酒酒球菌在青梅汁中的生長(zhǎng)及蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵特性的研究

何翠嬋，熊 犍，葉 君，林偉鋒，陳 中

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

酒酒球菌在青梅汁中的生長(zhǎng)及蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵特性的研究

何翠嬋，熊 犍，葉 君，林偉鋒*，陳 中

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

以青梅汁為原料，利用酒酒球菌的蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）對(duì)青梅汁進(jìn)行生物降酸的研究。結(jié)果表明：接種量為2.0×108CFU/mL，青梅汁的pH≥3.4時(shí)，MLF能正常進(jìn)行，并使樣品的酸度降低61.35%以上；接種量為2.6×107CFU/mL時(shí)，青梅汁的pH為3.6才能觸發(fā)MLF，樣品的酸度降低了77.60%；接種量為2.3×108CFU/mL，在pH3.6和4.0的青梅汁中，添加1.0g/100g的葡萄糖的樣品，與不添加葡萄糖的樣品相比，其酸度分別降低了27.04%和34.63%；在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系中，酒酒球菌使體系酸度降低了26.40%，證實(shí)酒酒球菌可利用檸檬酸作為碳源，進(jìn)行MLF。

青梅，酒酒球菌，蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵，降酸

蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）是葡萄酒生產(chǎn)尤其是優(yōu)質(zhì)干紅葡萄酒釀造的一種主要生物降酸方法。它是指L-蘋(píng)果酸在乳酸菌的作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)，生成L-乳酸并釋放出CO2的過(guò)程，二元酸轉(zhuǎn)變成一元酸，從而降低酒的酸度，也稱為二次發(fā)酵或次級(jí)發(fā)酵[1-3]。自然條件能夠引發(fā)MLF的四個(gè)乳酸菌種屬是酒球菌屬（Oenococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和乳桿菌屬（Lactobacillus）[4]。其中，酒球菌屬的酒酒球菌對(duì)酒精和低pH具有較高的耐受性，是自然誘發(fā)MLF的主要啟動(dòng)者和完成者，也是目前最主要的商業(yè)MLF發(fā)酵劑[4-6]。通過(guò)酒酒球菌的MLF，可以降低果酒的酸澀和粗糙感，使之柔和、圓潤(rùn)，同時(shí)MLF的代謝產(chǎn)物如乙偶姻、雙乙酰、2，3-丁二醇等能改善口味，增加香氣，提高葡萄酒的生物穩(wěn)定性和品質(zhì)[4，7-8]。

青梅含有多種天然有機(jī)酸，包括檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、酒石酸等[9-10]。目前，對(duì)青梅汁降酸的研究?jī)H限于化學(xué)降酸法[11-12]，該方法降酸效果顯著，但會(huì)影響酒體的口感、色澤以及帶來(lái)失光、混濁等不穩(wěn)定現(xiàn)象[13]。關(guān)于應(yīng)用生物降酸法對(duì)青梅汁進(jìn)行降酸的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本文將酒酒球菌應(yīng)用于青梅汁中，研究了接種量、葡萄糖含量及青梅汁的初始pH對(duì)其降酸的影響及其在青梅汁中的消長(zhǎng)規(guī)律，為青梅汁生物降酸的實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青梅汁 由青梅果肉與水按料液比1∶1混合打漿制備，pH為2.9，總酸含量為1.91g/100g；酒酒球菌6066（Oenococcus oeni） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；NaHCO3食品級(jí)，市售；NaOH 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液0.10mol/L，pH為3.6；其他試劑 均為分析純；活化培養(yǎng)基 胰蛋白棟20.0g，蛋白棟5.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖5.0g，吐溫80 0.05g，番茄汁250.0mL，蒸餾水750.0mL，pH5.5，1.05kg/cm2滅菌15min，配制固體培養(yǎng)基時(shí)添加瓊脂20.0g。

pHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-ECU超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX-280D滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；GHP-9270隔水式培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備 在液體培養(yǎng)基中，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)接入10%的菌種，于25℃下活化培養(yǎng)3d，按平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得其活菌數(shù)約為2×109CFU/mL，備用。

1.2.2 工藝流程 青梅汁→調(diào)節(jié)pH（1.0mol/L NaHCO3溶液）→滅菌（121℃，20min）→冷卻→接種→發(fā)酵（發(fā)酵溫度25℃）→產(chǎn)品。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 pH對(duì)MLF的影響 用NaHCO3溶液調(diào)整青梅汁的初始pH為2.9、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0進(jìn)行發(fā)酵，接種量為2.0×108CFU/mL。每隔一定時(shí)間取樣檢測(cè)菌量，測(cè)定pH和總酸，以青梅汁的酸度降到最低值為發(fā)酵終點(diǎn)。

1.2.3.2 接種量對(duì)MLF的影響 將青梅汁（pH3.6）在2.6×107、2.6×108、7.8×108CFU/mL的接種量條件下進(jìn)行發(fā)酵。每隔一定時(shí)間取樣檢測(cè)菌量，測(cè)定pH和總酸，以青梅汁的酸度降到最低值為發(fā)酵終點(diǎn)。

1.2.3.3 葡萄糖含量對(duì)MLF的影響 在青梅汁（pH3.6和pH4.0）中，分別添加0、1.0g/100g的葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，接種量為2.3×108CFU/mL。每隔一定時(shí)間取樣檢測(cè)菌量，測(cè)定pH和總酸，以青梅汁的酸度降到最低值為發(fā)酵終點(diǎn)。

1.2.3.4 檸檬酸緩沖液對(duì)MLF的影響 將青梅汁和檸檬酸緩沖液（pH3.6）在接種量為2.6×108CFU/mL的條件下進(jìn)行發(fā)酵。每隔一定時(shí)間取樣檢測(cè)菌量，測(cè)定pH和總酸，以青梅汁的酸度降到最低值為發(fā)酵終點(diǎn)。

1.2.3 測(cè)定方法 總酸：采用GB/T 15038-2006電位滴定法（以蘋(píng)果酸計(jì)）；活菌數(shù)的測(cè)定：采用GB/T 4789.35平板菌落計(jì)數(shù)法。

1.2.4 降酸率 降酸率（%）=（發(fā)酵前果汁酸度-發(fā)酵后果汁酸度）/發(fā)酵前果汁酸度×100。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對(duì)酒酒球菌在青梅汁中的生長(zhǎng)及MLF的影響

由圖1可知，樣品酸度的降低幅度及速率與樣品的初始pH有關(guān)，pH越大，MLF的降酸速率越快；當(dāng)樣品的初始pH≤3.2時(shí)，酒酒球菌難以發(fā)生MLF；當(dāng)pH≥3.4時(shí)，菌體能正常觸發(fā)MLF；當(dāng)樣品的初始pH在3.4～4.0的范圍內(nèi)，其酸度的降低幅度沒(méi)有明顯的差異，分別為0.98、1.01、0.97、0.94g/100g（p＜0.05），相應(yīng)的降酸率為61.35%、69.64%、75.53%、78.80%。

圖1 pH對(duì)酒酒球菌降酸的影響Fig.1 Influence of pH on the deacidification of Oenococcus oeni

由圖2可知，樣品初始pH的高低直接影響著菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)樣品的pH低于3.2時(shí)，菌體細(xì)胞的生物量隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈下降的趨勢(shì)；而當(dāng)樣品的pH高于3.4時(shí)，菌體細(xì)胞的生物量隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，且總體來(lái)看，pH越大時(shí)，菌體的存活率越高。

圖2 pH對(duì)酒酒球菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Influence of pH on the growth of Oenococcus oeni

綜上所述，當(dāng)樣品的pH≤3.2時(shí)，會(huì)抑制菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，難以發(fā)生MLF。因此，為了保證MLF的正常進(jìn)行，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整樣品的初始pH，使之達(dá)到3.4以上。

圖3 接種量對(duì)酒酒球菌降酸的影響Fig.3 Influence of inoculation amount on the deacidification of Oenococcus oeni

2.2 接種量對(duì)酒酒球菌在青梅汁中的生長(zhǎng)及MLF的影響

由圖3可知，添加不同接種量的青梅汁，在MLF過(guò)程中，其pH呈上升趨勢(shì)，而酸度呈快速下降的趨勢(shì)；接種量越大，發(fā)酵速率越快，發(fā)酵周期越短，但樣品的最終降酸幅度越低。接種量為2.6×107CFU/mL的樣品，在0～48h內(nèi)，菌體降酸速率緩慢；48～192h里，樣品的降酸速率最快；發(fā)酵結(jié)束后，青梅汁的酸度下降了1.13g/100g，降酸率為77.60%，pH上升了1.1個(gè)單位。而接種量為2.6×108CFU/mL的樣品，其酸度下降了1.02g/100g，降酸率為70.05%。

如圖4所示，青梅汁中的菌體生物量總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束后，菌體數(shù)量總體維持在2×108CFU/mL中；在發(fā)酵前期，接種量越小，菌體細(xì)胞增長(zhǎng)的速率越快；在發(fā)酵后期，接種量越大，菌體細(xì)胞的死亡率越大。這是因?yàn)榻臃N量越大，單位體積內(nèi)菌體生物量越多，青梅汁中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足于維持菌體細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的需要，從而導(dǎo)致菌體細(xì)胞大量死亡。

圖4 接種量對(duì)酒酒球菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Influence of inoculation amount on the growth of Oenococcus oeni

綜上所述，接種量直接影響著酒酒球菌的降酸幅度及其在青梅汁中的生長(zhǎng)繁殖。接種量越大，對(duì)青梅汁的降酸效果具有抑制作用。因此，在青梅汁中，以2.6×107CFU/mL的菌體生物量接入酒酒球菌后，能發(fā)生MLF，從而對(duì)青梅汁進(jìn)行生物降酸。

2.3 葡萄糖含量對(duì)酒酒球菌在青梅汁中的生長(zhǎng)及MLF的影響

由圖5可知，在相同pH的青梅汁體系中，在發(fā)酵的前48h里，樣品的降酸速率幾乎是一致的，這是因?yàn)镸LF先進(jìn)行蘋(píng)果酸代謝，其代謝的速率與樣品的含糖量無(wú)關(guān)；但在發(fā)酵的后期，不添加葡萄糖的樣品，酒酒球菌的MLF速率及降酸幅度明顯高于添加了1.0g/100g葡萄糖的樣品。而在不同pH的青梅汁體系（pH3.6和4.0）中，發(fā)酵結(jié)束后，不添加葡萄糖的樣品，其酸度分別降低了0.95、0.99g/100g，而添加了1.0g/100g葡萄糖的樣品，其酸度僅降低了0.56、0.57g/100g，降酸率分別下降了27.04%和34.63%。

圖5 葡萄糖含量對(duì)酒酒球菌降酸的影響Fig.5 Influence of glucose content on the deacidification of Oenococcus oeni

由圖6可知，在所有青梅汁體系中，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，菌體生物量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵后期，菌體死亡速率明顯加快，這與菌體自溶有關(guān)；pH相同時(shí)，菌體在添加了葡萄糖的青梅汁體系中，其生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯加快，這是因?yàn)榫w有足夠可利用的碳源，對(duì)其生長(zhǎng)繁殖有促進(jìn)作用。

圖6 葡萄糖含量對(duì)酒酒球菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Influence of glucose content on the growth of Oenococcus oeni

綜上所述，在青梅汁中添加1.0g/100g的葡萄糖，對(duì)酒酒球菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但會(huì)抑制MLF的進(jìn)行，影響降酸效果。這有兩個(gè)方面的原因，一是酒酒球菌在葡萄糖含量較高的青梅汁中先進(jìn)行葡萄糖代謝，再進(jìn)行檸檬酸代謝；其次，酒酒球菌葡萄糖代謝的代謝產(chǎn)物抑制了有機(jī)酸代謝的進(jìn)程。

圖7 酒酒球菌在緩沖液和青梅汁中的降酸效果Fig.7 Effect of deacidification on the buffer solution and plum juice by Oenococcus oeni

2.4 酒酒球菌在青梅汁和檸檬酸緩沖液中的生長(zhǎng)及MLF的作用

由圖7可知，酒酒球菌在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和青梅汁中，均能發(fā)生MLF，但在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，酒酒球菌降酸的速率較慢，降酸幅度小。發(fā)酵192h后，青梅汁的酸度已降到最低值，為0.44g/100g，降低了1.01g/100g，降酸率達(dá)到了69.64%，pH上升了1.1個(gè)單位；而緩沖液的酸度還在緩慢的下降，發(fā)酵結(jié)束后，其總酸含量由初始的1.43g/100g降低到了1.05g/100g，降酸率為26.40%，pH上升了0.3個(gè)單位。

由圖8可知，在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系中，酒酒球菌的菌體生物量隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈下降的趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束后，細(xì)菌的存活率為4.11%；這是因?yàn)榫彌_體系中缺乏菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致菌體的大量死亡。而在青梅汁中，菌體生物量隨發(fā)酵時(shí)間的增加先呈緩慢增加再呈緩慢下降的趨勢(shì)，其總體維持在2×108～7×108CFU/mL中。

圖8 酒酒球菌在緩沖液及青梅汁中的生長(zhǎng)狀況Fig.8 The growth of Oenococcus oeni in the buffer solution and plum juice

綜上所述，酒酒球菌能單獨(dú)利用檸檬酸作為碳源，從而啟動(dòng)MLF。與單一的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系相比，酒酒球菌在復(fù)雜的青梅汁體系中的降酸速率快，降酸幅度大；這是因?yàn)榍嗝分臓I(yíng)養(yǎng)成分能滿足菌體的生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)菌體達(dá)到一定的生物量時(shí)，才能發(fā)生MLF，從而起到降酸的作用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)考察了酒酒球菌的接種量、葡萄糖、pH對(duì)青梅汁生物降酸的影響。在本實(shí)驗(yàn)條件下，得出的結(jié)論如下：

3.1 酒酒球菌的接種量為2.0×108CFU/mL時(shí)，青梅汁的初始pH≤3.2，酒酒球菌不能引發(fā)MLF，而當(dāng)其pH≥3.4時(shí)，菌體均可引發(fā)MLF。

3.2 pH為3.6時(shí)，酒酒球菌的接種量為2.6×107CFU/mL，能引發(fā)MLF，青梅汁的降酸率達(dá)到77.60%。

3.3 酒酒球菌接種量為2.3×108CFU/mL，在pH為3.6和4.0的青梅汁中，分別添加1.0g/100g的葡萄糖，會(huì)抑制體系MLF的進(jìn)行。

3.4 在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系中，酒酒球菌能大幅度降低體系的酸度，說(shuō)明其可利用檸檬酸作為碳源，進(jìn)行MLF。

[1]Maret du Toit，Lynn Engelbrecht，Elda Lerm，et al. Lactobacillus：the Next Generation of Malolactic Fermentation Starter Cultures-an Overview[J].Food Bioprocess Technol，2011（4）：876-906.

[2]Matthews A，Grimaldi A，Walker M，et al.Lactic acid bacteria as a potential source of enzymes for use in vinification[J]. Applied and Environmental Microbiology，2004，70：5715-5731.

[3]Lonvaud-Funel A.Lactic acid bacteria in the quality improvement and depreciation of wine[J].Antonie van Leeuwenhoek，1999，76：317-331.

[4]Dickslm，Dellagliof，Collnsmd.Proposalto reclassify Leuconostoc oenos as Oenococcus oeni[corrig].gen.Nov.comb. Nov[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1995，45（2）：395-397.

[5]孫丙升，夏廣麗，張謙搏，等.利用微生物進(jìn)行葡萄酒降酸的研究進(jìn)展[J].中外葡萄與葡萄酒，2010（11）：72-76.

[6]Ruiz P，Izquierdo P M，Sese?a S，et al.Intraspcific genetic diversity of lactic acid bacteria from malolactic fermentation of Cencibel wines as derived from combined analysis of RAPDPCR and PFGE pattern[J].Food Microbiology，2008，25：942-948.

[7]張浩，莫海珍.葡萄酒蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵細(xì)菌生理特性研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（17）：4213-4215，4218.

[8]Drici-Cachon A，Guzzo J，Cavin F，et al.Acid tolerance in Leuconostoc oenos.Isolation and characterisation of an acid resistant mutant[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1996，44：785-789.

[9]肖更生，陳衛(wèi)東，李升鋒，等.青梅的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2005，26（1）：185-187.

[10]翟煥趁，史懷，宋亞娜，等.反相HPLC法同時(shí)測(cè)定青梅中的7種有機(jī)酸[J].福建農(nóng)林學(xué)報(bào)，2007，22（4）：414-417.

[11]郭正忠，寇兆民，葛芳.“十二嶺”青梅酒的研制[J].釀酒科技，2010（2）：101-103.

[12]趙文紅，錢(qián)敏，白衛(wèi)東.發(fā)酵青梅酒的研制[J].中國(guó)釀造，2009（1）：164-166.

[13]文連奎，趙薇，張微，等.果酒降酸技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2010，31（11）：325-328.

Study on growth and malolactic fermentation characteristics of Oenococcus oeni in plum juice

HE Cui-chan，XIONG Jian，YE Jun，LIN Wei-feng*，CHEN Zhong
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Plum juice was used as material and Oenococcus oeni was used as strain for malolactic fermentation（MLF）to reduce acids in juice.The results were as follows：when the inoculation amount was 2.0×108CFU/mL，the pH was equal or greater than 3.4，the MLF proceeded normally and the acidity of plum juice was reduced by more than 61.35%.When the inoculation amount was 2.6×107CFU/mL and the pH was 3.6，the MLF could perform and the acidity of plum juice was reduced by 77.60%.When the inoculation amount was 2.3×108CFU/mL and the pH were 3.6 and 4.0，compared with the sample without adding glucose，the acidity of plum juice reduced by 27.04%and 34.63%respectively with 1.0g/100g glucose.In sodium citrates buffer system，the acidity reduced by 26.40%，it was proved that Oenococcus oeni could use citric acid as carbon resource to run of MLF.

plum；Oenococcus oeni；MLF；deacidification

TS201.3

A

1002-0306（2014）06-0177-04

2013－07－22 *通訊聯(lián)系人

何翠嬋（1987-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2011B090400311）。