血漿miR－21和miR－133a在缺血性心肌病中的表達(dá)水平及臨床價(jià)值研究

賀付成，呂 品，趙 雪，王 璽

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為18～25 nt的內(nèi)源性單鏈RNA，可通過(guò)降解靶mRNA或抑制其翻譯過(guò)程來(lái)負(fù)向調(diào)控基因的表達(dá)和蛋白的合成，參與多種病理、生理過(guò)程［1］。最新研究顯示，在不同疾病及病理狀態(tài)下一些miRNAs的改變可穩(wěn)定、特異地反映在血清或血漿中［1－2］。miRNA可通過(guò)分子生物學(xué)方法進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)定，并作為生物標(biāo)志物用于多種疾病的診斷、預(yù)后判斷等研究［3］。有報(bào)道顯示，miR－21在心肌肥大、心肌缺血及纖維化引起的心臟重構(gòu)中表達(dá)升高，并可調(diào)控心肌梗死后血管再生及心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡等多種心血管病理過(guò)程［4－6］。miR－133a在缺血性心力衰竭、大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型及心肌肥厚病理模型中表達(dá)均降低［7－9］，但作為心臟含量最豐富的miRNAs之一，其在急性冠脈綜合征引起的心肌損傷患者血漿中表達(dá)水平升高［10－11］。本研究旨在觀察缺血性心肌病 (ICM)患者血漿中miR－21和miR－133a的表達(dá)水平，并探索其在ICM病理生理機(jī)制中的意義，為揭示miRNAs在ICM臨床診療中的價(jià)值提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年9月—2013年5月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為ICM的患者48例為ICM組，另選擇該院健康志愿者30例為對(duì)照組。ICM的診斷參照2010年美國(guó)心臟協(xié)會(huì) (AHA)和美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACC)發(fā)布的心血管病診療指南［12］。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)美國(guó)紐約心臟病協(xié)會(huì) (NYHA)心功能分級(jí)Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí);(2)冠狀動(dòng)脈造影至少1支主要冠狀動(dòng)脈及其分支存在≥50%狹窄性病變;(3)心臟明顯擴(kuò)大及左心室射血分?jǐn)?shù) (LVEF)≤40%。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)冠心病及其并發(fā)癥 (室間隔穿孔、乳頭肌功能不全等);(2)其他心臟病引起的心臟擴(kuò)大和心力衰竭 (原發(fā)性心肌病、風(fēng)濕性心肌病、甲狀腺功能亢進(jìn)等);(3)ICM病史不明、惡性腫瘤、急慢性感染、腦血管疾病、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全。所有研究對(duì)象有知情同意權(quán)并經(jīng)倫理委員會(huì)同意。

1.2 主要試劑及儀器 RNA提取試劑TRI Reagent BD(美國(guó)MRC Gene公司產(chǎn));RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒 (日本TAKARA公司產(chǎn));Nano-Drop2000c紫外分光光度計(jì) (美國(guó)賽默飛世爾公司產(chǎn));7500 Fast Real－Time PCR儀 (美國(guó)ABI公司產(chǎn));羅氏C8000全自動(dòng)生化分析儀 (包括羅氏電化學(xué)發(fā)光試劑盒和羅氏酶比色法試劑盒)。

1.3 標(biāo)本收集及常規(guī)檢測(cè)指標(biāo) ICM患者入院后于次日 (＞12 h)晨時(shí)采集空腹肘靜脈血4 ml，采用羅氏酶比色法試劑盒測(cè)定血脂譜〔總膽固醇 (TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL－C)及高密度脂蛋白膽固醇 (HDL－C)〕、羅氏電化學(xué)發(fā)光試劑盒測(cè)定N末端B型腦鈉肽原 (NT－proBNP)水平，并留取空腹靜脈血3 ml置于乙二胺四乙酸二鉀 (EDTA－K2)抗凝管中，冰箱4℃保存待測(cè)血脂指標(biāo)。左心室舒張末期容積 (LVEDV)、LVEF于我院超聲科用心臟彩超檢測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法 (qRT－PCR)測(cè)定血漿中miR－21和miR－133a水平 取全血標(biāo)本3 000×g離心10 min，將血漿轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，再以12 000×g離心10 min，取200 μl血漿，用TRI Reagent BD試劑提取總RNA。NanoDrop2000c紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的水平和純度。選取吸光度比值為1.8～2.1的樣品用于后續(xù)試驗(yàn);按RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計(jì)與合成由廣州銳博公司完成。qRT－PCR總反應(yīng)體系為20 μl，包括:SYBR ? Premix Ex Taq Ⅱ (2 ×)10 μl，10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μl，ROX Reference DyeⅡ (50×)0.4 μl，cDNA 模板 2 μl，ddH2O 6 μl;循環(huán)參數(shù):95 ℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，用7500 Fast System SDS軟件計(jì)算Ct值，血漿miR －21和miR －133a的相對(duì)表達(dá)量用 2－ΔΔCt法計(jì)算［13］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以 ()表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù) (四分位數(shù)間距)〔M(QR)〕表示，組間比較采用Mann－Whitney U檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);連續(xù)、線(xiàn)性、正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Pearson相關(guān)分析，非正態(tài)或等級(jí)資料采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較 ICM組與對(duì)照組的性別、年齡、吸煙與否、是否患有糖尿病比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);而在是否行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表1)，兩組具有較好的可比性。

表1 兩組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data between the two groups

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較 ICM組LDL－C、HDL－C及LVEF低于對(duì)照組，TG、NT－proBNP及LVEDV高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);而兩組的舒張壓、收縮壓及TC比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見(jiàn)表2)。

2.3 血漿miR－21和miR－133a的表達(dá)水平 ICM組血漿miR－21、miR－133a水平 〔(8.10±2.93)、 (3.28±1.62)〕均高于對(duì)照組 〔(4.22±1.78)、 (1.37±2.84)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=－7.615、－6.98，P＜0.05)。

2.4 相關(guān)性分析 (1)Pearson和Spearman秩相關(guān)分析:ICM組血漿miR－21水平與LVEDV、NT－proBNP呈正相關(guān)關(guān)系 (P＜0.05)，而與年齡、LVEF、TC、TG、LDL－C、HDL－C無(wú)直線(xiàn)相關(guān)性 (P＞0.05);ICM患者血漿miR－133a水平與年齡、LVEDV、LVEF、TC、TG、LDL－C、HDL－C及NT－proBNP均無(wú)直線(xiàn)相關(guān)性 (P＞0.05，見(jiàn)表3)。 (2)偏相關(guān)分析:調(diào)整年齡、性別、吸煙史、糖尿病、高血壓及NT－proBNP水平等因素后，ICM組中血漿miR－21水平仍與LVEDV呈正相關(guān)關(guān)系 (r=0.334，P＜0.05)。

表2 兩組實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of laboratory parameters between the two groups

表3 ICM組miR－21和miR－133a與各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation of miR－21，miR－133a and laboratory parameters

3 討論

miRNAs是一類(lèi)由非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的單鏈小分子RNA，由于其廣泛存在于動(dòng)植物中，并可通過(guò)對(duì)相應(yīng)靶基因的調(diào)控參與眾多病理、生理過(guò)程，使其自1993年由Lee等首次報(bào)道后，迅速成為眾多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。已有大量研究表明，miRNAs在不同疾病及病理進(jìn)程中具有特定的表達(dá)譜，并可穩(wěn)定表達(dá)于外周循環(huán)血液中，這些特點(diǎn)使miRNAs可作為腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥等多種疾病診斷及預(yù)后判斷的重要生物標(biāo)志物［1－3］。miRNAs在心血管疾病診療中的作用也逐漸受到人們的重視。

ICM是由于冠狀動(dòng)脈狹窄閉塞，長(zhǎng)期慢性心肌缺血而導(dǎo)致的嚴(yán)重心肌功能障礙性疾病。長(zhǎng)期心肌缺血可造成心肌細(xì)胞壞死、凋亡，心肌頓抑或心肌冬眠，繼而引起心肌細(xì)胞數(shù)量減少、纖維組織增多以及病理性心室重構(gòu)。其潛在的嚴(yán)重心腦血管并發(fā)癥 (如心力衰竭和卒中)一直是人們關(guān)注和研究的焦點(diǎn)，而miRNAs類(lèi)內(nèi)源性因子在ICM中的作用及機(jī)制尚未系統(tǒng)闡明。已有研究顯示，多種miRNAs與ICM的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，如miR－126、miR －130a等［14］。但對(duì) ICM 患者循環(huán) miRNAs表達(dá)譜的變化及其作為ICM診斷及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)的研究較少。Qin等［4］發(fā)現(xiàn)miR－21可減少心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡繼而減緩心室重構(gòu)進(jìn)程。miR－21在心肌肥大、心肌缺血及纖維化引起的心臟重構(gòu)中也具有重要的調(diào)控作用［5－6］。miR －133a在心臟中含量較豐富，并廣泛參與心肌細(xì)胞的分化、增殖等心臟發(fā)育過(guò)程［9］。在 Danowski等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后患者心肌組織中miR－133a表達(dá)水平與心力衰竭嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，miR－133a表達(dá)水平越低，心功能分級(jí)及肺動(dòng)脈壓越高。心肌缺血后適應(yīng)可減少缺血再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡、改善心功能。缺血后適應(yīng)處理的心肌組織中miR－133a表達(dá)水平升高，提示miR－133a可能與缺血后適應(yīng)引起的心肌保護(hù)機(jī)制有關(guān)［8］。最新研究顯示，急性冠脈綜合征患者外周循環(huán)血液中miR－133a水平升高，可作為心肌損傷診斷及判斷預(yù)后的標(biāo)志物［10－11］。本研究發(fā)現(xiàn)，ICM 組LDL－C、HDL－C及 LVEF低于對(duì)照組，TG、NT－proBNP及LVEDV高于對(duì)照組，提示ICM患者存在血脂異常及心臟重構(gòu)。同時(shí)本研究采用qRT－PCR檢測(cè)ICM患者血漿miR－21、miR－133a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示血漿miR－21、miR－133a水平在ICM患者中顯著升高;相關(guān)性分析顯示，ICM患者血漿miR－21水平與NT－proBNP、LVEDV呈正相關(guān)關(guān)系，且在調(diào)整了各ICM相關(guān)危險(xiǎn)因素 (如性別、年齡、高血壓、吸煙史、糖尿病、LVEF及NT－proBNP等)后，血漿miR－21水平仍與LVEDV呈正相關(guān)，提示血漿miR－21可能參與了ICM患者心室重構(gòu)，可作為ICM患者心室解剖重構(gòu)標(biāo)志物，與現(xiàn)有miR－21可調(diào)控心室重構(gòu)進(jìn)程等研究結(jié)果具有一致性。研究中ICM患者血漿miR－133a水平高于對(duì)照組，結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究推測(cè)可能與ICM患者存在冠狀動(dòng)脈損傷及心肌缺血有關(guān)。但本研究未發(fā)現(xiàn)miR－133a與ICM患者心室重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)具有直線(xiàn)相關(guān)性，其是否參與了心室重構(gòu)的進(jìn)程尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究的意義在于發(fā)現(xiàn)了ICM患者血漿miR－21、miR－133a水平升高，可作為ICM診斷及進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新的生物標(biāo)志物。但本研究尚存在局限性，如樣本量不足、ICM類(lèi)型轉(zhuǎn)變等;另外，ICM患者的基礎(chǔ)疾病如糖尿病、高血壓等是否會(huì)對(duì)血漿miR－21及miR－133a的水平產(chǎn)生影響尚不清楚，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步明確血漿miR－21及miR－133a作為ICM診斷及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估生物標(biāo)志物的臨床意義和價(jià)值。

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