紅景天苷納米脂質(zhì)體對(duì)亞急性輻射損傷小鼠的防護(hù)作用

夏書芹，范明輝，許時(shí)嬰，張曉鳴，朱衛(wèi)紅，汪何雅

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江南大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

紅景天苷納米脂質(zhì)體對(duì)亞急性輻射損傷小鼠的防護(hù)作用

夏書芹，范明輝，許時(shí)嬰，張曉鳴，朱衛(wèi)紅，汪何雅

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江南大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

給小鼠飼以紅景天苷（SE）及采用納米脂質(zhì)體包埋的紅景天苷（SNL），用X射線進(jìn)行全身性亞急性照射，檢測(cè)外周血像、骨髓細(xì)胞DNA含量、肝脾組織中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH-Px）活力和外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化等指標(biāo)。結(jié)果表明，SNL較之于SE更能有效的保護(hù)小鼠血液系統(tǒng)，外周血各血象水平顯著恢復(fù)，骨髓細(xì)胞DNA含量增加，外周血淋巴細(xì)胞凋亡被很大程度上抑制；免疫器官指數(shù)增加；對(duì)肝組織中MDA、SOD、GSH-Px的分析顯示膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低，體系抗氧化能力增強(qiáng)。因此，紅景天苷納米脂質(zhì)體對(duì)X射線亞急性輻射損傷有良好的防護(hù)作用。

紅景天苷，納米脂質(zhì)體，輻射損傷

紅景天苷（salidroside）是重要保健藥源植物紅景天的主要功能性成分，具有較好的抗輻射功能[1]。然而，很多相關(guān)藥理學(xué)研究表明，水溶性的極性分子在胃腸道的吸收較差，體內(nèi)的生物利用度低[2-3]。脂質(zhì)體是水溶性和脂溶性成分的良好載體，能將活性成分包埋于脂質(zhì)體雙分子層及內(nèi)水相中，在胃腸道可與粘膜細(xì)胞發(fā)生融合、胞飲、吞噬作用，促使活性成分進(jìn)入胃腸道粘膜被吸收，具有靶向性、高效性、緩釋性等優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)口服紅景天苷納米脂質(zhì)體在動(dòng)物體內(nèi)功效方面的研究報(bào)道。本研究采用給口服紅景天苷納米脂質(zhì)體的小鼠以X射線全身照射的方法，探討了紅景天苷納米脂質(zhì)體對(duì)小鼠亞急性輻射損傷的防護(hù)作用，旨在為抗輻射食品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR屬清潔級(jí)小鼠 購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2002-0009，體重22～25g，雌性；噻唑藍(lán)（MTT） Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）試劑盒 南京建成生物研究所。

Epics XL流式細(xì)胞儀 美國(guó)貝克曼-庫(kù)爾特公司；Multiska Mks酶標(biāo)儀 Thermo electron公司。

1.2 紅景天苷納米脂質(zhì)體的制備

采用乙醇注入法制備紅景天苷納米脂質(zhì)體[4]。高山紅景天苷部分純化液中每10mL含紅景天苷6.4mg，相當(dāng)于1g生藥量；紅景天苷納米脂質(zhì)體中紅景天苷載量為5%（w/w），磷脂濃度1%（w/w），即納米脂質(zhì)體中紅景天苷的濃度為0.5mg/mL。

1.3 動(dòng)物分組及處理

小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、輻射對(duì)照組、陽(yáng)性組，以及高、低劑量分別為5、1mL/kg的紅景天苷納米脂質(zhì)體懸浮液劑量組（SNL），每組8只。輻射對(duì)照組給予生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予紅景天苷濃度為0.5mg/mL的提取液（SE），5mL/kg。各組經(jīng)口灌胃1次/d，適應(yīng)性喂養(yǎng)2d后，連續(xù)灌胃15d后進(jìn)行X射線照射（正常對(duì)照組不照射，其余小鼠進(jìn)行一次性全身照射），總吸收劑量為4Gy，能量6mV，劑量率300cGy/min，面積30cm×30cm，皮源距離100cm。照射后的小鼠分出一半用于外周血實(shí)驗(yàn)，另一半小鼠于照射后第3d處死，用于其他項(xiàng)目的檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.4.1 外周血象的檢測(cè) 于照射后第2、7、14、21、30d剪尾尖采血做白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（Platelet，PLT）、血紅蛋白（HB）的檢測(cè)。

1.4.2 免疫臟器指數(shù)測(cè)定 照射后3d，小鼠斷頭取出各組織器官，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)以mg/10g體重表示。

1.4.3 肝和脾組織中SOD、MDA、GSH-Px的測(cè)定 照射后3d，取出肝和脾，用冷生理鹽水制成10%（w/w）組織勻漿，按南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行SOD、MDA和GSH-Px測(cè)定。

1.4.4 骨髓細(xì)胞DNA測(cè)定 參考文獻(xiàn)[5]方法分析骨髓DNA含量：取一側(cè)股骨，除盡軟組織，用10mL CaCl2將其沖入離心管中，4℃、2500r/min離心30min，棄去上清液，加入5mL HClO4，將沉淀充分混合后，95℃加熱15min，冷卻，濾紙過(guò)濾，濾液于268nm測(cè)定吸光值，計(jì)算得到每根股骨所含DNA（μg）。

1.4.5 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化 參考文獻(xiàn)[6]方法采用MTT法。將小鼠摘眼球取血于抗凝管中，加入等量的D-Hank’s液稀釋后，用紅細(xì)胞裂解液分離淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞于離心管中，用D-Hank’s洗滌兩遍，離心棄上清，加入適量RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×106個(gè)/mL將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，100μL/孔，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔，每孔加入7.5μL ConA，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48h。采用MTT法檢測(cè)ConA誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活力，加MTT（5mg/mL）10μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入二甲亞砜100μL/孔，酶標(biāo)儀上590nm處測(cè)定吸光值。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活力用刺激指數(shù)SI表示：

1.4.6 外周血淋巴細(xì)胞凋亡 小鼠眼球取血于抗凝管中，加入等量的D-Hank’s液稀釋后，用紅細(xì)胞裂解液分離淋巴細(xì)胞。小心吸取懸浮的淋巴細(xì)胞于離心管中，用D-Hank’s洗滌兩遍，1000r/min離心5min，棄上清液。PBS重懸后，1000r/min離心5min，棄去PBS。加入PI染料染色，4℃避光染色30min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式細(xì)胞儀參數(shù)：氫離子激發(fā)熒光，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光，儀器自帶軟件分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖和前散色光對(duì)側(cè)散色光的散點(diǎn)圖。結(jié)果評(píng)定：以直方圖（橫坐標(biāo)為DNA相對(duì)含量，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)）表示測(cè)定結(jié)果，低于G1期細(xì)胞DNA含量的峰為凋亡細(xì)胞群體峰。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以x±SD表示，采用Origin統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間差異比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)或檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外周血象的影響

血液系統(tǒng)對(duì)輻射甚為敏感，一定劑量射線作用后，可引起不同程度的外周血象的變化。對(duì)輻射小鼠造血功能的研究結(jié)果表明（圖1），輻射對(duì)照組在輻射后2d內(nèi)血液中白細(xì)胞數(shù)（WBC）急劇下降（p＜0.01），WBC在輻射后第2d降至最低水平，至輻射后21d仍未恢復(fù)到正常水平，僅為正常水平的76%，表明輻射對(duì)WBC的殺傷能力很強(qiáng)。SE陽(yáng)性對(duì)照組和SNL高劑量組在輻射后第2d，WBC雖然也明顯下降，但降低的幅度大大低于輻射對(duì)照組（p＜0.01），分別為輻射對(duì)照組的1.5倍和2倍。至輻射后21d，SE陽(yáng)性對(duì)照組和SNL高劑量組WBC基本可以恢復(fù)到正常水平。

輻射后2d內(nèi)紅細(xì)胞（RBC）的數(shù)目明顯降低，輻射后7d內(nèi)血小板（PLT）和血紅蛋白（HB）的數(shù)目也呈明顯下降趨勢(shì)，并均在第7d降至最低。SE陽(yáng)性對(duì)照組和SNL劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)的下降趨勢(shì)則明顯地慢于輻射對(duì)照組，結(jié)果差異顯著（p＜0.01）。輻射一周之后，各項(xiàng)指標(biāo)逐漸回升。與輻射對(duì)照組相比，SNL 5mg/kg劑量組效果最為明顯，到第21d基本與正常對(duì)照組水平，接近甚至超過(guò)輻射前血象水平。與同劑量SE陽(yáng)性對(duì)照組比較，SNL對(duì)造血功能的恢復(fù)效果更明顯，結(jié)果差異顯著（p＜0.05）。表明SNL相對(duì)于SE能顯著的改善小鼠造血系統(tǒng)的輻射損傷。

2.2 免疫臟器指數(shù)的影響

輻射所致的免疫功能改變是輻射損傷的主要表現(xiàn)之一。胸腺和脾臟是機(jī)體參與免疫功能調(diào)節(jié)的重要免疫器官，是高輻射敏感的細(xì)胞群。一般情況下，機(jī)體受輻射后其脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)都會(huì)下降，機(jī)體免疫功能降低。表1結(jié)果顯示，SE和SNL組與輻射對(duì)照組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比較差異顯著（p＜0.05）。這表明動(dòng)物輻射模型建立成功。SNL 5mg/kg劑量組的結(jié)果和SE陽(yáng)性對(duì)照組比較，兩組免疫臟器指數(shù)均有所提高，而且差異顯著（p＜0.05）。

2.3 肝和脾組織中SOD、MDA、GSH-Px的影響

電離輻射是一種非特異性的物理刺激因子，射線產(chǎn)生的羥自由基作用于生物膜脂質(zhì)雙層中的不飽和脂肪酸，使體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA，引起體內(nèi)酶或其他與清除自由基相關(guān)物質(zhì)的變化，破壞了體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除的平衡，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力下降，從而出現(xiàn)不同程度的輻射損傷[7]。機(jī)體中參與并清除自由基與防止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的主要酶類有SOD、GSH-Px等，通過(guò)檢測(cè)機(jī)體中此類酶系的活力和MDA的累積含量可反映出受輻射損傷的程度。

由表2、表3可知，輻射可使肝臟和脾臟組織中MDA含量明顯上升（p＜0.05），使SOD、GSH-Px活力下降（p＜0.05）。SNL可抑制組織中MDA升高幅度，降低SOD、GSH-Px活力下降幅度，與輻射對(duì)照組相比均有顯著性差異（p＜0.05），并接近正常對(duì)照組水平。較之SE 5mg/kg陽(yáng)性對(duì)照組，SNL 5mg/kg劑量組對(duì)MDA含量的上升和對(duì)SOD、GSH-Px活力下降幅度的抑制作用更強(qiáng)。

表2 紅景天苷納米脂質(zhì)體對(duì)肝臟中MDA、SOD、GSH-Px的影響Table.2 Effect of salidroside nanoliposomes on MDA content，SOD and GSH-Px activity in the livers

表3 紅景天苷納米脂質(zhì)體對(duì)脾臟中MDA、SOD、GSH-Px的影響Table.3 Effect of salidroside nanoliposomes on MDA content，SOD and GSH-Px activity in the spleens

2.4 骨髓細(xì)胞DNA的影響

細(xì)胞中DNA是輻射損傷的一個(gè)重要的靶分子，放射生物學(xué)效應(yīng)很多是通過(guò)DNA損傷表現(xiàn)出來(lái)的。DNA不但是輻射直接作用的靶點(diǎn)，也是輻射所產(chǎn)生的自由基間接攻擊的目標(biāo)之一，最終引起DNA斷裂、基因突變、染色體重組、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞死亡等[8]。

圖2 紅景天苷納米脂質(zhì)體對(duì)輻射小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量的影響Fig.2 Effect of salidroside nano-liposomes on DNA content in the medulla of radiated mice

由圖2可知，X射線輻射后，小鼠骨髓DNA的含量均要低于正常對(duì)照組（p＜0.01）。與輻射對(duì)照組比較，各劑量組顯著增加輻射小鼠骨髓DNA含量（p＜0.01）。SNL 5mg/kg劑量組對(duì)骨髓DNA含量增加遠(yuǎn)大于SE 5mg/kg劑量組（p＜0.05）。表明SNL能夠更有效地降低X射線輻射對(duì)小鼠DNA造成的損傷。

2.5 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

淋巴細(xì)胞分裂旺盛，新生與衰老細(xì)胞數(shù)大致相等，屬更新類組織細(xì)胞，是對(duì)輻射最為敏感的細(xì)胞群體。淋巴細(xì)胞在絲裂原的刺激下，可以轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，從而淋巴細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，具有更強(qiáng)的免疫活性。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)機(jī)體免疫狀態(tài)的一種常用方法，對(duì)刺激的應(yīng)答能力是淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)及成熟程度的重要指標(biāo)之一[9]。

與輻射對(duì)照組相比，SNL各劑量組小鼠淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)差異具有顯著性（p＜0.05）。SNL 5mg/kg劑量組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)與SE 5mg/kg陽(yáng)性對(duì)照組比較差異顯著（p＜0.05）。圖3結(jié)果表明，SNL較SE能夠更好地減輕輻射對(duì)機(jī)體免疫功能的損傷。

圖3 紅景天苷納米脂質(zhì)體對(duì)輻射小鼠外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Effect of salidroside nanoliposomes on SI of lymphocyte in periphery blood of radiated mice

2.6 外周血淋巴細(xì)胞凋亡的影響

由表4可知，輻射對(duì)照組經(jīng)過(guò)X射線的照射后外周血淋巴細(xì)胞明顯發(fā)生凋亡。與正常對(duì)照組相比，輻射組凋亡率增加了9.6倍，這表明了X射線引起了細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。灌胃紅景天苷提取液和紅景天苷納米脂質(zhì)體可以大大降低細(xì)胞的凋亡率，從結(jié)果可知，SE 5mg/kg陽(yáng)性對(duì)照組能夠?qū)⒌蛲雎式抵?.5%，比輻射對(duì)照組下降了2.5倍（p＜0.05）。SNL 1mg/kg劑量組也能夠?qū)⒌蛲雎式档椭?.02%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于輻射對(duì)照組（p＜0.05）。與SE 5mg/kg陽(yáng)性對(duì)照組比較，SNL 5mg/kg劑量組的凋亡率低了一倍多，差異顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義（p＜0.05）。表明SNL可有效的提高紅景天苷對(duì)X射線引起的淋巴細(xì)胞凋亡的抑制作用。

表4 紅景天苷納米脂質(zhì)體對(duì)輻射小鼠外周血淋巴細(xì)胞凋亡的影響Table.4 Effect of salidroside nanoliposomes on apoptosis of lymphocyte in periphery blood

3 結(jié)論

紅景天苷納米脂質(zhì)體較紅景天苷溶液有較強(qiáng)的輻射防護(hù)能力，保護(hù)小鼠血液系統(tǒng)，外周血各血象水平顯著恢復(fù)，骨髓細(xì)胞DNA含量增加，外周血淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)大大提高，外周血淋巴細(xì)胞凋亡被很大程度上抑制；巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，免疫器官指數(shù)增加；對(duì)肝組織中MDA、SOD、GSH-Px的分析顯示膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低，體系抗氧化能力增強(qiáng)。因此SNL對(duì)小鼠亞急性輻射損傷具有良好的防護(hù)作用。

[1]仝國(guó)輝，譚壯生，楊慶.大花紅景天的抗輻射損傷作用[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2004，18（3）：183-184．

[2]汪龍，鄧瑾，金玉燕，等.低分子肝素微乳及其納米脂質(zhì)體作大鼠口服抗凝效果的比較[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2005，13（2）：4-6. [3]茹仁萍，吳錫銘.18α甘草酸及其脂質(zhì)配位體的生物利用度與抗肝損害作用的比較[J].浙江醫(yī)學(xué)，2001，23（8）：466-468.

[4]Minghui Fan，Shiying Xu，Shuqin Xia，et al.Preparation of salidroside nano-liposomes by ethanol injection method and in vitro release study[J].European Food Research and Technology，2008，227（1）：167-174.

[5]鄧乾春，陳春艷，段會(huì)柯，等.白果清蛋白提取物對(duì)γ射線輻射損傷小鼠的保護(hù)作用研究[J].輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)，2005，23（6）：359-365.

[6]柳忠輝，呂昌龍.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].第一版.北京：科學(xué)出版社，2002：109-113.

[7]周紅杰，李家華，秘鳴，等.茶多酚的作用機(jī)理及應(yīng)用[J].農(nóng)牧產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，2001（2）：7-9．

[8]畢良文，段偉，王曉莉，等.中藥輻射防護(hù)劑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)輻射衛(wèi)生，2006，15（1）：118-120.

[9]商小英，王曉支，王雪飛，等.肉蓯蓉總苷對(duì)60Coy射線損傷小鼠免疫功能的防護(hù)作用[J].中草藥，2001，32（2）：139-142.

Protective effect of salidroside nano-liposomes against sub-acute radiation damage

XIA Shu-qin，F(xiàn)ANG Ming-hui，XU Shi-ying，ZHANG Xiao-ming，ZHU Wei-hong，WANG He-ya
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Salidroside and salidroside-loaded nanoliposomes were administered to mice，and then the mice were exposed to X-ray.Indices including periphery blood cell，DNA content in the medulla，MDA content，SOD and GSH-Px activity in the livers and spleens，lymphocyte transformation of periphery blood were measured. The blood system in the SLN-treated groups was protected better than that of SN-treated groups.Cell level of periphery blood was significantly resumed.DNA content in the medulla increased，and apoptosis of lymphocyte in periphery blood was inhibited to a great extent.Furthermore，spleen index and thymus index were enhanced. Results of MDA content，SOD and GSH-Px activity in the livers and spleens showed that peroxidation level of membrane lipids decreased and antioxidative capacity increased in SLN-treated groups.Therefore，SLN had a significant protective effect against sub-acute radiation damage.

salidroside；liposomes；radio damage

TS201.4

A

1002-0306（2014）06-0334-04

2013－05－07

夏書芹（1979-），女，博士，副教授，主要從事功能性食品配料與添加劑方面的研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（NSFC31000815）；國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃（2012BAD33B05）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。