黑素皮質(zhì)素受體－4基因rs17782313位點多態(tài)性與長沙地區(qū)漢族人群原發(fā)性高血壓病的相關(guān)性研究

邱玲玲，胡中揚，楊錫榮，王 倩，劉 佳，宋 治

原發(fā)性高血壓病是遺傳易患性與環(huán)境因素共同作用導致的慢性復雜疾病，是心腦血管疾病的獨立危險因素。全球原發(fā)性高血壓病患病率呈上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計，2000年有26.4%的成人患有高血壓，預(yù)計到2025年總患病率將達到29.2%［1］。超重及肥胖是原發(fā)性高血壓病的危險因素已得到廣泛認知，但目前國內(nèi)外對與肥胖有關(guān)的基因與原發(fā)性高血壓病的相關(guān)性研究較少。位于黑素皮質(zhì)素受體 －4基因 (melanocortin－4 receptor gene，MC4R)附近的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)位點rs17782313是全基因組關(guān)聯(lián)分析 (genome wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)的肥胖相關(guān)基因位點。Loos等［2］通過對16 876例大樣本的薈萃分析發(fā)現(xiàn)該位點與體質(zhì)量呈正相關(guān)。我國學者在對3 077例年齡在6～18歲的樣本研究中發(fā)現(xiàn)肥胖易感位點如脂肪量和肥胖相關(guān)基因 (fat mass and associated gene，F(xiàn)TO)與高血壓相關(guān)，但尚未發(fā)現(xiàn)MC4R rs17782313位點多態(tài)性與高血壓的關(guān)系。有研究認為該位點與導致高血壓發(fā)病的危險因素相關(guān)［3］。本研究旨在通過檢測湖南長沙地區(qū)漢族人群與肥胖相關(guān)的rs17782313位點多態(tài)性，進而從遺傳學角度探討該位點與長沙地區(qū)漢族人群原發(fā)性高血壓病的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2011年6月—2012年7月選取在中南大學湘雅三醫(yī)院住院的原發(fā)性高血壓病患者及體檢中心體檢健康者共768例，分為高血壓組 (440例)和對照組 (328例)。高血壓組患者間彼此無親緣關(guān)系，其中男258例、女182例;平均年齡 (63.2±10.5)歲;均符合1999年世界衛(wèi)生組織/國際高血壓協(xié)會診斷標準［4］:未服降壓藥的情況下收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和/或舒張壓≥90 mm Hg或已確診為高血壓并服用降壓藥。排除繼發(fā)性高血壓、慢性肝腎功能不全、惡性腫瘤、先天性心臟病、風濕性心臟病患者。對照組為無親緣關(guān)系的健康個體，其中男193例、女135例;平均年齡 (61.4±10.2)歲。高血壓組和對照組均為長沙地區(qū)漢族人群，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料及標本采集 收集一般臨床資料〔性別、年齡、體質(zhì)量、體質(zhì)指數(shù) (BMI)、收縮壓(SBP)、舒張壓 (DBP)、總膽固醇 (TC)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL－C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)、三酰甘油 (TG)、尿酸 (UA)、空腹血糖(FBG)〕。受試者禁食12～14 h后，抽取肘靜脈血約5 ml，加入到乙二胺四乙酸二鉀 (EDTA－K2)抗凝試管中，置于－20℃冰箱中儲存待用。

1.2.2 基因組DNA提取 取儲存的肘靜脈血300 μl經(jīng)紅細胞裂解液裂解后嚴格按DNA提取試劑盒 (北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司)說明書提取基因組DNA，并置于－20℃冰箱保存。

1.2.3 引物設(shè)計和合成 聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)和單堿基延伸反應(yīng)引物均由AssayDesigner 3.1軟件包設(shè)計，由大連寶生物工程有限公司合成。rs17782313 PCR上游引物為:ACGTTGGATGCTTAAATGTCACCTTCCCCC，下游引物為:ACGTTGGATGAGAAGTTTAAAGCAGGAGAG，單堿基延伸反應(yīng)引物為:AGCTTTTCTTGTCATTTCCATC。

1.2.4 基因多態(tài)性檢測 采用PCR及飛行時間質(zhì)譜技術(shù) (MALDI－TOF－MS)對rs17782313位點進行檢測。PCR及MALDI－TOF－MS主要步驟如下:(1)PCR擴增反應(yīng):①PCR反應(yīng)體系為基因組DNA 10 ng，引物0.1 μmol，4 × dNTP 500 μmol，Taq 酶 1 Unit，10 × Taq酶緩沖液0.5 μl，MgCl21.625 mmol。②擴增條件為94℃預(yù)變性15 min;94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，進行45次循環(huán)，最后72℃延伸3 min;4℃保存。(2)蝦堿性磷酸酶 (shrimp alkaline phosphatase，SAP)反應(yīng):堿性磷酸酶消化PCR擴增后剩余的dNTP及殘留引物。(3)單堿基延伸反應(yīng):①反應(yīng)體系為生化分析型超純水0.619 μl，特異性終止反應(yīng)物0.2 μl，延伸 反 應(yīng) 引 物 0.94 μl，iPLEX 緩 沖 液 0.2 μl，iPLEX酶0.041 μl及經(jīng)純化后的PCR反應(yīng)產(chǎn)物7 μl，總體積9 μl。②反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性30 s;94℃變性5 s，52℃退火5 s，80℃延伸5 s，共進行40次循環(huán)，其中52℃退火5 s及80℃延伸5 s進行5次循環(huán)，最后72℃延伸3 min;4℃保存。(4)去鹽及上機檢測:將上一步的反應(yīng)產(chǎn)物加入陽離子交換樹脂完成去鹽，將產(chǎn)物點樣后利用質(zhì)譜儀進行分析，并使用Mass ARRAY Typer軟件分析基因分型數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以 ()表示，采用t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗;數(shù)量性狀 (QTL)位點分析采用單因素線性回歸分析;高血壓的危險因素采用多因素Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高血壓組和對照組臨床資料比較 兩組的年齡、體質(zhì)量、BMI、SBP、DBP、TC、LDL－C、TG、UA、FBG比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);兩組的性別構(gòu)成、HDL－C比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 兩組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data between the two groups

2.2 rs17782313位點基因型分布及等位基因頻率比較

經(jīng)PCR及MALDI－TOF－MS技術(shù)能檢測到基因型的樣本高血壓組為435例，對照組為321例，得到rs17782313位點基因型為 CT、CC、TT(見圖1～3)。高血壓組和對照組的基因分布頻率均符合Hardy－Weinberg平衡檢驗(χ2=0.928、1.464，P=0.335、0.226)，說明本實驗所選擇的樣本具有群體代表性。高血壓組和對照組基因型分布和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表2)。

圖1 rs17782313位點 CT基因型 MALDI－TOF－MS質(zhì)譜圖Figure 1 Diagram of MALDI－TOF－MS for genotype CT of rs17782313

圖2 rs17782313位點 CC基因型MALDI－TOF－MS質(zhì)譜圖Figure 2 Diagram of MALDI－TOF－MS for genotype CC of rs17782313

2.3 QTL位點單因素線性回歸分析 以MC4R基因rs17782313位點為自變量，將表1各代謝指標依次作為因變量，分析各代謝指標與rs17782313位點是否存在線性回歸關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅TC與rs17782313位點存在線性回歸關(guān)系，差異有統(tǒng)計學意義 (r=0.08，β=0.101，P=0.032)。

2.4 高血壓影響因素的多因素Logistic回歸分析 以有無高血壓作為因變量，以性別、超重和肥胖、高脂血癥(分別為高三酰甘油血癥、高膽固醇血癥、高低密度脂蛋白血癥)、C等位基因作為自變量進行Logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超重和肥胖、高三酰甘油血癥、C等位基因是原發(fā)性高血壓病的獨立危險因素 (P＜0.05，見表3)。

圖3 rs17782313位點 TT基因型MALDI－TOF－MS質(zhì)譜圖Figure 3 Diagram of MALDI－TOF－MS for genotype TT of rs17782313

表2 兩組基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 2 Comparison of distribution of geneotypes and allele frequencies between the two groups

表3 高血壓影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors for hypertension

3 討論

原發(fā)性高血壓病是多個微效基因遺傳與環(huán)境因素相互作用的復雜疾病。超重和肥胖是原發(fā)性高血壓病的獨立危險因素在國內(nèi)外早已形成共識，腰臀比 (WHR)、BMI、腰圍 (WC)可預(yù)測高血壓的發(fā)生風險［5］。近來研究表明，遺傳因素在原發(fā)性高血壓病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［6］。超重和肥胖本身引起的代謝紊亂與動脈硬化存在密切關(guān)系，且脂肪組織分泌的脂肪因子如瘦素與高血壓相關(guān)［7－8］，因此與超重和肥胖相關(guān)的基因有可能是引起原發(fā)性高血壓病的候選基因。

MC4R是Willer等［9］研究發(fā)現(xiàn)的與 BMI、肥胖呈強陽性相關(guān)的基因，是能量平衡及飲食攝入的重要調(diào)節(jié)因子。rs17782313位點位于MC4R下游188 kb處18q22上。本研究發(fā)現(xiàn)，高血壓組CC、CT、TT基因型分布與對照組有明顯差異，且高血壓組C等位基因頻率高于對照組;此外，多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，C等位基因是高血壓的獨立危險因素〔OR(95%CI)=1.444(1.040，2.006)，P=0.028〕，提示rs17782313位點攜帶C等位基因者患高血壓的風險是非C等位基因攜帶者的1.444倍。以上說明rs17782313位點多態(tài)性是湖南地區(qū)漢族人群高血壓高發(fā)的重要遺傳危險因素。對于該基因與原發(fā)性高血壓病直接相關(guān)還是通過肥胖再導致高血壓的發(fā)生目前尚無定論。

Timpson等［10］對丹麥白色人種54 244例樣本研究發(fā)現(xiàn)，MC4R rs17782313位點多態(tài)性與BMI相關(guān)，而與高血壓無直接相關(guān)性，每增加10%BMI即可增加3.85 mm Hg SBP和1.79 mm Hg DBP，認為rs17782313位點可能通過BMI這個中間表型間接與高血壓有關(guān)。另外，在對我國6～18歲大樣本的研究中也發(fā)現(xiàn)，調(diào)整BMI后rs17782313位點與高血壓發(fā)病風險的相關(guān)性消失，提示該位點可能通過BMI間接與高血壓的易患風險有關(guān)［3］。與之相反，本研究結(jié)果顯示，rs17782313位點與高血壓發(fā)病直接相關(guān)，有可能是由于選擇的研究對象不同造成與上述研究結(jié)果不一致。有關(guān)學者傾向于認為MC4R與高血壓的發(fā)生有著直接相關(guān)關(guān)系，并就其可能的內(nèi)在病理生理機制作了研究。Greenfield等［11］從遺傳學及藥理學角度說明MC4R與高血壓有關(guān)，并且通過中樞性黑素皮質(zhì)信號通路影響高血壓的發(fā)生，這種作用的實現(xiàn)與肥胖所致的高胰島素血癥無關(guān)。Sohn等［12］認為MC4R產(chǎn)物黑素皮質(zhì)素受體－4具有雙向調(diào)節(jié)交感神經(jīng)及副交感神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元的作用，從而影響胰島素及血壓的變化。

在對我國漢族兒童人群的研究中也發(fā)現(xiàn)rs17782313位點與中心性肥胖相關(guān)［13］。Dwivedi等［14］研究發(fā)現(xiàn)rs17782313位點在兒童及成年人中均與肥胖相關(guān)，但其相關(guān)性隨著年齡的增加而減弱。本研究尚未發(fā)現(xiàn)rs17782313位點與BMI或肥胖存在線性回歸關(guān)系，與以上結(jié)論不一致，但與Vasan等［15］的研究結(jié)果一致?？赡芘c以下因素有關(guān):(1)與研究對象的選擇有關(guān)，本研究的研究對象平均年齡＞60歲，屬于老年人群，隨著年齡的增加，容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、脊柱變形，因此所測身高與體質(zhì)量可能存在一定偏差，從而對以BMI為指標界定的肥胖可能造成一定影響;此外，rs17782313位點本身可能與年齡存在相關(guān)性，因為隨著年齡的增加環(huán)境因素可能會掩蓋或減弱微效基因作用［14］。(2)不同地區(qū)、不同人群的背景存在差異性。(3)可能與本研究的樣本量，所選擇的統(tǒng)計學方法有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，rs17782313位點與TC存在線性回歸關(guān)系，但未發(fā)現(xiàn)與LDL－C相關(guān)，與有關(guān)學者發(fā)現(xiàn)該位點與TC及LDL－C均相關(guān)不同［16］。Cheung等［17］認為 rs17782313 位點與代謝綜合征有相關(guān)性。Wilkinson等［18］發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥患者與對照組相比有更高的中心脈壓及更嚴重的動脈硬化程度。綜合以上文獻信息，提示rs17782313位點有可能通過血清TC的變化導致動脈硬化、血管重構(gòu)，從而間接引起高血壓。

綜上所述，本研究提示rs17782313位點多態(tài)性與湖南長沙地區(qū)漢族人群原發(fā)性高血壓病相關(guān)，從遺傳流行病學角度認為該位點攜帶C等位基因者存在遺傳易患性，但是原發(fā)性高血壓病是多基因遺傳與多環(huán)境因素共同作用的慢性疾病，故高血壓發(fā)病仍存在環(huán)境等因素的作用。由于本研究樣本量較小，結(jié)果可能存在一定的局限性。因此，今后應(yīng)在擴大樣本量的基礎(chǔ)上進一步針對強微效基因之間或微效基因與環(huán)境因素之間交互作用進行研究，以進一步明確原發(fā)性高血壓病的發(fā)病機制。

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