下關(guān)生沱茶和熟沱茶成分分析和體外功能性效果比較研究

王 睿，趙 欣

（重慶第二師范學(xué)院，生物與化學(xué)工程系，重慶400067）

下關(guān)生沱茶和熟沱茶成分分析和體外功能性效果比較研究

王 睿，趙 欣*

（重慶第二師范學(xué)院，生物與化學(xué)工程系，重慶400067）

通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分析，下關(guān)生沱茶和熟沱茶里均發(fā)現(xiàn)存在12種成分，分別是沒(méi)食子酸、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、咖啡因、表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、槲皮素-3-半乳糖甙、山柰酚-3-蕓香糖甙、山柰酚-3-葡萄糖苷、槲皮苷和葉黃素。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，在熟沱茶中新發(fā)現(xiàn)了二羥基苯酸和山奈酚。同時(shí)，熟沱茶的沒(méi)食子酸和槲皮苷含量增加。經(jīng)過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著功能性成分的增加，熟沱茶比生沱茶表現(xiàn)出更好的抗氧化、抗突變和抗癌的效果。

下關(guān)沱茶，成分分析，LC-MS，抗氧化，抗癌

沱茶是由優(yōu)質(zhì)曬青毛茶經(jīng)蒸制加工而成的圓錐窩頭狀的緊壓茶，主要產(chǎn)地是云南，而云南沱茶創(chuàng)制于下關(guān)，所以云南沱茶又稱下關(guān)沱茶[1]。下關(guān)沱茶也是普洱茶的一類，又可分為生沱茶和熟沱茶，生沱茶為曬青毛茶直接制成的緊壓茶，熟沱茶為曬青毛茶經(jīng)過(guò)人工渥堆發(fā)酵后再制成緊壓茶[2]。普洱熟茶因經(jīng)過(guò)了發(fā)酵過(guò)程，生成了更多的功效成分，已經(jīng)被證實(shí)比普洱生茶具有更好的降血脂和減緩脂質(zhì)過(guò)氧化的作用[3]。同時(shí)，沱茶也已經(jīng)被證實(shí)具有抗氧化作用[4]，作為健康食品可以應(yīng)用于各類人群?，F(xiàn)今國(guó)內(nèi)外還未有對(duì)下關(guān)沱茶發(fā)酵前后成分分析的研究，本文對(duì)熟沱茶成分較未發(fā)酵的生沱茶發(fā)生的變化和體外抗氧化、抗突變和抗癌效果變化之間的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的功能性作用差異進(jìn)行了比較，為更好的開(kāi)發(fā)下關(guān)沱茶這一功能性飲品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沱茶提取物 云南下關(guān)沱茶（集團(tuán)）股份有限公司提供2012年產(chǎn)生沱茶和熟沱茶，生沱茶和熟沱茶為同一批次原料茶制成。沱茶葉粉碎后用20倍80%的甲醇進(jìn)行提取，反復(fù)提取三次后合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干甲醇溶液后得到沱茶的提取物[5]；NaH2PO4·2H2O、FeCl3、三氯乙酸 廣州化學(xué)試劑廠；2-硫代巴比妥酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、抗壞血酸、D-Biotin、L-histidine·HCl（monohydrate）、D-glucose-6-phosphate、NADP、deoxyribose（脫氧核糖） 美國(guó)Sigma公司；DMSO 日本純正化學(xué)株式會(huì)社；RPMI 1640培養(yǎng)液、FBS、trypsin、EDTA、100U/mL Penicillin-Streptomycin

美國(guó)Gibco公司；其余化學(xué)試劑藥品 均為國(guó)產(chǎn)分析純；致突變物：N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG） 美國(guó)Aldrich公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株：TA100營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙氏菌 美國(guó)Sigma公司；癌細(xì)胞：AGS胃癌細(xì)胞株（AGS human gastric carcinoma cells）、HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞株（HT-29 human colon carcinoma cells） 韓國(guó)細(xì)胞株銀行。R-114型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；LSB75L型高壓蒸氣滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；WPL-30型恒溫培養(yǎng)箱 江東精密儀器有限公司；UV-1750型紫外分光光度計(jì)、LCMS-2020液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；VS-15CFN型冷凍離心機(jī) 韓國(guó)Vision科學(xué)株式會(huì)社；MC096型二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；Elx800型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio Tekinstruments公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）測(cè)定沱茶的成分 色譜柱為Waters Xterra MS C18（2.1mm×150mm，5μm），流動(dòng)相A為蒸餾水，流動(dòng)相B為乙腈，A、B流動(dòng)相均含有0.1%的甲酸，進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.2mL/min，順序?yàn)椋?～5min，使用0%～40%B（線性梯度）；5～20min，使用40%～80%B（線性梯度）；20～25min，使用80～100% B（線性漸變）；25～30min，100%B，掃描范圍100～1000m/z。通過(guò)比對(duì)MS/MS譜庫(kù)，檢索沱茶提取物內(nèi)所含物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[6]。

1.2.2 羥基自由基清除能力測(cè)定 將6mol/L濃度的deoxyribose（脫氧核糖）溶液0.2mL，pH7.4的磷酸鈉緩沖溶液0.2mL，400mmol/L濃度的FeCl3溶液0.2mL，400mmol/L濃度的FeSO4-EDTA溶液0.2mL，3mol/L濃度的H2O2溶液0.2mL，400mmol/L濃度的抗壞血酸溶液0.2mL和0.2mL沱茶提取物溶液混合，在37℃水浴中放置60min，再加入1mL的三氯乙酸，1mL的2-硫代巴比妥酸，混合溶液在90℃水浴中煮沸20～25min后在532nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算清除自由基能力[7]。

1.2.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定 將100μL不同濃度沱茶提取物溶液和60μL、0.15mmol/L的DPPH試劑混勻后加入96孔板中室溫下避光放置30min，再在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光度值。測(cè)得的OD數(shù)值按公式計(jì)算：清除DPPH自由基能力（%）=[（對(duì)照值-對(duì)照空白值）-（樣品值-樣品空白值）]×100/（對(duì)照值-對(duì)照空白值）[8]，對(duì)照組為沒(méi)有加入樣品孔，空白組為加入樣品但沒(méi)有加入DPPH試劑孔。

1.2.4 Ames抗突變實(shí)驗(yàn) 沱茶提取物設(shè)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量組（1.25、2.5mg/皿）、自發(fā)回變組（加入濃度為1～2× 109個(gè)/mL的TA100菌株0.1mL，不加入致突變物）和對(duì)照組（加入TA100菌株和致突變物（MNNG）50μL），每組設(shè)3個(gè)平行皿。在樣品實(shí)驗(yàn)組的滅菌試管中加入磷酸鹽緩沖液、濃度為1～2×109個(gè)/mL的培養(yǎng)12h后的TA100菌株0.1mL、樣品物質(zhì)提取物溶液50μL和致突變物（MNNG）50μL。輕微振蕩后37℃下放置30min后加入頂層培養(yǎng)基2mL混合，再倒在底層培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)計(jì)算結(jié)果。抑制率（%）=[（對(duì)照組菌落數(shù)-樣品處理組菌落數(shù)）/（對(duì)照組菌落數(shù)-自發(fā)回變組菌落數(shù)）]×100[9]。

1.2.5 MMT法測(cè)定沱茶提取物的體外癌細(xì)胞增值抑制效果 將體外培養(yǎng)的AGS人胃癌細(xì)胞和HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞復(fù)蘇后接種在含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，將癌細(xì)胞放置在培養(yǎng)箱中以5%的CO2、37℃條件下培養(yǎng)，每周更換培養(yǎng)液2～3次并進(jìn)行傳代培養(yǎng)一次。按每孔200μL將含癌細(xì)胞培養(yǎng)液接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)液的癌細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL。然后將96孔培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。吸出96孔板中各孔的培養(yǎng)液，樣品組各孔中加入沱茶提取物的培養(yǎng)液200μL，空白組各孔中加入新培養(yǎng)液200μL。再經(jīng)過(guò)48h培養(yǎng)后，再次吸出各孔內(nèi)上清液，各孔再加入200μL濃度5mg/mL的MTT試劑后繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸出各孔內(nèi)的上清液，在每孔中加入200μL的DMSO后避光振蕩30min，用酶標(biāo)儀在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD值，按公式：抑制率（%）=[（空白孔OD值-樣品孔OD值）/空白孔OD值]×100計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[10]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得到數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA法分析數(shù)據(jù)結(jié)果是否存在差異性（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 下關(guān)生沱茶和熟沱茶成分的比較

通過(guò)LC-MS分析，通過(guò)MS/M分解圖中各樣品質(zhì)譜圖（圖1）和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，觀察到在生沱茶含有沒(méi)食子酸（1.70min，m/z169）、表沒(méi)食子兒茶素（9.10min，m/z305）、兒茶素（9.30min，m/z289）、咖啡因（9.62min，m/z195）、表兒茶素（10.73min，m/z289）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（10.87min，m/z457）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（12.51min，m/z441）、槲皮素-3-半乳糖甙（12.74min，m/z463）、山柰酚-3-蕓香糖甙（13.24min，m/z593）、山柰酚-3-葡萄糖苷（13.51min，m/z447）、槲皮苷（15.39min，m/z301）和葉黃素（25.09min，m/z568）這十二種化合物（圖2A）。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后在熟沱茶中除了生沱茶中出現(xiàn)的十二種化合物外還出現(xiàn)了兩種新的化合物，為二羥基苯酸（3.43min，m/z153）和山奈酚（17.37min，m/z285），另外經(jīng)過(guò)發(fā)酵后熟沱茶中的沒(méi)食子酸、二羥基苯酸、槲皮苷、山奈酚和兩種未知成分的含量較生沱茶明顯提高，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和一種未知成分的含量大幅度下降，含量下降的未知成分有待進(jìn)一步研究（圖2B，1）。

2.2 下關(guān)生沱茶和熟沱茶抗氧化效果的比較

通過(guò)測(cè)定下關(guān)生沱茶和熟沱茶提取物的羥基自由基和DPPH自由基清除能力可以判斷沱茶的抗氧化效果。100、200、500μg/mL三個(gè)濃度下，隨著濃度的升高，生沱茶和熟沱茶的羥基自由基和DPPH自由基清除能力均得到提高；在不同實(shí)驗(yàn)濃度下，熟沱茶的清除自由基能力都強(qiáng)于生沱茶（圖3、圖4）。表沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和表兒茶素沒(méi)食子酸酯作為茶多酚的四種單體存在形式具有較強(qiáng)的抗氧化效果[9]，沒(méi)食子酸和槲皮苷也是具有很強(qiáng)清除自由基能力的化合物[11-12]。沱茶生茶和熟茶都含有這些具有抗氧化物質(zhì)，特別是茶多酚物質(zhì)等有效成分使沱茶產(chǎn)生抗氧化效果。山奈酚是一種黃酮醇類物質(zhì)，也是一種強(qiáng)抗氧化物質(zhì)[13]，也存在與生沱茶和熟沱茶中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵中一系列生化反應(yīng)，熟沱茶中的山奈酚增加，是使熟沱茶具有更強(qiáng)抗氧化性效果的原因之一。同時(shí)，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，熟沱茶內(nèi)的原有的抗氧化成分含量增加并且生成了新的抗氧化物質(zhì)，進(jìn)一步提高了沱茶的抗氧化作用。有研究表明，通過(guò)SD大鼠高脂模型對(duì)云南普洱茶體內(nèi)抗氧化性研究中，普洱熟茶表現(xiàn)出比普洱生茶更好的抗氧化作用[14]，沱茶的原料和生產(chǎn)方式都和普洱茶十分接近，本研究得出的熟沱茶具有更好抗氧化性的結(jié)果也與之相同。

圖1 下關(guān)熟沱茶質(zhì)譜和MS/MS分解圖中重要的14個(gè)峰圖Fig.1 Mass spectra and MS/MS fragmentation patterns of 14 important peaks of Xiaguan ripe bowl tea

圖2 下關(guān)沱茶的HPLC-PDA色譜圖（200～600nm）Fig.2 HPLC-PDA chromatogram（200～600nm）for Xiaguan bowl tea

圖3 下關(guān)沱茶提取物的羥基自由基清除效果Fig.3 Effect of Xiaguan bowl tea extracts in hydroxyl radical（OH）radical scavenging activity

圖4 下關(guān)沱茶提取物的DPPH自由基清除效果Fig.4 Effect of Xiaguan bowl tea extracts in DPPH radical scavenging activity

2.3 下關(guān)生沱茶和熟沱茶抗突變效果的比較

總體上，下關(guān)生沱茶和熟沱茶的提取物對(duì)MNNG誘導(dǎo)的TA100菌具有一定的抑制作用。由表1可知，提取物濃度為1.25、2.5mg/皿時(shí)生沱茶的抑制率為33.6%和61.2%，熟沱茶對(duì)TA100的抑制率比生沱茶有所提高，分別為39.7%和74.2%。茶葉中提取的茶多酚具有很強(qiáng)的抗突變效果，它不僅有促進(jìn)細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)功能，也有減少誘變劑活化表現(xiàn)抗誘變功能，可以作為去突變劑[15]。生熟沱茶中都含有表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和表兒茶素沒(méi)食子酸酯等茶多酚物質(zhì)，這些茶多酚促進(jìn)了沱茶的抗突變效果。沒(méi)食子酸和槲皮苷已經(jīng)被證實(shí)為具有良好抗突變性的化合物[16-17]，熟沱茶中含有很多的沒(méi)食子酸和槲皮苷，進(jìn)一步促進(jìn)了沱茶的抗突變效果。食品的抗氧化效果與抗突變效果相對(duì)應(yīng)，抗氧化性強(qiáng)的食品常常也表現(xiàn)出強(qiáng)的抗突變性[18-19]，本研究中熟沱茶抗氧化性強(qiáng)于生沱茶。由此可見(jiàn)，沱茶具有抗突變作用，并且經(jīng)過(guò)發(fā)酵的熟沱茶效果更為明顯。

表1 沱茶提取物在致突變物N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG，0.4μg/皿）誘導(dǎo)TAIO0菌株下抗突變效果Table.1 Inhibitory effects of Xiaguan bowl tea extracts against MNNG·induced mutation（0.4μg/disc）of nutrient deficiency strain TA100 of Salmonella typhimurium

2.4 下關(guān)生沱茶和熟沱茶癌細(xì)胞體外增殖抑制效果的比較

觀察體外癌細(xì)胞增殖的變化情況可以從一定程度上判斷食品的抗癌功能性[20]。下關(guān)生沱茶和熟沱茶提取物分別對(duì)體外生長(zhǎng)的AGS胃癌細(xì)胞和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察其體外增殖抑制效果。由表2可知，用MTT法觀察不同濃度提取物處理癌細(xì)胞后的OD值讀數(shù)可以看到樣品處理各組細(xì)胞的OD值較對(duì)照組OD值明顯下降（p＜0.05），高濃度生沱茶和熟沱茶提取物處理癌細(xì)胞后，AGS和HT-29細(xì)胞的OD值均低于低濃度處理時(shí)，通過(guò)計(jì)算可得出高濃度樣品處理時(shí)具有更高的體外癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，而且熟沱茶提取物對(duì)AGS和HT-29癌細(xì)胞在兩個(gè)濃度上的生長(zhǎng)抑制效果均高于生沱茶提取物。

普洱熟茶在發(fā)酵過(guò)程發(fā)生了例如多酚類化合物非酶性自動(dòng)氧化等反應(yīng)，茶葉內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生了變化[21]，這些變化使普洱熟茶比生茶具有更好的保健作用，同時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵時(shí)間、溫度、濕度、微生物種群和數(shù)量都是造成這些差異的關(guān)鍵因素[22]。體內(nèi)細(xì)胞突變可導(dǎo)致癌癥，防止突變是控制癌癥的一個(gè)重要方式[23]。沱茶在發(fā)酵過(guò)程中含量增加的沒(méi)食子酸和槲皮苷增強(qiáng)了熟沱茶的抗突變效果，對(duì)癌細(xì)胞的作用也隨之加強(qiáng)。本文中下關(guān)沱茶作為普洱茶的一種也表現(xiàn)出了類似的結(jié)果，除了在抗氧化和抗突變效果上優(yōu)于生沱茶，在體外抗癌效果上也表現(xiàn)出更強(qiáng)的效果。由成分分析的結(jié)果也可以看出隨著成分含量的變化和新的成分在發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)生，這些成分造成的協(xié)同作用也發(fā)生了變化，產(chǎn)生了更好的抗癌保健作用，使熟沱茶成為一種更有保健價(jià)值的食品。

表2 沱茶提取物對(duì)AGS和HT-29癌細(xì)胞的體外增值抑制效果Table.2 Growth inhibitory effect of Xiaguan bowl tea extracts on AGS and HT-29 cancer cells

3 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，沱茶中含有十多種有效成分，其中包括多種茶多酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)是茶葉中重要的功效成分，這些功效成分使生熟沱茶都具有很好的體外抗氧化、抗突變和抗癌效果。熟沱茶由于經(jīng)過(guò)了發(fā)酵過(guò)程，其化學(xué)成分與未發(fā)酵的生沱茶也有一定的差異。由于發(fā)酵前后沱茶的成分發(fā)生改變，發(fā)酵前后生沱茶與熟沱茶的抗氧化、抗突變和癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用也出現(xiàn)差異，熟沱茶中產(chǎn)生了沒(méi)食子酸和槲皮苷等化合物，這些功能性物質(zhì)加強(qiáng)了熟沱茶的體外功能性作用，所以熟沱茶具有很好的體外抗氧化、抗突變和抗癌能力。綜合本研究中各項(xiàng)結(jié)果可以看出下關(guān)沱茶是一種含有多種功能性成分的健康食品，并且經(jīng)過(guò)發(fā)酵后得到的熟沱茶的功能性成分更多，具有更高的價(jià)值。

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表11 凝膠時(shí)間對(duì)內(nèi)酯豆乳凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響（x±SD）Table.11 Effect of gel time on the texture properties of lactone soybean ge（lx±SD）

表12 凝膠時(shí)間對(duì)內(nèi)酯牛乳凝膠的質(zhì)構(gòu)特性的影響（x±SD）Table.12 Effect of gel time on the texture properties of lactone milk ge（lx±SD）

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Comparative study on component analysis and in vitro functional effects of Xiaguan raw and ripe bowl tea

WANG Rui，ZHAO Xin*
（Department of Biological and Chemical Engineering，Chongqing University of Education，Chongqing 400067，China）

By LC-MS analysis，twelve kinds of components were found in both Xiaguan raw and ripe bowl tea，they weregallic acid，epigallocatechin，catechin，caffeine，epicatechin，epigallocatechin gallate，epicatechin gallate，quercetin-3-galactoside，kaempferol-3-rutinoside，kaempferol-3-glucoside，quercetin，and lutein.After fermentation，resorcylic acid and kaempferol were only found in ripe Xiaguan bowl tea，and the gallic acid and quercetin concentrations were increased in ripe Xiaguan bowl tea.By the functional components increasing，ripe Xiaguan bowl tea showed the better antioxidant，antimutagenicity and anticancer effects than raw Xiaguan bowl tea in using in vitro experiments.

Xiaguan bowl tea；component analysis；LC-MS；antioxidant；anticancer

TS201.1

A

1002-0306（2014）06-0150-06

2013－07－17 *通訊聯(lián)系人

王睿（1982-），男，碩士研究生，講師，研究方向：食品加工及工程化。

重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（KJTD201325）。