膜聯(lián)蛋白Ⅱ在肺癌組織、肺泡灌洗液和胸腔積液中的表達(dá)水平及在肺癌診斷中的價(jià)值研究

岳紅梅，顧 峰，倪志宏，李 佳，高莉萍

肺癌已經(jīng)成為一種增長快、死亡率高且發(fā)病年齡日趨年輕化的惡性腫瘤。尋找理想的腫瘤標(biāo)記物 (tumor marker，TM)用于肺癌的早期診斷，并能夠早治療已經(jīng)成為肺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。目前臨床診斷肺癌時(shí)大多數(shù)患者已是中晚期，治療效果差。因此，尋找新的TM已成為新的研究熱點(diǎn)。TM是腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中由腫瘤細(xì)胞自身合成、釋放或者由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的一類物質(zhì)。近年來有研究顯示，一種新的TM即膜聯(lián)蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)在肺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用［1］。但是研究對(duì)象多為單一肺癌活檢標(biāo)本，針對(duì)AnnexinⅡ在不同標(biāo)本中的表達(dá)少見有報(bào)道。本研究對(duì)肺癌組織、肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、胸腔積液中的AnnexinⅡ進(jìn)行檢測，以探討其在肺癌診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年10月—2011年10月蘭州大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的肺癌伴胸腔積液患者60例作為試驗(yàn)組，其中男31例，女29例;年齡40～78歲，平均 (55.0±7.4)歲;均經(jīng)支氣管鏡、胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查、胸腔鏡檢查或術(shù)后病理檢查等確診為非小細(xì)胞肺癌。同時(shí)選取該科室結(jié)核性滲出性胸腔積液60例作為對(duì)照組，其中男30例，女30例;年齡 33～81歲，平均 (52.0±7.8)歲;經(jīng)痰抗酸染色找到結(jié)核菌3例，其余患者均經(jīng)胸腔鏡病理檢查證實(shí)。兩組患者的性別構(gòu)成、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=0.017，P=0.855;t=0.000，P=1.000)。

1.2 主要儀器及試劑 AnnexinⅡ試劑盒 (上海博古生物科技有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)試劑，酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司，型號(hào):SUNRISE A－5082)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司，型號(hào):CT14RD);DAB(ZLI－9017)試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。AnnexinⅡ兔抗人多克隆抗體 (BA0641，上海博士德有限公司)，工作濃度為1∶200;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(12062010，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，工作濃度為1∶100。

1.3 研究方法及觀察指標(biāo)

1.3.1 胸腔鏡檢查 依據(jù)2010年《英國胸科協(xié)會(huì)內(nèi)科胸腔鏡指南》［2］對(duì)所有患者進(jìn)行胸腔鏡檢查，同時(shí)留取胸腔積液用于測定AnnexinⅡ水平。

1.3.2 肺癌組織的收集、處理及判讀肺癌組織來源于試驗(yàn)組患者的蠟塊標(biāo)本，但其切片用于臨床診斷后部分切片已經(jīng)無法繼續(xù)使用，最終留下48例患者的蠟塊標(biāo)本待用;正常肺組織來源于該院病理科提供的18例正常肺組織蠟塊標(biāo)本。肺癌組織經(jīng)100 ml/L甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)脫水后，制成4 μm厚切片，采用免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色法按SP法操作進(jìn)行。染色前肺癌組織進(jìn)行微波高溫抗原修復(fù)，一抗4℃過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，中性樹膠封片。以磷酸鹽緩沖液 (PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，其余步驟相同;AnnexinⅡ陽性切片作為陽性對(duì)照。AnnexinⅡ陽性染色呈棕黃色或棕褐色，在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，但以胞質(zhì)表達(dá)為主。參照文獻(xiàn) ［3］判斷免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，每例在顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野，記錄癌細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞百分率:(1)顯色細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5% ～25%為1分，＞25% ～50%為2分，＞50%為3分;(2)顯色程度無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將每例的顯色細(xì)胞數(shù)積分和顯色程度積分相乘，兩者乘積≤1分為免疫組織化學(xué)反應(yīng)陰性，2～3分為弱陽性 (低表達(dá))，4～6分為陽性 (中表達(dá))，＞6分為強(qiáng)陽性 (高表達(dá))。結(jié)果中低表達(dá)、中表達(dá)、高表達(dá)均為陽性表達(dá)。

1.3.3 BALF的收集和處理 按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)2002年《支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)規(guī)范 (草案)》［4］對(duì)所有患者行支氣管肺泡灌洗術(shù)并取得BALF。采用ELISA法檢測BALF中AnnexinⅡ的表達(dá)水平。

1.3.4 胸腔積液的收集和處理 對(duì)所有患者抽取的胸腔積液于30 min內(nèi)在離心機(jī)4℃的環(huán)境下以2 000 r/min離心15 min，離心半徑為10 cm。取細(xì)胞懸液5 ml于微量離心管中，加RNA酶抑制劑后，置于－70℃保存待測。采用ELISA法檢測胸腔積液中AnnexinⅡ的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以 ()表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AnnexinⅡ在正常組織和肺癌組織中的表達(dá) 肺癌組織中AnnexinⅡ的陽性表達(dá)率(62.5%)高于正常肺組織(16.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。AnnexinⅡ在肺鱗癌、肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，但以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主 (見圖1)。

表1 AnnexinⅡ在肺正常組織與肺癌組織中的表達(dá) (例)Table 1 The expression of AnnexinⅡin normal lung tissue and lung cancer tissue

2.2 AnnexinⅡ在肺癌組織中的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性分析 AnnexinⅡ在肺癌組織中的表達(dá)與患者的性別、吸煙與否、癌細(xì)胞分化程度及病理分型無關(guān)(P＞0.05);與病理分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān) (P＜0.05，見表2)。

2.3 試驗(yàn)組和對(duì)照組BALF和胸腔積液中AnnexinⅡ的表達(dá) 試驗(yàn)組患者BALF、胸腔積液中AnnexinⅡ的表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。兩組BALF中AnnexinⅡ的表達(dá)水平分別高于各自組內(nèi)胸腔積液中AnnexinⅡ的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表3)。

表3 試驗(yàn)組和對(duì)照組BALF和胸腔積液中AnnexinⅡ的表達(dá)水平比較 (，ng/L)Table 3 Comparison of the expression levels of AnnexinⅡin bronchoalveolar lavage fluid and pleural effusion between the two groups

表3 試驗(yàn)組和對(duì)照組BALF和胸腔積液中AnnexinⅡ的表達(dá)水平比較 (，ng/L)Table 3 Comparison of the expression levels of AnnexinⅡin bronchoalveolar lavage fluid and pleural effusion between the two groups

注:BALF=肺泡灌洗液;與 BALF比較，▲P＜0.05

組別 例數(shù) AnnexinⅡBALF 胸腔積液對(duì)照組 60 35.99± 6.06 6.95±1.95▲試驗(yàn)組 60 77.92±33.87 15.77±2.26▲t 0.001 0.000 3.841 4.064 P值值

3 討論

AnnexinⅡ是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，屬于膜聯(lián)蛋白家族的一員。其表達(dá)定位于內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和各種類型的腫瘤細(xì)胞。AnnexinⅡ的C末端可以結(jié)合鈣離子，磷脂以及肌動(dòng)蛋白，但是結(jié)合有賴于N末端的3個(gè)位點(diǎn)，即 Tyr23、Ser11、Ser25的磷酸化。N末端有磷酸化和乙?；揎椢稽c(diǎn)，N末端的前14個(gè)氨基酸殘基可以結(jié)合p11蛋白 (S100A10)。AnnexinⅡ有單體、異二聚體、異四聚體3種存在形式。異四聚體由蛋白質(zhì)配體P11蛋白首先自身形成同源二聚體，再和兩分子的AnnexinⅡ單體結(jié)合形成。異四聚體被證明是其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要形式。編碼人類AnnexinⅡ的基因 (大約40 kb)定位于人類染色體15q21，而這一區(qū)域被發(fā)現(xiàn)與晚期乳腺癌的等位基因的不平衡有關(guān)［5］。1990 年 Frohlich 等［6］首次報(bào)道 AnnexinⅡ的表達(dá)水平升高與肝癌的發(fā)生相關(guān)，但是研究對(duì)象為單一樣本。如今多數(shù)學(xué)者主張多TM聯(lián)合檢測以提高肺癌診斷的準(zhǔn)確率［7－8］。

眾多研究顯示，AnnexinⅡ在多種疾病以及癌癥中均有異常表達(dá)且與癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為以及預(yù)后密切相關(guān)［9－13］。 張洵等［14］研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinⅡ在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)且與鱗狀細(xì)胞的分化程度成正相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinⅡ在前列腺癌中表達(dá)缺失，抑制前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移但不影響前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡［15］。目前對(duì)AnnexinⅡ在各種癌細(xì)胞中的表達(dá)情況報(bào)道較多，但對(duì)其在肺癌中的表達(dá)情況報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinⅡ在肺癌細(xì)胞中的陽性表達(dá)率為62.5%，高于正常肺組織的16.6%;AnnexinⅡ在肺癌組織中表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，且以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主。而在宮頸癌以及腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞膜表達(dá)為主［16］?？紤]是由于肺癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較多AnnexinⅡ底物存在所導(dǎo)致。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，AnnexinⅡ的表達(dá)與非肺癌患者的病理分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。曾有學(xué)者對(duì)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺鱗癌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinⅡ的表達(dá)量在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺鱗癌組織樣本中顯著升高［17］，提示AnnexinⅡ表達(dá)的升高可能與癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究顯示，AnnexinⅡ在調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成的纖溶蛋白酶原激活系統(tǒng)中發(fā)揮著重要功能，AnnexinⅡ和組織型纖溶酶原激活劑(t－PA)相互作用介導(dǎo)了血纖維蛋白酶原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白酶，促進(jìn)了基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)的激活和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解，激活的MMP幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲作用［18－19］。說明 AnnexinⅡ在肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著一定作用。

圖1 AnnexinⅡ在肺癌中的表達(dá) (免疫組織化學(xué)染色，×400)Figure 1 The expression of AnnexinⅡin lung cancer

表2 AnnexinⅡ在肺癌組織中的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性分析〔n(%)〕Table 2 Correlation of AnnexinⅡexpression and clinicopathological factors in lung cancer tissue

AnnexinⅡ作為一種TM，其由腫瘤細(xì)胞合成釋放。因此，肺癌在發(fā)生發(fā)展過程中會(huì)釋放AnnexinⅡ到鄰近組織、體液以及血液循環(huán)中。本研究顯示，試驗(yàn)組患者BALF中AnnexinⅡ的表達(dá)水平高于對(duì)照組患者。當(dāng)支氣管肺泡上皮發(fā)生惡變的時(shí)候，產(chǎn)生和釋放出的TM使患者支氣管肺泡表面被覆液中相應(yīng)物質(zhì)發(fā)生量和質(zhì)的改變并隨局部循環(huán)進(jìn)入血清。因此，在臨床上檢測疑似肺癌患者血清中的TM，如癌胚抗原 (CEA)、水溶性細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片段(CA211)、卵巢癌抗原(CA125)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)等，用以輔助判斷癌細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移或者對(duì)疑似癌患者進(jìn)行篩查。BALF直接來源于氣道，而血清TM為腫瘤進(jìn)一步發(fā)展后的間接來源。當(dāng)肺部發(fā)生癌變時(shí)，癌細(xì)胞分泌或代謝產(chǎn)生的TM首先排泄到癌細(xì)胞表面進(jìn)入局部支氣管肺泡內(nèi)，然后再吸收進(jìn)入血液循環(huán)中，再被血液稀釋，其水平進(jìn)一步下降。且在疾病早期TM產(chǎn)生量較少時(shí)，其在血清中水平低，難以檢出，而BALF取自病變局部的支氣管肺泡內(nèi)，因此BALF中腫瘤標(biāo)志物比血清中出現(xiàn)早，水平更高。而對(duì)于胸腔積液產(chǎn)生和吸收的機(jī)制早已達(dá)成共識(shí)，即胸腔積液是由于壓力梯度從壁層和臟層胸膜的體循環(huán)血管通過有滲透性的胸膜進(jìn)入胸膜腔，然后通過壁層胸膜的淋巴管微孔經(jīng)淋巴管吸收。由于TM作為一種生物活性物質(zhì)在體內(nèi)會(huì)隨機(jī)體的代謝而其水平逐漸降低。因而認(rèn)為胸腔積液中的TM水平應(yīng)低于血清中的TM水平。本研究顯示，BALF中AnnexinⅡ的表達(dá)水平高于胸腔積液。目前臨床對(duì)胸腔積液的診斷主要依靠常規(guī)細(xì)胞學(xué)分析，但單純依靠形態(tài)學(xué)來鑒別腫瘤的敏感度較低，尤其是當(dāng)胸腔積液內(nèi)的癌細(xì)胞異型性不明顯和/或數(shù)量較少時(shí)，往往會(huì)同反應(yīng)性間皮細(xì)胞相混淆，致使臨床上經(jīng)常出現(xiàn)對(duì)高度可疑的肺癌性胸腔積液檢測時(shí)，其反復(fù)細(xì)胞學(xué)檢查為陰性結(jié)果，但對(duì)于胸腔積液中TM的檢測不會(huì)出現(xiàn)像細(xì)胞學(xué)檢測那樣因?yàn)閻盒约?xì)胞少或與間皮細(xì)胞混淆或因人為經(jīng)驗(yàn)判斷失誤而出現(xiàn)的假陰性結(jié)果。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)組胸腔積液中AnnexinⅡ的表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示可將AnnexinⅡ用于良惡性胸腔積液的鑒別診斷。

綜上所述，本研究表明AnnexinⅡ在肺癌患者BALF、胸腔積液以及肺癌組織中均有較高的表達(dá)。因此，在BALF、胸腔積液中檢測AnnexinⅡ，可作為有價(jià)值的TM，對(duì)鑒別診斷具有臨床價(jià)值。且試驗(yàn)組以及對(duì)照組BALF中AnnexinⅡ的表達(dá)均高于胸腔積液中的表達(dá)，提示對(duì)BALF中AnnexinⅡ的檢測可能優(yōu)于對(duì)胸腔積液中的檢測。因此，在對(duì)肺癌的診斷中將BALF中AnnexinⅡ作為TM的檢測具有更高的敏感度，是一種理想的針對(duì)肺癌診斷的TM。

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