PEG/Na2SO4雙水相萃取木瓜蛋白酶的研究

PEG/Na2SO4雙水相萃取木瓜蛋白酶的研究

王偉濤，張海德*，蔣志國(guó)，董安華，許英豪，彭 健，王 斐
（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

采用聚乙二醇（PEG）/硫酸鈉（Na2SO4）雙水相體系對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行分離提取?？疾旄鞒上嘣噭┘皃H對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響，研究體系中不同相對(duì)分子量PEG、硫酸鈉和PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、酶添加量等因素對(duì)木瓜蛋白酶在兩相體系中分配行為的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分離條件，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的放大。結(jié)果表明：Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響極顯著，其次是PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，pH對(duì)分配行為的影響不顯著。當(dāng)兩相體系中PEG的相對(duì)分子量為6000，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.0%、Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.0%、pH7.0、酶添加量為1.0mg/g時(shí)，木瓜蛋白酶在兩相體系中的分配系數(shù)最高可達(dá)3.1，可獲得木瓜蛋白酶活性回收率82.6%。實(shí)驗(yàn)證明：響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相萃取木瓜蛋白酶的條件是可行的，可用于實(shí)際預(yù)測(cè)。

木瓜蛋白酶，雙水相，分配系數(shù)，酶活性回收率

木瓜蛋白酶（EC3.4.22.2）具有耐高溫、穩(wěn)定性好、蛋白質(zhì)水解能力強(qiáng)等特征，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前木瓜蛋白酶的分離純化方法主要有：超濾法、鹽析法、有機(jī)溶劑法、親和層析法等。但這些純化木瓜蛋白酶的方法都存在一些問(wèn)題[1]，有必要尋找制備高純度高活性木瓜蛋白酶的新方法。雙水相萃取是分離和純化酶及蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)的一種新方法，具有條件溫和、產(chǎn)品活性損失小、處理量大、分離步驟少、無(wú)有機(jī)溶劑殘留、設(shè)備投資小、操作簡(jiǎn)單、易于工程放大和連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)，非常適合大規(guī)模應(yīng)用[2]。而對(duì)木瓜蛋白酶雙水相萃取的研究主要集中在PEG/（NH4）2SO4和PEG/磷酸鹽雙水相系統(tǒng)[1]，PEG/Na2SO4雙水相萃取木瓜蛋白酶的研究報(bào)道甚少。

本實(shí)驗(yàn)擬采用聚乙二醇（PEG）/硫酸鈉（Na2SO4）雙水相體系，考察聚乙二醇相對(duì)分子量，PEG和硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、酶添加量等因素對(duì)木瓜蛋白酶在兩相體系中分配行為的影響，并采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了木瓜蛋白酶萃取條件，為大力推動(dòng)木瓜蛋白酶工業(yè)化高效制備的發(fā)展提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木瓜蛋白酶（BR） 生物生工有限公司；PEG2000（化學(xué)純）、PEG4000（化學(xué)純）、PEG6000（化學(xué)純）、G-250 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鈉（分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；其他 均為市售分析純。

TU1901型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用有限責(zé)任公司；DK-98-1型恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木瓜蛋白酶活性的測(cè)定 以酪蛋白為底物，測(cè)定木瓜蛋白酶的活性[3]。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)雙水相中蛋白質(zhì)的含量[4]。

1.2.3 雙水相萃取木瓜蛋白酶 配制一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG和Na2SO4原溶液，構(gòu)造不同的雙水相體系，加入計(jì)算好的PEG和Na2SO4原溶液以及木瓜蛋白酶溶液（10.0mg/m L），然后加去離子水至20.0g，常溫振蕩30.0min，然后靜置至分相。讀取上下相體積，按1.2.2測(cè)上下相的蛋白質(zhì)濃度P（mg/m L），按1.2.1測(cè)上相的酶活性濃度E（U/m L），計(jì)算相比R、分配系數(shù)K和酶活性回收率Y（%）。計(jì)算式為：

R=Vtop/Vbot

式中，Vtop—上相體積（m L）；Vbot—下相體積（m L）。

式中，Ptop—上相蛋白濃度（mg/m L），Pbot—下相蛋白濃度（mg/m l）。

Y（%）=Etop×Vtop/Me×100

式中，Etop—上相酶活性濃度（U/m L）；Me—加入系統(tǒng)酶的總活性（U）。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 不同pH的酶活性 常溫下配制不同pH的酶溶液，按1.2.1測(cè)酶活性。

1.3.2 各成相試劑對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、25.0%、30.0%的PEG（2000，4000，6000），硫酸鈉溶液，各取2.0m L分別加入1.0m L稀釋一定倍數(shù)的酶溶液，放置10.0min后測(cè)酶活性。空白取2.0m L去離子水加1.0m L相同稀釋倍數(shù)的酶溶液。以酶活活性比X為指標(biāo)，考察各成相試劑對(duì)酶活性的影響。

X（%）=成相物質(zhì)存在時(shí)的酶活/空白試劑的酶活×100

1.3.3 不同相對(duì)分子量PEG對(duì)分配行為的影響 固定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.0%，Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.0%，pH 7.0，酶添加量1.0mg/g（酶的質(zhì)量/系統(tǒng)的總質(zhì)量，以下同），考察不同PEG相對(duì)分子量對(duì)分配行為的影響。

1.3.4 不同Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響 固定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.0%，pH 7.0，酶添加量1.0mg/g，考察不同Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響，為進(jìn)一步研究PEG相對(duì)分子量對(duì)分配行為的影響，選取PEG2000、PEG4000、PEG6000進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響 固定Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.0%，pH7.0，酶添加量1.0mg/g，考察不同PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響。

1.3.6 不同pH對(duì)分配行為的影響 固定16.0%（w/w） PEG6000，16.0%（w/w）Na2SO4，酶添加量1.0mg/g，考察不同pH對(duì)分配行為的影響。

1.3.7 不同酶添加量對(duì)分配行為的影響 固定16.0%（w/w）PEG6000，16.0%（w/w）Na2SO4，pH7.0，考察酶添加量對(duì)分配行為的影響。

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)X1（pH），X2（Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)），X3（PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的雙水相萃取條件，以分配系數(shù)（K）和酶活性回收率（Y，%）兩個(gè)響應(yīng)值（實(shí)驗(yàn)用酶為木瓜蛋白酶制劑，純度較高，故分配系數(shù)和酶活性回收率應(yīng)為正相關(guān)）為考察對(duì)象，實(shí)驗(yàn)因素的水平編碼表見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平編碼表Table 1 Listof coded factors and levels for RSM

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

使用Excel和SAS 9.3軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH的酶活性

圖1 不同pH的酶活性Fig.1 The activity of enzyme at different pH value

由圖1可知，隨著pH增大，木瓜蛋白酶的活性先增大后減小，在pH 7.0時(shí)達(dá)到最大。原因是木瓜蛋白酶是中性蛋白，且耐酸耐堿，有較寬的pH適應(yīng)性[5]。

2.2 各成相試劑對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響

由圖2可知，PEG2000在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)對(duì)酶活性有一定的促進(jìn)作用，但隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶活活性比逐漸降低，可知高濃度的PEG2000對(duì)木瓜蛋白酶的活性有抑制作用。PEG4000和PEG6000對(duì)木瓜蛋白酶的活性幾乎沒(méi)有影響（允許誤差范圍內(nèi)）。隨著Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶活活性比逐漸降低，對(duì)酶活性抑制作用加強(qiáng)，所以在實(shí)驗(yàn)中，Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)小于20.0%。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的成相劑對(duì)酶活性的影響Fig.2 Effect of concentration of ingredients on the activity of enzyme

2.3 不同相對(duì)分子量PEG對(duì)分配行為的影響

圖3 不同相對(duì)分子量PEG對(duì)分配行為的影響Fig.3 Effectof differentmolecularweight PEG on partitioning behavior

由圖3可知，隨著PEG相對(duì)分子量的增加，分配系數(shù)和酶活性回收率都在增加。原因是實(shí)驗(yàn)所用的木瓜蛋白酶疏水性較強(qiáng)[6]，而PEG的疏水性隨著相對(duì)分子量的增大而增大，則疏水性較強(qiáng)的木瓜蛋白酶更趨向分配于上相。

2.4 不同Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響

圖4 不同Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響Fig.4 Effectof Na2SO4concentration on partitioning behavior

鹽的正、負(fù)離子在兩相間分配系數(shù)不同，兩相間形成電位差，從而影響帶電生物大分子的分配。無(wú)機(jī)鹽濃度的不同能改變兩相間的電位差。如圖4所示，隨著Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，PEG2000/Na2SO4系統(tǒng)的分配系數(shù)和酶活性回收率逐漸增大，但都比較低，說(shuō)明在所選取的Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，PEG2000/Na2SO4系統(tǒng)并未達(dá)到最佳的分配效果，應(yīng)繼續(xù)增大Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但過(guò)多的Na2SO4一方面對(duì)木瓜蛋白酶的影響比較大，另一方面增加物料的使用，故舍去PEG2000/Na2SO4系統(tǒng)；PEG4000/Na2SO4系統(tǒng)的分配系數(shù)和酶活性回收率先增大后減小，在Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.0%時(shí)達(dá)到最大，分配系數(shù)2.43，酶活性回收率77.54%；PEG6000/Na2SO4系統(tǒng)的分配系數(shù)和酶活性回收率也是先增大后減小，在Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.0%時(shí)達(dá)到最大，分配系數(shù)2.52，酶活性回收率77.87%。無(wú)機(jī)鹽的鹽析作用是雙水相成相的主要原因之一[7]，增大Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，無(wú)機(jī)鹽的鹽析作用加強(qiáng)，木瓜蛋白酶更趨向分配于上相，但過(guò)多的無(wú)機(jī)鹽對(duì)酶的活性影響很大，所以Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不易太大。結(jié)合實(shí)驗(yàn)2.3，選擇Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.0%的PEG6000/Na2SO4系統(tǒng)為最佳系統(tǒng)，不僅分配效果好，且節(jié)省物料。

2.5 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響

圖5 不同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響Fig.5 Effectof concentration of PEG on partitioning behavior

如圖5所示，隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，PEG6000/ Na2SO4系統(tǒng)的分配系數(shù)和酶活性回收率先增大后減小，在PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.0%時(shí)達(dá)到最大，分配系數(shù)2.46，酶活性回收率76.52%。原因是增大PEG的用量可以增大相比，使分配系數(shù)和回收率增大，繼續(xù)增大PEG的用量使體系黏度增加，阻止了相間分子轉(zhuǎn)移，在兩相之間形成乳化層，使下相中的酶分子滯留在兩相之間，分配系數(shù)和回收率反而降低。實(shí)驗(yàn)選擇PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.0%構(gòu)成的PEG/Na2SO4雙水相體系為最佳。

2.6 不同pH對(duì)分配行為的影響

pH影響蛋白質(zhì)所帶電荷的種類和多少，從而影響蛋白質(zhì)與體系氫鍵和電荷效應(yīng)，最終影響酶在雙水相中的分配行為，同時(shí)影響雙水相體系中鹽的解離度而改變相間電位差，如體系pH與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差越大，蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻，pH的微小變化甚至可能使蛋白質(zhì)分子的分配系數(shù)改變2～3個(gè)數(shù)量級(jí)[8]。由圖6可知，隨著pH的增大，分配系數(shù)和酶活性回收率先增大后減小，在pH 7.0達(dá)到最大，分配系數(shù)2.41，酶活性回收率74.81%。所以實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.0為最佳。

圖6 不同pH對(duì)分配行為的影響Fig.6 Effect of pH on partitioning behavior

2.7 不同酶添加量對(duì)分配行為的影響

圖7 不同酶添加量對(duì)分配行為的影響Fig.7 Effectof the dosage of papain on the partition behavior

隨著酶添加量的增加，相比顯著增大，但分配系數(shù)（2.04～2.52）和酶活性回收率（69.95%～75.59%）變化并不顯著。雙水相體系固定后，應(yīng)盡可能投入酶，可使雙水相萃取處理量增大，則效率提高。由圖7可知，酶添加量為3.0mg/g時(shí)分配系數(shù)和酶活性回收率達(dá)到最大，分配系數(shù)2.52，酶活性回收率75.59%，但在此條件下上相的乳化現(xiàn)象比較嚴(yán)重且相比較大，這對(duì)酶的后續(xù)加工（如干燥，PEG與酶的分離等）增加了負(fù)擔(dān)。綜合考慮，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)固定酶添加量為1.0mg/g。

2.8 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到兩個(gè)響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型：

式（1）和式（2）的決定系數(shù)R2分別為98.21%和97.65%，說(shuō)明擬合性良好。兩個(gè)模型的校正R2（K：96.59，Y：95.54），表明95%以上的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來(lái)解釋。

對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，兩個(gè)模型的p值＜0.01，這表明回歸方程的F檢驗(yàn)極顯著，說(shuō)明所擬合的二次回歸方程合適。對(duì)回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值進(jìn)行比較，可判斷因子影響的主次性[9]。對(duì)于木瓜蛋白酶的提取，各因素對(duì)木瓜蛋白酶提取的影響從大到小依次為Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH。表3的分析結(jié)果表明，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，X1、X1X3對(duì)K和Y的影響不顯著，X2、X3、X12、X22、X32、X2X3、X1X2對(duì)K和Y的影響極顯著。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and result of RSM（Uncode）

從表2以及K和Y的響應(yīng)面圖（圖8）可以看出，X1和X2，X2和X3交互效應(yīng)顯著。在已建立的模型基礎(chǔ)上，設(shè)定優(yōu)化目標(biāo)響應(yīng)值K和Y達(dá)到最大，通過(guò)SAS軟件來(lái)預(yù)測(cè)模型的最優(yōu)條件：16.0%（w/w）PEG6000，17.68%（w/w）Na2SO4，pH 7.0，酶添加量1.0mg/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性采用上述優(yōu)化提取條件提取木瓜蛋白酶，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為16.0%（w/w）PEG6000，18.0%（w/w）Na2SO4，pH 7.0，酶添加量1.0mg/g。以上述條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證。預(yù)測(cè)值K（2.8）和Y（78%），相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)值為K（3.1）和Y（82.6%）。可知，木瓜蛋白酶的分配系數(shù)和酶活性回收率成正相關(guān)。同時(shí)，預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值的一致性非常好，表明對(duì)雙水相萃取木瓜蛋白酶的條件優(yōu)化是有效的。

2.9 木瓜蛋白酶的放大實(shí)驗(yàn)

在上述優(yōu)化條件下，對(duì)木瓜蛋白酶的雙水相萃取進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的放大實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)總量由原來(lái)的20.0g放大到50.0、100.0、200.0g，其分離結(jié)果寫表4。由表4的結(jié)果可知，對(duì)于雙水相系統(tǒng)，可以較好地進(jìn)行線性放大。

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of test result

表4 不同系統(tǒng)總重對(duì)分配的影響Table 4 Effect of different system weighton the partitioning behavior of papain

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，確定了雙水相中各因素對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響規(guī)律。結(jié)果表明：Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)分配行為的影響極顯著，其次是PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，pH的影響相對(duì)較低。優(yōu)化得到的最佳雙水相分配體系：16.0%（w/w）PEG6000，18.0%（w/w）Na2SO4，pH 7.0，酶添加量1.0mg/g，常溫。在上述條件下，分配系數(shù)達(dá)到3.1，酶活性回收率達(dá)到82.6%，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的放大，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好，證明響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相萃取木瓜蛋白酶的條件是行之有效的方法，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

圖8 K和Y（%）的響應(yīng)面圖Fig.8 Responsive surface and contours of K and Y（%）

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Extraction of papain in aqueous two-phase polyethylene glycol/sodium sulfate system s

WANGW ei-tao，ZHANG Hai-de*，JIANG Zhi-guo，DONG An-hua，XU Ying-hao，PENG Jian，WANG Fei
（College of Food Science and Technology，Haikou 570228，China）

The papain was separated and extracted by PEG/Na2SO4aqueous two-phase system in this study. The influence of reagent and pH value on ac tivity of papain were investigated，in the meantime，the influence of PEG w ith d ifferent molecular weights，the mass fraction of Na2SO4and PEG，pH and enzyme added on distribution behavior in aqueous two-phase system was discussed.The separation cond ition of papain in aqueous two-phase system was op tim izated by response surface method，and am p lified in laboratory scale. The study showed that：the effect of Na2SO4mass fraction on the d istribution behavior was significant，followed by PEG mass fraction，the effect of pH on the distribution behavior was not significant.The partition coefficient and recovery rate of papain in aqueous two-phase system achieved 3.1 and 82.6%under the cond ition of molecular weights of PEG6000，mass fraction of PEG 16.0%，mass fraction of Na2SO418.0%，pH7.0，enzyme added 1.0mg/g.The results showed that：the op tim ization on extraction of papain by aqueous two-phase system was feasib le and could be used to p red ict the actual.

papain；aqueous two-phase system；partition coefficient；recovery of p rotease activity

TS255.1

A

1002-0306（2014）18-0118-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.016

2013－12－09 *通訊聯(lián)系人

王偉濤（1988-），男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的提取。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31260401）。