膜聯蛋白Ⅱ在肺癌組織、肺泡灌洗液和胸腔積液中的表達水平及在肺癌診斷中的價值研究

岳紅梅，顧 峰，倪志宏，李 佳，高莉萍

肺癌已經成為一種增長快、死亡率高且發(fā)病年齡日趨年輕化的惡性腫瘤。尋找理想的腫瘤標記物 (tumor marker，TM)用于肺癌的早期診斷，并能夠早治療已經成為肺癌患者預后的關鍵。目前臨床診斷肺癌時大多數患者已是中晚期，治療效果差。因此，尋找新的TM已成為新的研究熱點。TM是腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中由腫瘤細胞自身合成、釋放或者由機體對腫瘤細胞反應而產生的一類物質。近年來有研究顯示，一種新的TM即膜聯蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)在肺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移中發(fā)揮著重要作用［1］。但是研究對象多為單一肺癌活檢標本，針對AnnexinⅡ在不同標本中的表達少見有報道。本研究對肺癌組織、肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、胸腔積液中的AnnexinⅡ進行檢測，以探討其在肺癌診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年10月—2011年10月蘭州大學第一醫(yī)院呼吸內科收治的肺癌伴胸腔積液患者60例作為試驗組，其中男31例，女29例;年齡40～78歲，平均 (55.0±7.4)歲;均經支氣管鏡、胸腔積液脫落細胞學檢查、胸腔鏡檢查或術后病理檢查等確診為非小細胞肺癌。同時選取該科室結核性滲出性胸腔積液60例作為對照組，其中男30例，女30例;年齡 33～81歲，平均 (52.0±7.8)歲;經痰抗酸染色找到結核菌3例，其余患者均經胸腔鏡病理檢查證實。兩組患者的性別構成、年齡比較，差異無統計學意義 (χ2=0.017，P=0.855;t=0.000，P=1.000)。

1.2 主要儀器及試劑 AnnexinⅡ試劑盒 (上海博古生物科技有限公司)，酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)試劑，酶標儀(奧地利TECAN公司，型號:SUNRISE A－5082)、臺式高速冷凍離心機 (上海天美生化儀器設備工程有限公司，型號:CT14RD);DAB(ZLI－9017)試劑盒(北京中衫金橋生物技術有限公司)。AnnexinⅡ兔抗人多克隆抗體 (BA0641，上海博士德有限公司)，工作濃度為1∶200;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(12062010，北京康為世紀生物科技有限公司)，工作濃度為1∶100。

1.3 研究方法及觀察指標

1.3.1 胸腔鏡檢查 依據2010年《英國胸科協會內科胸腔鏡指南》［2］對所有患者進行胸腔鏡檢查，同時留取胸腔積液用于測定AnnexinⅡ水平。

1.3.2 肺癌組織的收集、處理及判讀肺癌組織來源于試驗組患者的蠟塊標本，但其切片用于臨床診斷后部分切片已經無法繼續(xù)使用，最終留下48例患者的蠟塊標本待用;正常肺組織來源于該院病理科提供的18例正常肺組織蠟塊標本。肺癌組織經100 ml/L甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)脫水后，制成4 μm厚切片，采用免疫組織化學染色。免疫組織化學染色法按SP法操作進行。染色前肺癌組織進行微波高溫抗原修復，一抗4℃過夜，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，中性樹膠封片。以磷酸鹽緩沖液 (PBS)代替一抗作為陰性對照，其余步驟相同;AnnexinⅡ陽性切片作為陽性對照。AnnexinⅡ陽性染色呈棕黃色或棕褐色，在細胞膜和細胞質中均有表達，但以胞質表達為主。參照文獻 ［3］判斷免疫組織化學染色結果，每例在顯微鏡下隨機觀察5個高倍鏡視野，記錄癌細胞中染色陽性細胞百分率:(1)顯色細胞數＜5%為0分，5% ～25%為1分，＞25% ～50%為2分，＞50%為3分;(2)顯色程度無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將每例的顯色細胞數積分和顯色程度積分相乘，兩者乘積≤1分為免疫組織化學反應陰性，2～3分為弱陽性 (低表達)，4～6分為陽性 (中表達)，＞6分為強陽性 (高表達)。結果中低表達、中表達、高表達均為陽性表達。

1.3.3 BALF的收集和處理 按照中華醫(yī)學會2002年《支氣管肺泡灌洗液細胞學檢測技術規(guī)范 (草案)》［4］對所有患者行支氣管肺泡灌洗術并取得BALF。采用ELISA法檢測BALF中AnnexinⅡ的表達水平。

1.3.4 胸腔積液的收集和處理 對所有患者抽取的胸腔積液于30 min內在離心機4℃的環(huán)境下以2 000 r/min離心15 min，離心半徑為10 cm。取細胞懸液5 ml于微量離心管中，加RNA酶抑制劑后，置于－70℃保存待測。采用ELISA法檢測胸腔積液中AnnexinⅡ的表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以 ()表示，采用兩獨立樣本t檢驗;計數資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AnnexinⅡ在正常組織和肺癌組織中的表達 肺癌組織中AnnexinⅡ的陽性表達率(62.5%)高于正常肺組織(16.6%)，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表1)。AnnexinⅡ在肺鱗癌、肺腺癌細胞的細胞膜與細胞質中均有表達，但以細胞質表達為主 (見圖1)。

表1 AnnexinⅡ在肺正常組織與肺癌組織中的表達 (例)Table 1 The expression of AnnexinⅡin normal lung tissue and lung cancer tissue

2.2 AnnexinⅡ在肺癌組織中的表達與臨床病理因素的相關性分析 AnnexinⅡ在肺癌組織中的表達與患者的性別、吸煙與否、癌細胞分化程度及病理分型無關(P＞0.05);與病理分期以及淋巴結轉移有關 (P＜0.05，見表2)。

2.3 試驗組和對照組BALF和胸腔積液中AnnexinⅡ的表達 試驗組患者BALF、胸腔積液中AnnexinⅡ的表達水平高于對照組，差異有統計學意義 (P＜0.05)。兩組BALF中AnnexinⅡ的表達水平分別高于各自組內胸腔積液中AnnexinⅡ的表達水平，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表3)。

表3 試驗組和對照組BALF和胸腔積液中AnnexinⅡ的表達水平比較 (，ng/L)Table 3 Comparison of the expression levels of AnnexinⅡin bronchoalveolar lavage fluid and pleural effusion between the two groups

表3 試驗組和對照組BALF和胸腔積液中AnnexinⅡ的表達水平比較 (，ng/L)Table 3 Comparison of the expression levels of AnnexinⅡin bronchoalveolar lavage fluid and pleural effusion between the two groups

注:BALF=肺泡灌洗液;與 BALF比較，▲P＜0.05

組別 例數 AnnexinⅡBALF 胸腔積液對照組 60 35.99± 6.06 6.95±1.95▲試驗組 60 77.92±33.87 15.77±2.26▲t 0.001 0.000 3.841 4.064 P值值

3 討論

AnnexinⅡ是一種鈣離子依賴的磷脂結合蛋白，屬于膜聯蛋白家族的一員。其表達定位于內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、神經細胞和各種類型的腫瘤細胞。AnnexinⅡ的C末端可以結合鈣離子，磷脂以及肌動蛋白，但是結合有賴于N末端的3個位點，即 Tyr23、Ser11、Ser25的磷酸化。N末端有磷酸化和乙?；揎椢稽c，N末端的前14個氨基酸殘基可以結合p11蛋白 (S100A10)。AnnexinⅡ有單體、異二聚體、異四聚體3種存在形式。異四聚體由蛋白質配體P11蛋白首先自身形成同源二聚體，再和兩分子的AnnexinⅡ單體結合形成。異四聚體被證明是其發(fā)揮生物學效應的主要形式。編碼人類AnnexinⅡ的基因 (大約40 kb)定位于人類染色體15q21，而這一區(qū)域被發(fā)現與晚期乳腺癌的等位基因的不平衡有關［5］。1990 年 Frohlich 等［6］首次報道 AnnexinⅡ的表達水平升高與肝癌的發(fā)生相關，但是研究對象為單一樣本。如今多數學者主張多TM聯合檢測以提高肺癌診斷的準確率［7－8］。

眾多研究顯示，AnnexinⅡ在多種疾病以及癌癥中均有異常表達且與癌細胞的侵襲轉移等生物學行為以及預后密切相關［9－13］。 張洵等［14］研究發(fā)現，AnnexinⅡ在食管鱗狀細胞癌中高表達且與鱗狀細胞的分化程度成正相關。還有研究發(fā)現，AnnexinⅡ在前列腺癌中表達缺失，抑制前列腺癌細胞的轉移但不影響前列腺癌細胞的增殖和凋亡［15］。目前對AnnexinⅡ在各種癌細胞中的表達情況報道較多，但對其在肺癌中的表達情況報道較少。本研究發(fā)現，AnnexinⅡ在肺癌細胞中的陽性表達率為62.5%，高于正常肺組織的16.6%;AnnexinⅡ在肺癌組織中表達于細胞膜和細胞質，且以細胞質表達為主。而在宮頸癌以及腎透明細胞癌中的表達定位于細胞膜和細胞質，以細胞膜表達為主［16］?？紤]是由于肺癌細胞質內有較多AnnexinⅡ底物存在所導致。同時本研究還發(fā)現，AnnexinⅡ的表達與非肺癌患者的病理分期以及淋巴結轉移有關。曾有學者對有無淋巴結轉移的肺鱗癌進行研究發(fā)現，AnnexinⅡ的表達量在有淋巴結轉移的肺鱗癌組織樣本中顯著升高［17］，提示AnnexinⅡ表達的升高可能與癌細胞的淋巴結轉移有關。有研究顯示，AnnexinⅡ在調控腫瘤轉移和腫瘤血管生成的纖溶蛋白酶原激活系統中發(fā)揮著重要功能，AnnexinⅡ和組織型纖溶酶原激活劑(t－PA)相互作用介導了血纖維蛋白酶原轉化為纖維蛋白酶，促進了基質金屬蛋白酶 (MMP)的激活和細胞外基質(ECM)的降解，激活的MMP幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，從而增強腫瘤細胞的遷移和侵襲作用［18－19］。說明 AnnexinⅡ在肺癌的侵襲轉移過程中可能發(fā)揮著一定作用。

圖1 AnnexinⅡ在肺癌中的表達 (免疫組織化學染色，×400)Figure 1 The expression of AnnexinⅡin lung cancer

表2 AnnexinⅡ在肺癌組織中的表達與臨床病理因素的相關性分析〔n(%)〕Table 2 Correlation of AnnexinⅡexpression and clinicopathological factors in lung cancer tissue

AnnexinⅡ作為一種TM，其由腫瘤細胞合成釋放。因此，肺癌在發(fā)生發(fā)展過程中會釋放AnnexinⅡ到鄰近組織、體液以及血液循環(huán)中。本研究顯示，試驗組患者BALF中AnnexinⅡ的表達水平高于對照組患者。當支氣管肺泡上皮發(fā)生惡變的時候，產生和釋放出的TM使患者支氣管肺泡表面被覆液中相應物質發(fā)生量和質的改變并隨局部循環(huán)進入血清。因此，在臨床上檢測疑似肺癌患者血清中的TM，如癌胚抗原 (CEA)、水溶性細胞角質蛋白19片段(CA211)、卵巢癌抗原(CA125)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)等，用以輔助判斷癌細胞是否發(fā)生轉移或者對疑似癌患者進行篩查。BALF直接來源于氣道，而血清TM為腫瘤進一步發(fā)展后的間接來源。當肺部發(fā)生癌變時，癌細胞分泌或代謝產生的TM首先排泄到癌細胞表面進入局部支氣管肺泡內，然后再吸收進入血液循環(huán)中，再被血液稀釋，其水平進一步下降。且在疾病早期TM產生量較少時，其在血清中水平低，難以檢出，而BALF取自病變局部的支氣管肺泡內，因此BALF中腫瘤標志物比血清中出現早，水平更高。而對于胸腔積液產生和吸收的機制早已達成共識，即胸腔積液是由于壓力梯度從壁層和臟層胸膜的體循環(huán)血管通過有滲透性的胸膜進入胸膜腔，然后通過壁層胸膜的淋巴管微孔經淋巴管吸收。由于TM作為一種生物活性物質在體內會隨機體的代謝而其水平逐漸降低。因而認為胸腔積液中的TM水平應低于血清中的TM水平。本研究顯示，BALF中AnnexinⅡ的表達水平高于胸腔積液。目前臨床對胸腔積液的診斷主要依靠常規(guī)細胞學分析，但單純依靠形態(tài)學來鑒別腫瘤的敏感度較低，尤其是當胸腔積液內的癌細胞異型性不明顯和/或數量較少時，往往會同反應性間皮細胞相混淆，致使臨床上經常出現對高度可疑的肺癌性胸腔積液檢測時，其反復細胞學檢查為陰性結果，但對于胸腔積液中TM的檢測不會出現像細胞學檢測那樣因為惡性細胞少或與間皮細胞混淆或因人為經驗判斷失誤而出現的假陰性結果。同時本研究還發(fā)現，在試驗組胸腔積液中AnnexinⅡ的表達水平高于對照組，提示可將AnnexinⅡ用于良惡性胸腔積液的鑒別診斷。

綜上所述，本研究表明AnnexinⅡ在肺癌患者BALF、胸腔積液以及肺癌組織中均有較高的表達。因此，在BALF、胸腔積液中檢測AnnexinⅡ，可作為有價值的TM，對鑒別診斷具有臨床價值。且試驗組以及對照組BALF中AnnexinⅡ的表達均高于胸腔積液中的表達，提示對BALF中AnnexinⅡ的檢測可能優(yōu)于對胸腔積液中的檢測。因此，在對肺癌的診斷中將BALF中AnnexinⅡ作為TM的檢測具有更高的敏感度，是一種理想的針對肺癌診斷的TM。

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