動態(tài)監(jiān)測三種兒茶素單體清除自由基能力

劉彥霞，田 強

（北京聯(lián)合大學應用文理學院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京100191）

動態(tài)監(jiān)測三種兒茶素單體清除自由基能力

劉彥霞，田 強

（北京聯(lián)合大學應用文理學院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京100191）

以Trolox為參照物，動態(tài)監(jiān)測葡萄籽中所富含的兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）清除ABTS+·與DPPH·自由基的過程，比較三種兒茶素單體體外清除自由基的能力。結(jié)果顯示在兩種反應體系中，對于同一樣品，隨著濃度增大其自由基清除能力增強；Trolox與自由基反應達到平衡所需時間最短，但其自由基清除率低于ECG，兩種反應體系中Trolox與EC、C清除自由基的能力大小順序不同。總體來看，三種兒茶素單體清除自由基的能力ECG＞EC＞C。

兒茶素，DPPH·，ABTS+·

研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)自由基過量是誘發(fā)多種疾病的根源，利用抗氧化劑清除多余的自由基，有益于疾病的預防及治療[1]。兒茶素類物質(zhì)廣泛存在于植物界，葡萄與茶葉中此類物質(zhì)含量最為豐富。此類物質(zhì)由于分子中具有連（或鄰）苯酚基結(jié)構(gòu)具有強抗氧化活性[2-3]。茶葉中兒茶素類物質(zhì)主要有表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶酸酯（EGCG），其中EGCG的含量最高。有關EGCG、EC、EGC、ECG抗氧化能力進行研究的文獻報道較多[4-6]，一般認為酯型兒茶素的抗氧化能力較簡單兒茶素強，但不同體系研究結(jié)果不一致。在較早的研究中，梁鋼等利用維生素C-NADPH誘發(fā)的腦、肝、腎微粒體的脂質(zhì)過氧化體系對EGCG、EC及ECG的抗氧化能力進行研究，發(fā)現(xiàn)其中EGCG作用最強，EC次之，而ECG作用最弱[7]；涂云飛等利用二次通用旋轉(zhuǎn)回歸設計對兒茶素各成分清除羥自由基能力進行比較發(fā)現(xiàn)，ECG＞EC＞EGCG[8]。

葡萄籽是葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)主要的副產(chǎn)品，其中所含有的兒茶素單體類物質(zhì)主要有兒茶素（C）、EC、ECG[9]。茶葉中針對兒茶素類物質(zhì)清除自由基能力的研究能夠為葡萄籽中此類物質(zhì)的應用提供參考，但鑒于兩種原料所含兒茶素種類不同，且研究結(jié)果有待進一步分析，所以葡萄籽中兒茶素物質(zhì)抗氧化活性仍需要進一步的研究。DPPH·、ABTS+·分別為穩(wěn)定的脂溶性與水溶性自由基，常被用于抗氧化劑清除自由基能力的檢測[10-11]，但不同物質(zhì)因結(jié)構(gòu)不同，與DPPH·、ABTS+·反應速率不同，因此反應到達平衡的時間也存在差異，因此用固定時間清除率或EC50值（自由基清除率為50%時所需樣品濃度）表示可能會判斷錯誤[12]。本文以抗氧化劑Trolox作為參考，對葡萄籽中富含的三種兒茶素單體C、EC、ECG清除自由基的能力進行動態(tài)監(jiān)測，以期為葡萄籽中此類物質(zhì)的開發(fā)利用及功能食品的功能評價方法研究提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯對照品（純度＞98%） 購于中國藥品生物制品檢定所；ABTS+· [2，2’-Azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）]、DPPH·[2，2-Diphenyl-2-picrylhydrazyl]、Trolox [6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman2-carboxxylic acid] 購于Aladdin公司。

UV-2450型紫外可見分光光度計 日本SHIMADZU公司；榮華HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

1.2.1.1 DPPH·法標準曲線的制作 配制濃度分別為0.05、0.0375、0.0250、0.0125、0.0062、0.0031mg/mL的DPPH·乙醇溶液，檢測各濃度DPPH·溶液在517nm下的吸收值，每個濃度重復3次，取平均值。以DPPH·濃度為橫坐標，517nm下的吸收值為縱坐標做標準曲線。

1.2.1.2 ABTS+·標準曲線的制作 配制濃度分別為0.07、0.0525、0.0350、0.0175、0.00875、0.00437mg/mL的ABTS+·水溶液，檢測各濃度ABTS+·溶液在734nm下的吸收值，每個濃度重復3次，取平均值。以ABTS+·濃度為橫坐標，734nm下的吸收值為縱坐標做標準曲線。

1.2.2 樣品溶液的配制

1.2.2.1 Trolox樣品溶液 用十萬分之一天平準確稱取Trolox 20mg，溶解于少量95%乙醇并定容于50mL，用95%乙醇稀釋至濃度為0.05、0.025、0.0125mg/mL。

1.2.2.2 C、EC、ECG樣品溶液 方法參考1.2.2.1。

1.2.2.3 ABTS+·工作液 配制方法參考劉薇等[13]。

1.2.3 樣品的測定步驟

1.2.3.1 DPPH·法 于3mL 0.05mg/mL DPPH·溶液中分別加入0.5mL不同濃度的EC、C、ECG、Trolox溶液，反應總體積為3.5mL，在517nm處測定隨時間變化的吸收值的動力學趨勢，每30s取值1次，至1h。記錄吸收值（AT），同時測定3mL DPPH·工作液中加入0.5mL 95%乙醇溶液的吸收值（A0），每個濃度3次重復。按表1測定。

定義2 端到端的時延：是指一個數(shù)據(jù)包從源節(jié)點到達目的節(jié)點所花費的時間，它是一個重要的衡量指標，因為它的大小能夠直接反應出路由協(xié)議的性能，這里取平均值.

表1 DPPH·法樣品測定的步驟Table.1 Steps of measuring the samples’capacity of scavenging DPPH·

DPPH·自由基清除率計算方法參考李小飛等[14]，稍作調(diào)整：

式中，a、b分別為DPPH·標準曲線中的斜率與截距。

1.2.3.2 ABTS+·法 向4.5mL 0.07mg/mL ABTS+·溶液中分別加入0.5mL不同濃度的EC、C、ECG、Trolox溶液，反應總體積為5mL，在734nm處測定隨時間變化的吸收值的動力學趨勢，每30s取值1次，至1h。記錄吸收值（AT1），同時測定4.5mL ABTS+·工作液中加入0.5mL 95%乙醇溶液的吸收值（A01），每個濃度3次重復。按表2測定。

表2 ABTS+·法樣品測定的步驟Table.2 Steps of measuring the samples’capacity of scavenging ABTS+·

ABTS+·自由基清除率計算方法參考文獻李小飛等[14]，稍作調(diào)整：

式中，c、d分別為ABTS+·標準曲線中的斜率與截距。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

圖1所示分別為DPPH·與ABTS+·兩種自由基的標準曲線，線性關系均達到0.999，可以用于定量分析。

圖1 自由基濃度-吸光值標準曲線Fig.1 Standard concentration-absorbance curve

2.2.1 動態(tài)監(jiān)測兒茶素清除DPPH·自由基能力DPPH·自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，在517nm波長處有最大吸收。DPPH·乙醇溶液呈紫色，其濃度與吸光度呈線性關系。在DPPH·乙醇溶液中加入被測物質(zhì)，被測物質(zhì)中的抗氧化成分會與DPPH·自由基結(jié)合，使DPPH·自由基數(shù)量減少，溶液顏色變淺，在517nm波長處的吸光度不斷下降，直至達到穩(wěn)定。

圖2 樣品濃度為0.05mg/mL時各樣品對DPPH·自由基清除率隨時間的變化Fig.2 Change of DPPH·radical scavenging rate of samples with concentration of 0.05mg/mL

圖3 樣品濃度為0.025mg/mL時各樣品對DPPH·自由基清除率隨時間的變化Fig.3 Change of DPPH·radical scavenging rate of samples with concentration of 0.025mg/mL

圖4 樣品濃度為0.0125mg/mL時各樣品對DPPH·自由基清除率隨時間的變化Fig.4 Change of DPPH·radical scavenging rate of samples with concentration of 0.0125mg/mL

圖2～圖4分別表示樣品濃度分別為0.05、0.025、 0.0125mg/mL時，Trolox、C、EC、ECG對DPPH·自由基清除率隨時間變化的情況。

每種物質(zhì)在不同濃度時對于DPPH·自由基的清除率不同，并隨著濃度的增高而變大，存在一定的量效關系。Trolox反應達到平衡所需時間較短，在較低的兩個濃度下，2min內(nèi)達到平衡，濃度較高時，于6min之前達到平衡。當樣品濃度不同，反應到達平衡時的清除率分別為：當濃度為0.0125mg/mL時，其DPPH·自由基清除率約15%；濃度為0.025mg/mL時，清除率約24%；在濃度為0.05mg/mL時，清除率約70%。C、EC、ECG的DPPH·清除率達到平衡所需時間較長，在60min之內(nèi)始終顯示逐漸增大的趨勢。在反應進行到60min時，EC的DPPH·清除率在低中高三個濃度下分別為：約10%、35%、56%；ECG的DPPH·清除率在兩個較低濃度時達到50%，在最高濃度時達到86%。在三個濃度下，ECG清除DPPH·自由基的清除率最高，Trolox的DPPH·清除率在最高與最低濃度時都僅次于ECG，高于EC、C，但在中間濃度時EC的自由基清除能力在30min之前低于Trolox，而此后超過了Trolox。三種兒茶素中C的清除DPPH·自由基的能力最弱，在最高濃度達到平衡時其DPPH·清除率約12%。三種兒茶素清除DPPH·自由基的能力ECG＞EC＞C。

2.2.2 動態(tài)監(jiān)測兒茶素清除ABTS+·自由基能力

ABTS+·是經(jīng)過硫酸鉀氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基，其水溶液最大吸收波長為734nm。向該反應體系中加入被測物質(zhì)，如果被測物質(zhì)中存在抗氧化成分，抗氧化成分會與ABTS+·發(fā)生反應而使ABTS+·在734nm的吸光值降低。

圖5～圖7分別表示樣品濃度分別為0.05、0.025、0.0125mg/mL時，Trolox、C、EC、ECG對ABTS+·自由基清除率隨時間變化的情況。

圖5 樣品濃度為0.05mg/mL時各樣品對ABTS+·自由基清除率隨時間的變化Fig.5 Change of ABTS+·radical scavenging rate of samples with concentration of 0.05mg/mL

每種物質(zhì)在不同濃度時對于ABTS+·自由基的清除率不同，并隨著濃度的增高而升高，存在一定的量效關系。Trolox在三個濃度梯度下都是在2min之內(nèi)就達到了平衡，其ABTS+·自由基的清除率始終低于三種兒茶素。Trolox的濃度不同，當反應達到平衡時對ABTS+·自由基的清除率也不同，在濃度為0.0125mg/mL時，其ABTS+·自由基清除率約14%；濃度為0.025mg/mL時，清除率約27%；在濃度為0.05mg/mL時，清除率約47%。在兩個較低濃度下，C、EC、ECG三者的ABTS+·自由基清除率變化情況相似，ECG與EC清除率變化曲線幾乎重疊，二者對ABTS+·自由基清除率高于C，樣品濃度為0.025mg/mL時，ECG與EC都在10min之內(nèi)達到反應平衡。在樣品濃度為0.05mg/mL時，兒茶素與表兒茶素自由基清除率隨時間的變化曲線幾乎重疊，在反應2min時清除率為65%左右，而至反應60min時清除率達到95%左右。ECG在濃度為0.05mg/mL時于2min之內(nèi)自由基清除率達到最大99%?？傮w來說，三種兒茶素清除ABTS+·自由基的能力ECG＞EC＞C，這與以往酯型兒茶素抗氧化能力強于簡單兒茶素的觀點相一致。李華等[15]曾從分子中相關原子所帶凈電荷及活性中心原子的鍵長來分析分子活性，分子活性中心凈電荷值越大，分子活性越強；分子中活性中心原子的鍵長越長，易脫氫，因此越活潑。Trolox在兩種自由基體系中反應達到平衡所需時間較兒茶素類物質(zhì)短，但在相同濃度下，對于DPPH·與ABTS+·兩種自由基，其清除能力均較ECG弱；在ABTS+·這種水溶性的自由基體系中，Trolox清除自由基的能力低于C、EC，而在DPPH·這種脂溶性體系中，其清除自由基的能力強于C與EC，這一結(jié)果可能與反應體系及抗氧化劑的分子結(jié)構(gòu)不同有關，在不同反應體系中，抗氧化劑供氫或電子轉(zhuǎn)移的速度表現(xiàn)也不同。

圖6 樣品濃度為0.025mg/mL時各樣品對ABTS+·自由基清除率隨時間的變化Fig.6 Change of ABTS+·radical scavenging rate of samples with concentration of 0.025mg/mL

圖7 樣品濃度為0.0125mg/mL時各樣品對ABTS+·自由基清除率隨時間的變化Fig.7 Change of ABTS+·radical scavenging rate of samples with concentration of 0.0125mg/mL

3 結(jié)論

本研究運用DPPH·、ABTS+·兩種自由基反應體系對兒茶素單體清除自由基能力進行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)：不同物質(zhì)清除同一種自由基時達到反應平衡的時間不同，在本實驗中，Trolox在兩種自由基反應體系中達到反應平衡所需時間都最短；同一種物質(zhì)，不同濃度達到反應平衡時的清除率也不同，如對于同一種兒茶素，樣品濃度增大其自由基清除能力增高。因此，在對不同物質(zhì)的抗氧化能力進行對比時，要在相同濃度條件下，反應都能達到平衡時的自由基清除率相比較才有可比性。此實驗中，在兩種自由基反應體系中，ECG在各濃度水平下自由基清除能力都最強，EC自由基清除率高于C，因此總體來看，三種兒茶素單體清除自由基的能力ECG＞EC＞C，酯型兒茶素抗氧化能力強于兒茶素單體的結(jié)果與以往研究相一致，EC清除自由基強于可能與其構(gòu)型有關，其作用機理仍然需要研究。

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Comparing the capacity of three kinds of catechins in scavenging free radicals

LIU Yan-xia，TIAN Qiang
（Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods，College of Arts and Science，Beijing Union University，Beijing 100191，China）

The in vitro scavenging capacity of（+）-Catehicn（C），（-）-Epicatechin（EC）and（-）-Epicatechin-3-O-gallate（ECG）were compared，by monitoring the scavenging rate of DPPH·and ABTS+·，with the Trolox as the reference.The result showed that，for the same sample，the radical scavenging rate increased with its concentration increasing.Trolox reached equilibrium with the shortest time，but its ability of scavenging free radical was below that of ECG.Trolox，C，and EC were in different order in two reactive systems.In general，the free radical scavenging capacity of these three kinds of catechins was in the order of ECG＞EC＞C.

catechins；DPPH·；ABTS+·

TS207.3

A

1002-0306（2014）06-0136-05

2013－07－19

劉彥霞（1976-），女，博士，助理研究員，研究方向：保健食品功能評價。

北京市教委重點實驗室引導基金項目。