響應面法優(yōu)化蒸參水中揮發(fā)油提取條件及GC-MS分析

牛春穎，張鳳清，*，刁東梅，付彥臣

（1.長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春130012；2.四平宏寶萊飲品股份有限公司技術(shù)部，吉林四平136000）

響應面法優(yōu)化蒸參水中揮發(fā)油提取條件及GC-MS分析

牛春穎1，張鳳清1，*，刁東梅2，付彥臣2

（1.長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春130012；2.四平宏寶萊飲品股份有限公司技術(shù)部，吉林四平136000）

以紅參加工副產(chǎn)物“蒸參水”為原料，采用溶劑提取法提取蒸參水中揮發(fā)油，在單因素基礎上采用響應面法對提取條件進行優(yōu)化，同時采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對蒸參水揮發(fā)油進行成分分析。結(jié)果表明，以石油醚為提取溶劑的最佳提取工藝條件為：提取時間8h，提取溫度80℃，料液比1∶5，在此最優(yōu)提取條件下蒸參水揮發(fā)油的最高提取率達到0.51%。氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果表明蒸參水揮發(fā)油中主要成分為烷烴類（61.497%）、酯類（19.192%）、酸類（11.773%）、醛類（1.821%）、醇類（4.367%），還含有一組倍半萜化合物石竹烯和金合歡烯。

蒸參水，揮發(fā)油，響應面法，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）

紅參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖[1]，經(jīng)過清洗、分選、蒸制、晾曬、烘干等工序加工而成。蒸參水是紅參加工過程中的副產(chǎn)物，是在紅參加工過程中，水蒸氣對人參蒸熏、浸漬，冷卻后，溶于蒸鍋內(nèi)的一種暗棕色、混濁、粘稠狀水溶液[2]。蒸參水在吉林省參區(qū)有較高的年產(chǎn)量，傳統(tǒng)的觀念認為蒸參水不具備藥用價值，因此在生產(chǎn)中，常作為廢物棄去，這不僅浪費資源而且污染環(huán)境。有些藥廠也將蒸參水回噴于紅參主體，令其吸附，以增加成品紅參色澤和皂苷含量，提高優(yōu)質(zhì)紅參的質(zhì)量。在紅參蒸制過程中，一部分人參皂苷溶于蒸參水中，因此里面含有一定含量的人參皂苷[3]。季迪新等[4]對蒸參水中的化學成分進行研究，證明蒸參水中含有人參皂苷、多種氨基酸和多種維生素，也有研究報道蒸參水中含有糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機酸、酚類、皂苷等化學成分[5]，但對蒸參水中揮發(fā)油成分分析未見報道。揮發(fā)油多為從植物根、莖、花等固體粉末中一般采用水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、超臨界CO2萃取法、微波輔助提取法等方法提取[6-9]，但由于蒸參水物體狀態(tài)的特殊性，本實驗采用溶劑提取法提取蒸參水中揮發(fā)油。

為了開發(fā)利用蒸參水這一優(yōu)勢資源，了解蒸參水中揮發(fā)油成分，本實驗采用溶劑提取法提取揮發(fā)油，在單因素的基礎上采用響應面法對揮發(fā)油進行提取條件優(yōu)化，同時運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析其化學成分，為蒸參水的企業(yè)開發(fā)、利用提供基礎數(shù)據(jù)，并為蒸參水中揮發(fā)油作為香精香料等添加劑提供理論依據(jù)，同時將蒸參水變廢為寶，提高人參的附加值，對充分利用資源和保護環(huán)境也有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒸參水 吉林紫鑫藥業(yè)提供，密度1.0g/L；實驗用水 去離子水；無水乙醇 天津市富宇精細化工有限公司，分析純；石油醚（60～90℃）、正己烷、乙酸乙酯、乙醚 天津天泰精細化學品有限公司，分析純。

RE-52C系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設備有限公司；JY300電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DHG-9134BS-III電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械儀器設備有限公司；HP6890/5975MSD毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Hew lett-Packark公司；HP-5MS石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm） Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒸參水的成分測定 水分含量測定：GB 5009.3-2010；還原糖的測定：GB/T 5009.7-2008；總糖的測定：蒽酮比色法；蛋白質(zhì)含量測定：GB 50095-2010；粗脂肪的測定：GB/T 5009.6-2003；人參總皂苷的測定：紫外-可見分光光度法[10-11]。按照上述標準測定蒸參水中各種成分，并記錄測定結(jié)果。

1.2.2 蒸參水揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化 采用溶劑提取法。量取適量蒸參水，按一定比例加入提取劑，在一定條件提取后，于分液漏斗靜置。取下層液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，稱量。計算公式為：

式中：X—蒸參水中揮發(fā)油提取率，%；m—蒸參水的質(zhì)量，單位為克（g）；m1—燒瓶的質(zhì)量，單位為克（g）；m2—燒瓶加揮發(fā)油的質(zhì)量，單位為克（g）。

1.2.2.1 蒸參水揮發(fā)油提取單因素實驗 取濃縮到密度約為1mg/m L的蒸參水適量，以石油醚、正己烷、乙酸乙酯、乙醚為溶劑，兩者按一定比例添加，考察提取溶劑、料液比、提取時間、提取溫度4個因素，每個因素取3個水平，測定各因素對蒸參水揮發(fā)油提取率的影響。

a.提取溶劑對揮發(fā)油提取率的影響 在料液比為1∶6，提取時間為6h，提取溫度為70℃條件下，考察不同提取溶劑對蒸參水揮發(fā)油提取率的影響。

b.料液比對揮發(fā)油提取率的影響 以石油醚為提取溶劑，提取時間為6h，提取溫度為70℃條件下，考察料液比對蒸參水揮發(fā)油提取率的影響。

c.提取時間對揮發(fā)油提取率的影響 以石油醚為提取溶劑，料液比為1∶5，提取溫度為70℃條件下，考察提取時間對蒸參水揮發(fā)油提取率的影響。

d.提取溫度對揮發(fā)油提取率的影響 以石油醚為提取溶劑，料液比為1∶5，提取時間為8h條件下，考察提取溫度對揮發(fā)油提取率的影響。

1.2.2.2 響應面法對蒸參水揮發(fā)油提取條件進行優(yōu)化[12-13]在單因素實驗的基礎上，應用Design-Expert軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設計原理，選擇對揮發(fā)油溶劑回流法提取工藝影響顯著的3個因素即提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）作為自變量，以蒸參水中揮發(fā)油提取率為響應值設計響應面實驗，因素和水平表見表1。

表1 響應面分析因素和水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.3 揮發(fā)油成分分析[14-15]氣相色譜條件：Agilent HP-5MS石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升溫條件：初始溫度為50℃，保持2m in，以10℃/m in升到280℃，保持10m in；進樣口溫度280℃，載氣為He，柱流量1.0m L/m in，進樣量1.0μL，分流比50∶1。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量：70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍m/z：50～550amu。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Box-Benhnken設計方案，借助Design-Expert 8.0.5軟件并結(jié)合方差分析法。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸參水成分分析

蒸參水中除含有大量的水分外，還含有微量的蛋白質(zhì)、粗脂肪、還原糖和人參皂苷，其中人參皂苷的含量達到108.06mg/100g，結(jié)果列于表2，由成分分析可知說明蒸參水不是廢物，還有較高的利用價值。

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 提取溶劑對揮發(fā)油提取率的影響 在實驗中提取溶劑的選擇是影響提取效果的一個重要參數(shù)，根據(jù)相似相容的原理，并查閱相關(guān)文獻選擇正己烷、乙醚、石油醚、乙酸乙酯作為實驗提取溶劑。在料液比、提取溫度和提取時間一定的情況下，極性最弱的石油醚對蒸參水中揮發(fā)油提取的效果最好，其次是乙醚、正已烷，乙酸乙酯對揮發(fā)油提取的效果最差，實驗結(jié)果見圖1。

表2 蒸參水成分分析表Table 2 Componentanalysis of steamed ginsengwater

圖1 溶劑對揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effectof solvent on the extraction rate of volatile oil

2.2.2 料液比對揮發(fā)油提取率的影響 溶劑添加量的多少影響揮發(fā)油提取率的高低，選擇合適的料液比對實驗結(jié)果也有重要影響。由圖2可以看出，隨著溶劑量的增加，揮發(fā)油的提取率也逐漸增加，當料液比為1∶5時，蒸參水中揮發(fā)油的提取率較高。進一步增加溶劑用量，揮發(fā)油的提取率下降，分析原因可能為溶劑對揮發(fā)油的提取量趨于飽和，繼續(xù)增加溶劑量會增加成本并造成資源浪費。由此可見，在料液比為1∶5時已經(jīng)將蒸參水中的揮發(fā)油全部溶解在溶劑中，因此選擇料液比1∶4、1∶5、1∶6為響應面因素水平。

圖2 料液比對揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of volatile oil

2.2.3 提取時間對揮發(fā)油提取率的影響 提取時間也是影響提取效果的一個重要因素，由圖3可以看出，剛開始的提取率較低，隨著提取時間的延長蒸參水揮發(fā)油的提取率隨著增大：當提取時間在8h時，提取率達到最大，隨著時間的進一步延長提取率反而下降，原因可能為溶劑已經(jīng)飽和，不能溶解更多的揮發(fā)油，因此根據(jù)單因素實驗，選擇7、8、9h作為響應面因素水平。

圖3 提取時間對揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Effectof time on the extraction rate of volatile oil

2.2.4 提取溫度對揮發(fā)油提取率的影響 不同的提取溶劑的沸點不同，當選擇好提取溶劑時，提取溫度對揮發(fā)油提取率有一定影響，由圖4可以看出，當提取溫度為80℃時的提取效果最好，溫度過高、過低都不理想。因為溫度過高導致提取液中易揮發(fā)組分揮發(fā)；溫度過低則由于沸點達不到使提取不完全，或延長提取時間，故提取溫度選擇75、80、85℃為響應面因素水平。

圖4 提取溫度對揮發(fā)油提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate of volatile oil

2.3 響應面分析結(jié)果

2.3.1 回歸方程的建立 在單因素實驗結(jié)果基礎上，采用Box-Benhnken設計方案進一步優(yōu)化，所得實驗數(shù)據(jù)如表3所示，并采用Design-Expert 8.0.5軟件進行多元回歸擬合，得到蒸參水揮發(fā)油提取率對提取溫度、料液比、提取時間的二次多項回歸方程為：Y= 0.49+0.052A+0.035B+0.044C-0.032AB-0.026AC-0.019BC-0.12A2-0.13B2-0.12C2。

表3 響應面設計方案及結(jié)果Table 3 Results of response surface experiments

該方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映各因素對響應值的影響程度，系數(shù)的正、負反映了影響的方向。由于該方程的二次項系數(shù)均為負值，可以推斷方程代表的拋物面開口向下，因而具有極大值點，可以進行優(yōu)化分析。由方程的一次項系數(shù)可以得出，影響蒸參水揮發(fā)油提取率因素的主次順序為：提取時間＞料液比＞提取溫度。

2.3.2 回歸方程的方差分析 由方差分析表4可知，方程的模型顯著性p＜0.0001，是極顯著的，說明模型有意義；R2Adj=0.9839說明該模型能解釋98.39%響應值的變化；相關(guān)系數(shù)R2=0.9930，說明該模型擬合程度較好，實驗誤差小，實驗方法是可靠的，能夠很好地描述實驗結(jié)果，使用該方程代替真實的實驗點進行分析是可行的。因此該模型可以用于對蒸參水揮發(fā)油提取率進行分析。由表4可知，一次項A、B、C對模型的影響極為顯著。交互項AB、AC差異極顯著，BC差異顯著，二次項A2、B2、C2極為顯著。

圖5直觀地給出了各因素的交互作用效應。響應面曲面的坡度的平緩與陡峭程度直接的反映了在處理條件發(fā)生變化時蒸參水揮發(fā)油提取量的響應靈敏程度，如果響應面曲面坡度的平緩或陡峭，可以反映出表明對于處理條件的變化，響應值不敏感或敏感。由此可知，提取溫度與提取時間，提取時間與料液比的交互作用較為顯著。

2.3.3 工藝驗證實驗 采用Design-Expert 8.0.5軟件分析回歸模型，得出蒸參水揮發(fā)油的最佳提取工藝參數(shù)為提取時間8.2h，提取溫度81.5℃，料液比1∶5.4，考慮到實際操作條件，對蒸參水中揮發(fā)油的最佳提取工藝條件進行修正：提取時間為8h、提取溫度為80℃、料液比為1∶5，在此條件下進行驗證實驗，所得蒸參水揮發(fā)油提取率為0.51%。

2.4 揮發(fā)油成分分析測定結(jié)果

對總離子流圖中的各峰質(zhì)譜掃描后得質(zhì)譜圖，經(jīng)過質(zhì)譜計算機譜庫檢索及核對標準質(zhì)譜圖，并用峰面積歸一化法測定其相對含量，經(jīng)查對有關(guān)質(zhì)譜資料，得提取的揮發(fā)油化學成分，結(jié)果見表5，總離子流圖見圖6。

圖5 各交互因素對蒸參水揮發(fā)油提取率的響應面圖Fig.5 Response surface plot showing the effects of any two factors on the yield of volatile oil

表4 回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 4 Variance analysis results of regressionmodel

圖6 蒸參水揮發(fā)油總離子流圖Fig.6 TLC of volatile oil from steamed ginsengwater

表5 蒸參水揮發(fā)油成分分析結(jié)果Table 5 Analysis results ofmain components of volatile oil from steamed ginsengwater

采用石油醚為提取溶劑得到的蒸參水揮發(fā)油總離子流圖中共檢出19個色譜峰，經(jīng)過計算機檢索和核對質(zhì)譜庫，鑒定其中的19個化合物（見表5），其主要成分為烯類（1.349%）、烷烴類（61.497%）、酯類（19.192%）、酸類（11.773%）、醛類（1.821%）、醇類（4.367%）等化合物，其中相對含量較高的組分為烷烴類化合物、酯類化合物和酸類化合物，蒸參水揮發(fā)油中還含有微量的倍半萜化合物，石竹烯和金合歡烯。蒸參水中揮發(fā)油成分與已經(jīng)鑒別的人參根部及人參花蕾揮發(fā)油中有相同的化合物[16-19]：石竹烯、金合歡烯和棕櫚酸。其中對人參花蕾揮發(fā)油的成分分析鑒別表明各化合物占總揮發(fā)油組分的比例為：倍半萜（43.5%）、烷烴（34.8%）、開鏈飽和脂肪酸（8.7%）、酯（8.7%）、酮（4.3%）。倍半萜化合物分子離子峰m/z為204，分子式皆為C15H24，204組分有強烈的人參香氣，是人參香精的主要成分，可供人工調(diào)制人參香精參考。人參倍半萜類在醫(yī)藥、食品、飲料、化裝品和高檔人參加工方面有獨特的用途。金合歡烯用于皂用、洗滌劑香精中和日化香精中。

3 結(jié)論

本文通過對蒸參水中基礎化學成分進行分析測定，得出蒸參水中含有部分蛋白質(zhì)和還原糖并且有含量可觀的人參皂苷。并首次通過溶劑提取法對蒸參水中揮發(fā)油進行提取并對其成分進行分析，得出最優(yōu)條件為提取時間8h、提取溫度80℃、料液比1∶5，提取率可達0.51%。研究結(jié)果表明蒸參水中的揮發(fā)油成分與已經(jīng)鑒別的人參根部及人參花蕾中的揮發(fā)油有相同的化合物，這為蒸參水的深加工和開發(fā)利用提供了基礎數(shù)據(jù)支持，并為蒸參水揮發(fā)油生物活性作用提供理論基礎，也為其在化妝品、添加劑和香料工業(yè)的開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。

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Extraction conditions optim ization of essentialoil from steamed ginseng water by response surface methodology and GC-MS analysis

NIU Chun-ying1，ZHANG Feng-qing1，*，DIAO Dong-mei2，F(xiàn)U Yan-chen2
（1.College of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，China；2.The Technical Division of HongBaoLai Beverage Limited Liability Company，Siping 136000，China）

The raw materialwas the steamed ginseng water（the byp roduc ts of the red ginseng p rocessing），the essential oil was extracted from the steamed ginseng water by solvent extraction method，the extrac tion technology was op tim ized by response surface methodology on the basis of a sing le factor，the com ponent of the essential oilextracted from the steamed ginseng water was also analyzed by GC-MS.The results showed thatwhen petroleum etherwas used as extrac tion solvent，the op timum extrac tion cond itions were 8h（extrac tion time），80℃（extraction temperature）and 1∶5（feed liquid ratio），the extraction ratio of essentialoil from steamed ginseng water reached 0.51%in this op timum extraction conditions.The GC-MS analysis showed that the main component of the essential oil contained alkanes（61.497%），esters（19.192%），acids（11.773%），aldehydes（1.821%），alcohol（4.367%）and a set of sesquiterpenes caryophyllene and farnesene.

steamed ginseng water；essential oil；response surface methodology；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

TS209

B

1002-0306（2014）18-0310-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.061

2013－12－06 *通訊聯(lián)系人

牛春穎（1989-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物及保健食品研發(fā)。

吉林省醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金（YYZX201130-2）。