間隙連接蛋白43和磷脂酰肌醇3－激酶在胃癌組織中的表達及其相關(guān)性研究

程 玉，潘理會，劉海旺，李春輝

細胞間隙連接通訊 (GJIC)是由相鄰細胞間通過間隙連接所介導(dǎo)的一種通訊方式，其通道的主要成分是間隙連接蛋白，其中間隙連接蛋白43(Cx43)是目前研究最廣泛的連接蛋白［1－2］。磷脂酰肌醇 3－ 激酶(PI3K)存在于細胞質(zhì)的復(fù)合體，是磷脂激酶家族中的重要成員，在磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號傳導(dǎo)通路中是始動因子，并且在蛋白激酶B(Akt)的激活過程中起著十分重要的作用。PI3K/Akt信號通路的活化可促進細胞的增殖，并促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［3－4］。本研究通過檢測正常胃組織與胃癌組織中Cx43與PI3K的表達，分析胃癌組織中Cx43與PI3K的關(guān)系，以探討細胞間信號傳導(dǎo)與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的作用，從而為探索胃癌的發(fā)生機制提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2012年7月—2013年2月行手術(shù)切除癌組織的胃癌患者60例，其中男48例，女12例;年齡45～77歲，平均 (58.5±10.0)歲;中～高分化者24例，低分化者36例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例;Ⅰ/Ⅱ期者28例，Ⅲ/Ⅳ者32例;癌組織穿透漿膜者48例，未穿透漿膜者12例?；颊咝g(shù)前均未行放化療治療，術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查證實為胃腺癌，且相應(yīng)癌旁組織均未見有癌細胞累及。

1.2 試劑與儀器 鼠抗人Cx43抗體 (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，兔抗人PI3K(P85α亞型)濃縮型多克隆抗體 (工作濃度均為1∶100，武漢博士德生物工程有限公司)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT－PCR)試劑盒及DNA Marker(大連寶生物工程有限公司)，PCR引物 (北京賽百盛基因技術(shù)有限公司設(shè)計合成)。Cx43基因上游引物為:5'－TCTCGCCTATGTCTCCTCCTGG－3'，下游引物為:5'－AGTTAGAGATGGTGCTTCCCGC－3'，擴增片段為156 bp;P85α亞型基因上游引物為:5'－TGCTATGCCTGCTCTGTAGTGGT－3'，下游引物為:5'－GTGTGACATTGAGGGAGTCGTTG－3'，擴增片段為175 bp;內(nèi)參基因 (β－actin)上游引物為:5'－A GCGGGAAATCGTGCGTGAC－3'，下游引物為:5'－ACATCTGCTGGAAGGTGGAC－3'，擴增片段為453 bp。

1.3 研究方法

1.3.1 標本采集 收集手術(shù)切除的胃癌組織60份，并收集患者距癌邊緣10 cm以上的正常胃組織25份。所有標本離體后立即平均分為兩份，一份在離體后30 min內(nèi)儲存于－80℃冰箱里待用;另一分離體后立即置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.3.2 免疫組織化學(xué)方法 標本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片 (4 μm厚)，切片以二甲苯脫蠟及系列乙醇脫水;PBS緩沖液沖洗5 min后，以3%H2O2孵育10 min(室溫);PBS緩沖液沖洗6 min/次，沖洗2次后，在微波爐中進行抗原修復(fù);加Cx43、PI3K抗體，在37℃濕盒中溫育60 min后，在濕盒中4℃過夜;PBS緩沖液洗5 min/次，沖洗3次后，滴加Ⅱ抗快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育15 min;PBS緩沖液沖洗5 min/次，沖洗3次后，使用二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)顯色5 min;蒸餾水沖洗終止顯色后，蘇木素復(fù)染細胞核;封片，顯微鏡下觀察。另外，用PBS緩沖液替代Cx43和PI3K抗體，其余染色步驟相同，制作切片作為陰性對照;用已知正常胃組織的陽性切片作為陽性對照。Cx43陽性表達染色呈黃色至棕黃色，在正常胃組織中主要表達于細胞膜，在胃癌組織中主要表達于細胞質(zhì)。PI3K陽性表達染色呈黃色至棕黃色，主要表達于細胞質(zhì)。在染色均勻的區(qū)域，選取5個高倍鏡視野 (×400倍):(1)按陽性細胞百分率 (A值)評分:1%～25%為1分，26% ～50%為2分，＞50%為3分;(2)按染色強度 (B值)評分:不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項得分相加≤2分為陰性，＞2分為陽性。

1.3.3 RT－PCR 采用Triozol試劑盒分別提取胃癌及正常胃組織的RNA，分析其完整性、純度和濃度，并作RT－PCR檢測。Cx43的循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、58℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min，共循環(huán)35次;72℃延伸5 min。PI3K的循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、58℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min，共循環(huán)35次;72℃延伸5 min。β－actin的循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、55℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min，共循環(huán)30次;72℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進行定性檢測，相應(yīng)位點出現(xiàn)單一電泳條帶為陽性表達。以β－actin作為內(nèi)參照，電泳結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行光密度測定。

1.4 觀察指標 比較正常胃組織及胃癌組織中Cx43、PI3K的陽性表達率，Cx43 mRNA、PI3K mRNA的相對表達量 (通過計算Cx43 mRNA、PI3K mRNA與β－actin產(chǎn)物的光密度比值得出)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以 ()表示，采用兩獨立樣本t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗;相關(guān)性分析采用2×2列表資料的χ2檢驗，并計算Pearson列聯(lián)系數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cx43、PI3K在胃癌組織和正常胃組織中的表達情況 Cx43在胃癌組織中的陽性表達率為33.3% (20/60)，低于在正常胃組織中的陽性表達率100.0%(25/25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=31.48，P=0.00)。PI3K在胃癌組織中的陽性表達率為86.7%(52/60)，高于在正常胃組織中的陽性表達率20.0%(5/25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=35.50，P=0.00)。Cx43、PI3K在胃癌組織和正常胃組織中的表達情況見圖1～2。

2.2 不同臨床病理特征患者胃癌組織Cx43、PI3K的表達情況 胃癌組織中Cx43、PI3K的表達與胃癌的分化程度、臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān) (P＜0.05)。Cx43在中～高分化胃癌組織中的陽性表達率高于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的陽性表達率高于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的陽性表達率低于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的陽性表達率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。PI3K在中～高分化胃癌組織中的陽性表達率低于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的陽性表達率低于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的陽性表達率高于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

2.3 Cx43 mRNA、PI3K mRNA在胃癌組織和正常胃組織中的表達情況 胃癌組織中Cx43 mRNA的相對表達量為 (0.53±0.07)，低于正常胃組織的 (0.71±0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=12.76，P=0.00)。胃癌組織中PI3K mRNA的相對表達量為 (0.56±0.20)，高于正常胃組織的 (0.31±0.26)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=4.79，P=0.00)。Cx43 mRNA、PI3K mRNA電泳定性檢測結(jié)果見圖3～4。

圖1 Cx43在胃組織中的表達 (免疫組化染色，×200)Figure 1 Cx43 positive expression in gastric mucosa

圖2 PI3K在胃組織中的表達 (免疫組化染色，×200)Figure 2 PI3K positive expression in gastric mucosa

表1 不同臨床病理特征患者胃癌組織Cx43、PI3K的表達情況〔n(%)〕Table 1 Cx43 and PI3K expression of gastric carcinoma in patients with diffirent clinical features

圖3 Cx43 mRNA電泳圖Figure 3 The electrophoresis of Cx43 mRNA

圖4 PI3K mRNA電泳圖Figure 4 The electrophoresis of PI3K mRNA

2.4 不同臨床病理特征患者胃癌組織Cx43 mRNA、PI3K mRNA的表達情況 Cx43 mRNA、PI3K mRNA的相對表達量與胃癌的分化程度、臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān) (P＜0.05)。Cx43 mRNA在中～高分化胃癌組織中的相對表達量高于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的相對表達量高于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的相對表達量低于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的相對表達量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。PI3K mRNA在中～高分化胃癌組織中的相對表達量低于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的相對表達量低于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的相對表達量高于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的相對表達量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表2)。

表2 不同臨床病理特征患者胃癌組織Cx43 mRNA、PI3K mRNA的表達情況 ()Table 2 Cx43 mRNA and PI3K mRNA expression of gastric carcinoma in diffirent clinical features

表2 不同臨床病理特征患者胃癌組織Cx43 mRNA、PI3K mRNA的表達情況 ()Table 2 Cx43 mRNA and PI3K mRNA expression of gastric carcinoma in diffirent clinical features

病理特征 例數(shù) Cx43 mRNA t值 P值 PI3K mRNA t值 P值分化程度4.47 0.00 2.44 0.03中～高分化 24 0.57±0.07 0.47±0.17低分化 36 0.48±0.05 0.65±0.19臨床分期 5.66 0.00 5.13 0.00Ⅰ/Ⅱ期 28 0.56±0.06 0.44±0.09Ⅲ/Ⅳ期 32 0.46±0.05 0.76±0.17浸潤深度 5.32 0.00 2.54 0.02穿透漿膜 48 0.45±0.06 0.68±0.21未穿透漿膜 12 0.55±0.06 0.49±0.16淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 4.63 0.00 3.71 0.00是35 0.45±0.05 0.77±0.21否25 0.55±0.06 0.49±0.14

2.5 胃癌組織中Cx43與PI3K表達的相關(guān)性分析 胃癌組織中Cx43與PI3K的表達呈負相關(guān) (P＜0.05，見表3)。

表3 胃癌組織中Cx43與PI3K表達的相關(guān)性分析 (例)Table 3 Correlation between Cx43 and PI3K expression in gastric carcinoma

3 討論

Cx43是連接蛋白家族中的重要一員，是構(gòu)成胃癌組織GJIC中主要的連接蛋白［5］。其對腫瘤生長的抑制被認為是通過間隙連接 (GJ)散發(fā)一些生長抑制因子，如通過PKA(蛋白激酶A)系統(tǒng)參與GJ依賴的生長抑制。Tang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細胞中與鄰近的正常細胞相比，Cx43的表達顯著降低;轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中Cx43較胃癌細胞中的Cx43表達顯著升高。提示Cx43的低表達可能促進了胃癌的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Cx43 mRNA的相對表達量低于正常胃組織;Cx43 mRNA在中～高分化胃癌組織中的相對表達量高于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的相對表達量高于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的相對表達量低于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的相對表達量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。提示Cx43可能與多種致癌因素共同參與了胃癌的發(fā)生，并影響了胃癌的生物學(xué)行為;且Cx43表達水平下降和間隙連接細胞間通訊功能異?？赡軈⑴c了胃癌惡性程度的進展和癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

當(dāng)上游信號刺激細胞膜表面時，胞膜產(chǎn)生的位點與PI3K結(jié)合可產(chǎn)生一些磷脂，激活其下游的主要靶酶Akt，活化的Akt(磷酸化Akt)可介導(dǎo)各種類型的細胞生長、分化以及癌細胞的侵襲和癌基因的表達［7］。本研發(fā)現(xiàn)，PI3K在胃癌組織中的陽性表達率 (86.7%)高于在正常胃組織中的陽性表達率 (20.0%)，PI3K mRNA在胃癌組織中的相對表達量也明顯高于正常胃組織。提示PI3K可能與胃癌的形成有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K在胃癌中的表達與分化程度、臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān);PI3K mRNA在中～高分化胃癌組織中的相對表達量低于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的相對表達量低于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的相對表達量高于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的相對表達量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。表明PI3K的表達與胃癌細胞的轉(zhuǎn)化過程以及癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān);且其表達水平升高提示其可能成為胃癌治療的潛在靶點。

PI3K主要由1個催化亞基P110和1個調(diào)節(jié)亞基P85 組成［8］。P85 又分為 P85α、P85β、P85γ 三種，其N末端含有1個SH3區(qū)和1個能與其他蛋白的SH3區(qū)結(jié)合的富含脯氨酸序列，其C末端含2個SH2區(qū)和1個位于2個SH2區(qū)之間可結(jié)合P110的結(jié)構(gòu)區(qū)。P110除具有磷脂酰肌醇激酶活性外，還具有絲/蘇氨酸 (Ser/Thr)蛋白激酶活性，可催化自身和其他接頭蛋白磷酸化。有文獻報道，血小板源性生長因子 (PDGF)能通過PI3K信號通路調(diào)節(jié)GJIC和Cx43的磷酸化過程，PI3K能調(diào)節(jié)PDGF誘導(dǎo)的蛋白激酶C(PKC)和絲裂原激活蛋白激酶途徑 (MAPK途徑)的過程［9］。已證實PKC途徑通過使Cx43的262和368位點磷酸化，而使GJ通道通訊功能下降［10］。MAPK途徑通過使 Cx43的255、279和282位點磷酸化，降低通道開放的頻率來抑制其通訊作用［11］。本研究結(jié)果表明，在胃癌組織中 Cx43與PI3K的表達呈負相關(guān)。這可能是由于PI3K通過激活各種信號分子，而這些信號分子引起Cx43磷酸化，從而破壞GJIC，導(dǎo)致細胞間生長相互控制減弱，細胞過分克隆生長所致。這種細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和細胞間信號傳導(dǎo)的相互作用可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的機制之一。

綜上所述，本研究從蛋白和基因水平證實了Cx43在胃癌組織中低表達，PI3K在胃癌組織中高表達。二者均參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。Cx43與PI3K的表達在胃癌中呈負相關(guān)，不排除與樣本量較小有關(guān)，因此其具體機制還有待于進一步研究。

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