒體彩色病理圖像分析軟件進行分析。分別計算每例切片4個不重疊的400倍視野中，腎小管 TSP－1、CD47、VEGF、CD34陽性染色平均光密度值（integral optical density，IOD），取平均值，并做統(tǒng)計分析。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13．0軟件處理。資料采用ˉx±s表示。組間差異選單因素方差分析，用SNK檢驗法進行組間兩兩比較。數(shù)據(jù)之間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 實驗動物存活情況 UUO組大鼠1只術(shù)后麻醉過度未清醒，2只于術(shù)后一天死亡，對其解剖發(fā)現(xiàn)腹腔出血嚴(yán)重，死亡可能與傷及腹腔血管有關(guān)。另5只分別于術(shù)后第2、7、8、11、17天進食逐漸減少后相繼死亡，剖開腹腔可見明顯感染灶。SOR組1只大鼠術(shù)后未清醒，2只大鼠術(shù)后進食減少，分別在第4天和第10天死亡。共統(tǒng)計納入大鼠64只（UUO組，n＝42；SOR組，n＝22）。

2．2 腎組織病理改變 HE染色顯示，SOR組腎皮、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，腎小管間質(zhì)及腎小球未見異常，無明顯充血及炎細(xì)胞浸潤。UUO術(shù)后3d可見腎小管明顯擴張，空泡變性、炎癥細(xì)胞浸潤。UUO術(shù)后7d即可觀察到明顯的腎間質(zhì)纖維化的表現(xiàn)如腎間質(zhì)增寬、膠原沉積增加、腎小管萎縮等。術(shù)后14～21d，上述纖維化的征象更加明顯。腎小管損傷程度評分顯示，UUO各組較SOR組腎小管損傷評分隨時間延長逐漸升高，結(jié)果見圖1～3。

2．3 PTC（CD34）及VEGF的變化 免疫組化結(jié)果顯示，SOR組：腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)均正常，CD34在腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，VEGF廣泛存在于腎小管上皮細(xì)胞及細(xì)胞胞漿中；UUO 3天組：腎小管輕度擴張，腎小球、腎小管CD34表達(dá)減弱，VEGF表達(dá)也較前減少；UUO 7天組：腎小管擴張加劇，腎小管上皮細(xì)胞CD34、VEGF陽性表達(dá)進一步減少；UUO 14天組：腎小管擴張呈囊狀，部分小管壞死，很少部分腎小管表達(dá)CD34，VEGF也只少量表達(dá)；UUO 21天組：腎小管減少，間質(zhì)纖維化，殘存腎小管表達(dá)少量CD34，少許腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF；UUO 28天組：腎小球損傷輕微，腎小管減少，間質(zhì)纖維化，CD34在腎小球毛細(xì)血管表達(dá)，腎小管CD34和VEGF的表達(dá)極少，結(jié)果見表1。

2．4 TSP－1、CD47的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，SOR組：腎小管結(jié)構(gòu)正常，無TSP－1表達(dá)，無CD47表達(dá)；UUO 3天組：腎小管腫脹，部分腎小管上皮細(xì)胞胞漿中TSP－1和CD47表達(dá)；UUO 7天組：腎小管擴張，部分空泡變性，大部分腎小管上皮細(xì)胞胞漿中TSP－1和CD47表達(dá)；UUO 14天組：腎小管擴張呈囊狀，萎縮的腎小管上皮見TSP－1表達(dá)，部分壞死脫落到管腔的上皮細(xì)胞可見TSP－1陽性著色，萎縮的腎小管上皮有CD47表達(dá)，部分間質(zhì)見CD47表達(dá)；UUO 21天組：腎小管減少，腎小管上皮細(xì)胞和纖維化明顯的間質(zhì)TSP－1表達(dá)，纖維化的間質(zhì)CD47增加；UUO 24天組：腎小管減少，間質(zhì)纖維化顯著，TSP－1在纖維化顯著的間質(zhì)表達(dá)，CD47表達(dá)進一步增加，結(jié)果見表1。

圖1 UUO大鼠腎組織病理改變（HE×100）Fig．1 Histological examination in rats with UUO（HE×100）

圖2 炎細(xì)胞計數(shù)變化Fig．2 Change of inflammatory cell

圖3 腎小管損傷評分Fig．3 Score of renal interstitial lesion

表1 各組大鼠腎小管免疫組化指標(biāo)積分光密度（IOD，±s）Table1 Immunohistochemical level of IOD in rats with UUO

表1 各組大鼠腎小管免疫組化指標(biāo)積分光密度（IOD，±s）Table1 Immunohistochemical level of IOD in rats with UUO

注：與假手術(shù)組相比：①P＜0．05，與 UUO 3天組相比：②P＜0．05；

組別 n CD34 Tsp－1 CD47 VEGF 22 12．00±1．94 0 0 86．19±13．22 UU O3天組 9 6．03±0．89① 6．96±2．24① 0．81±0．21① 56．62±5．34①UUO 7天組 9 4．24±0．53①② 11．95±1．99①② 1．39±0．19①② 41．08±3．30①②UUO 14天組 7 2．83±0．31①② 19．23±1．77①② 1．77±0．12①② 30．52±2．08①②UUO 21天組 8 1．80±0．33①② 27．51±3．78①② 2．40±0．25①② 21．66±2．64①②UUO 28天組 9 0．78±0．28①② 22．34±2．22①② 2．91±0．13①② 10．93±3．15 SOR組①②

2．5 相關(guān)性分析 相關(guān)分析顯示CD47的表達(dá)與CD34的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．925，P＜0．01），與VEGF表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．946，P＜0．01），見圖4。

圖4 相關(guān)性分析Fig．4 Correlation analysis

3 討論

UUO模型由于其造模簡便，重復(fù)性高，可在短期內(nèi)形成腎臟纖維化，是研究腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機制的理想模型。隨著UUO時間的延長，病理切片顯示腎小管出現(xiàn)了變性和壞死，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，且后期出現(xiàn)纖維化，然而腎小球損傷指標(biāo)蛋白尿未出現(xiàn)明顯差異，該結(jié)果與既往文獻(xiàn)結(jié)果一致［4］。PTC病變與間質(zhì)炎癥以及隨后纖維化的發(fā)生密切相關(guān)［5］。

腎臟毛細(xì)血管網(wǎng)的退化起因于內(nèi)皮細(xì)胞丟失的增加以及損傷性的退化［6］。在這個過程中，具有促進血管生成的VEGF及具有抑制血管生成的TSP－1的地位一直倍受關(guān)注［7］。TSP－1的抗血管生成功能主要歸因于3’N－末端I型凝血酶敏感蛋白重復(fù)序列（3TSR）和C－末端片段，分別通過兩個主要受體CD36和CD47發(fā)揮抗血管的生成作用［8］。研究發(fā)現(xiàn)，CD36是角膜中TSP－1抑制血管生成所必需的［9］，但在血管細(xì)胞中TSP－1抑制血管生成需要的受體是CD47而不是CD36［10］。隨著腎臟纖維化進程的進展，VEGF的表達(dá)逐漸下降，而TSP－1的表達(dá)卻逐漸增強，這與文獻(xiàn)報道一致［11］。TSP－1的受體CD47也在大鼠小管間質(zhì)大量表達(dá)，且其表達(dá)模式與TSP－1一致。相關(guān)性分析證實，CD47積分光密度與CD34積分光密度及VEGF積分光密度均呈負(fù)相關(guān)。

4 結(jié)論

TSP－1與它的受體CD47結(jié)合，可能通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞VEGF信號的傳導(dǎo)，參與了UUO大鼠模型RIF過程中PTC病變的發(fā)生和發(fā)展。TSP－1與其受體CD47在RIF過程中PTC病變中的作用，值得進一步研究。

［1］ Campanholle G，Ligestri G，Gharib SA，et al．Cellular Mecha－nisms of Tissue Fibrosis．3．Novel mechanisms of kidney fibrosis［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2013，304（7）：C591－603．

［2］ Maarten W，Kambiz Z，et al．Proinflammatory gene expression and macrophage recruitment in the rat remnant kidney［J］．Kidney Int，2000，58（4）：1664－1676．

［3］ 田少江，賈汝漢，丁國華，等。阿托伐他汀對腎間質(zhì)纖維化大鼠巨噬細(xì)胞增殖的影響［J］．中華腎臟病雜志，2003，5（4）：460－462．

［4］ Xie XS，Li FY，Liu HC，et al．LSKL，a Peptide Antagonist of Thrombospondin－1，Attenuates Renal Interstitial Fibrosis in Rats with Unilateral Ureteral Obstruction［J］．Arch Pharm Res，2010，33（2）：275－284．

［5］ Mayer G．Capillary rarefaction，hypoxia，VEGF and angiogenesis in chronic renal disease［J］．Nephrol Dial Transplant，2011，26（4）：1132－1137．

［6］ Kang DH，Hughes J，Mazzali M，et al．Impaired angiogenesis in the remnant kidney model：II．Vascular endothelial growth factor administration reducesrenal fibrosis and stabilizes renal function［J］．J Am Soc Nephrol，2001，12（7）：1448－1457．

［7］ Kang DH，Joly AH，Oh SW，et al．Impaired angiogenesis in the remnant kidney model：I．Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin－1［J］．J Am Soc Nephrol，2001，12（7）：1434－1447．

［8］ Henkin J，Volpert OV．Therapies using anti－angiogenic peptide mimetics of thrombospondin－1［J］．Expert Opin Ther Targets，2011，15（12）：1369－1386．

［9］ Jimenez B，Volpert OV，Crawford SE，et al．Signals leading to apoptosis－dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin－1［J］．Nat Med，2000，6（1）：41－48．

［10］ Isenberg JS，Ridnour LA，Dimitry J，et al．CD47is necessary for inhibition of nitric oxide－stimulated vascular cell responses by thrombospondin－1［J］．J Biol Chem，2006，281（36）：26069－26080．

［11］ Xie XS，Liu HC，Wang FP，et al．Ginsenoside Rg1modulation on thrombospondin－1and vascular endothelial growth factor expression in early renal fibrogenesis in unilateral obstruction［J］．Phytother Res，2010，24（11）：1581－1587．