鰱魚魚糜采肉下腳料堿溶蛋白的制備工藝研究

陳二生，許學勤，許艷順，姜啟興

（江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，食品學院，江蘇無錫214122）

鰱魚魚糜采肉下腳料堿溶蛋白的制備工藝研究

陳二生，許學勤*，許艷順，姜啟興

（江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，食品學院，江蘇無錫214122）

以鰱魚魚糜采肉下腳料為原料，采用酸堿法（pH-shifting）制備堿溶蛋白，主要探討原料的儲藏、提取pH、提取時間、提取溫度、提取料液比以及沉淀pH對堿溶蛋白制備工藝的影響。結果表明，最佳提取pH為12.0，提取時間為15min，提取溫度為5℃，采用兩段式提取、提取料液比為1∶6（3+3），最佳沉淀條件為pH5.5，在此條件下，堿溶蛋白回收率約為82%。原料的不同處理對堿溶蛋白的制備無顯著影響。

鰱魚魚糜采肉下腳料，酸堿法，堿溶蛋白

鰱魚是我國養(yǎng)殖產量最大的大宗淡水魚，由于多肌間刺，及風味較差，因此鮮銷價格較低，一定程度上制約了這種魚的市場價值[1]。近年來，隨著淡水魚糜制備技術的發(fā)展，人們嘗試將鰱魚加工成魚糜，也取得到了一定成效。然而，鰱魚魚糜制備中的采肉過程會產生鮮魚總重約32%的下腳料[2]。到目前為止，這類下腳料尚未得到很好利用，既造成了資源浪費，也帶來環(huán)境污染壓力。

酸堿法（pH-shifting）提取動物蛋白是國外學者發(fā)明的一種蛋白質回收的技術[3-4]。該方法應用于新鮮魚肉可獲得約80%的蛋白回收率[3-12]，而應用于魚類加工下腳料時，蛋白回收率往往只有約50%[13-14]。這種差異主要是因為新鮮魚肉蛋白質中約90%為堿溶蛋白[15]，而魚體中的蛋白質按對0.1mol/L NaOH的溶解性可分為堿溶蛋白和堿不溶蛋白部分[16]，其中堿溶蛋白部分具有良好的萃取性，采用酸堿法可以獲得較高的蛋白回收率；堿不溶蛋白部分80%以上為膠原蛋白[15]，較弱酸堿條件下難以溶解。魚類加工下腳料蛋白質中約40%為堿不溶蛋白[17]，采用酸堿法制備蛋白的回收率不高。為了提高蛋白回收率并對鰱魚魚糜采肉下腳料中的蛋白質進行綜合利用，首先采用酸堿法對鰱魚魚糜采肉下腳料中的堿溶蛋白進行制備，然后以剩余的沉淀為原料制備明膠，本文主要對堿溶蛋白的制備工藝進行介紹。

在本工作中，主要研究了原料的儲藏、提取pH、提取時間、提取溫度、提取料液比以及沉淀pH對堿溶蛋白制備工藝的影響，旨在為提高鰱魚魚糜加工副產品的附加值提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰱魚 鮮活，體重3.0～4.0kg，購于無錫雪浪市場；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、三氯乙酸（TCA）等常用化學試劑 均為分析純。

FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IKA基本型分散機（高速分散機） 上海施迪曼流體技術有限公司；SIGMA4K15型臺式高速冷凍離心機 北京亞力恩科學器材公司；DS-1型高速組織搗碎機 上海標本模型廠；IKA電動攪拌器 廣州市博勒泰貿易有限公司；YCR-180型魚糜采肉機 上海華夏漁業(yè)機械儀器工貿公司；其他 為實驗室常用儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 鰱魚魚糜采肉下腳料的制備及處理 新鮮鰱魚去頭、去鱗、去內臟后，沖洗干凈，切成片狀然后立即通過魚糜采肉機，并收集采肉下腳料作為原料。然后，用高速組織搗碎機把下腳料處理成稠漿狀，封裝塑料袋中，并在不同條件下保存。-20℃條件下儲藏10h（標記為A）；-20℃儲藏6個月（標記為B）；-20℃儲藏1年（標記為C）。提取前，下腳料用流動的自來水解凍。

1.2.2 下腳料堿溶蛋白制備工藝流程 采用酸堿法（pH-shifting）制備鰱魚魚糜采肉下腳料堿溶蛋白質的工藝流程如下：采肉下腳料→取樣→加冰蒸餾水均質→調pH→低溫攪拌提取→第一次離心分離→收集上清液、調pH至蛋白等電點使蛋白沉淀→第二次離心分離→沉淀（即為堿溶蛋白）。

1.2.3 制備工藝要點

1.2.3.1 原料 鰱魚魚糜采肉下腳料，處理和儲藏條件同1.2.1所述。

1.2.3.2 提取 原料在恒定的溫度下在適當的時間內與提取液混合，均質1m in，懸濁液放入大的燒杯中并采用IKA電動攪拌器攪拌，攪拌的速度為200r/m in。在提取過程中根據需要加入2mol/L鹽酸或2mol/L氫氧化鈉，以保持提取液中pH的恒定。

1.2.3.3 離心 提取后把蛋白提取液轉移到塑料離心杯中，使用冷凍離心機（-20℃，10000×g，20m in）離心，收集上清液，記錄所得上清液的體積，采用凱氏定氮法測定蛋白含量，并計算蛋白的提取率。

1.2.3.4 等電點沉淀 取在最適提取條件下的蛋白離心上清液各50m L，分別加入2mol/L HCL或NaOH溶液調節(jié)其pH（變化范圍：pH=1～11），然后-20℃條件下保持30min，保證蛋白質能充分沉淀，然后使用冷凍離心機（-20℃，10000×g，20m in）離心，記錄所得上清液的體積，采用凱氏定氮法測定蛋白質含量，并計算蛋白質的沉淀率。

1.2.4 提取工藝條件的確定

1.2.4.1 提取pH的確定 取50g-20℃條件下保存10h的下腳料勻漿，固定料液比為1∶9，提取溫度10℃，提取時間10m in。分別將勻漿液的pH調節(jié)至2、3、4、5、5.5、6、7、8、9、10、11、12，然后進行提取并分別測定對應pH提取液的提取率。

1.2.4.2 提取時間的確定 取50g-20℃條件下保存10h的下腳料勻漿，提取pH為前面步驟所確定，固定料液比為1∶9，提取溫度10℃。測定在不同提取時間的提取率（提取時間變化范圍：5～60min）。

1.2.4.3 提取溫度的確定 取50g-20℃條件下保存10h的下腳料勻漿，提取液pH、提取時間為前面步驟所確定，固定料液比為1∶9。測定在不同提取溫度的提取效果（提取溫度變化范圍：5～30℃）。不同溫度所得離心上清液中加入50%三氯乙酸（TCA）使上清液中TCA濃度最終達到10%，在離心機中以10000×g離心20min，上清液部分為非蛋白氮，沉淀部分為蛋白質，總上清氮、蛋白質氮和非蛋白質氮含量測定均采用凱氏定氮法。

1.2.4.4 提取料液比的確定 取50g-20℃條件下儲藏10h的下腳料勻漿，提取液pH、提取時間、提取溫度為前面步驟所確定。分別采用兩種方式進行提取，一段式：在提取時間內僅進行一次提取，然后把提取液轉移到塑料離心杯中，使用冷凍離心機（-20℃，10000×g，20min）離心，丟棄沉淀，收集上清液；兩段式：在提取時間內進行兩次提取，第一次提取離心后的沉淀，再次用新鮮的提取液進行二次提取，并合并兩次提取所得的上清液。兩段式每次提取時間為一段式的一半。測定在不同料液比的提取率，一段式（料液比變化范圍：1∶3～1∶15），兩段式[料液比變化范圍：1∶4（3+1）～1∶8（4+4），其中1∶4（3+1）表示兩段式第一次提取的料液比為1∶3，第二次提取的料液比為1∶1，總提取料液比為1∶4]。

1.3 測定方法

1.3.1 基本理化指標的測定 水分、脂肪、蛋白和灰分含量采用AOAC方法進行測定[18]。

1.3.2 蛋白組分的測定 鰱魚魚糜采肉下腳料蛋白質組分的分離測定參照Wonnop Visessanguan等方法[16]，并略加改進。具體方法如下：取下腳料勻漿100g，加入10倍體積的0.1mol/L NaOH連續(xù)攪拌提取8h，離心（10000×g，20m in），上清液中的蛋白為堿溶蛋白，沉淀部分的蛋白為堿不溶蛋白。上清液中的堿溶蛋白調節(jié)pH至7.0，冷凍干燥后得堿溶蛋白。

堿溶蛋白組分離測定如下：取10g堿溶蛋白，加入10倍體積溶液A（15.6mmol/L Na2HPO4，3.5mmol/L KH2PO4，pH 7.5），用高速分散機在10000r/m in下均質1min，均質液在冷凍離心機中離心（-20℃，10000×g，20m in），此提取過程重復操作二次，沉淀部分即為肌原纖維蛋白。上清液部分：加入50%TCA使上清液最終TCA濃度達到10%，在離心機中離心（-20℃，10000× g，20min），上清液部分為非蛋白氮，沉淀部分為肌漿蛋白。蛋白質氮和非蛋白質氮含量測定均采用凱氏定氮法。

堿不溶蛋中膠原蛋白測定（以羥脯氨酸計）：按照ISO3496：1978（E）《Meat and meat products：Determ ination of L（-）-hydroxyproline content》方法，測定羥脯氨酸。

1.3.3 蛋白提取率、沉淀率、回收率的測定 蛋白的提取率、沉淀率、回收率的計算公式分別為：

蛋白質提取率（%）=A/C×100

蛋白質沉淀率（%）=（A-B）/A×100

蛋白質回收率（%）=（A-B）/C×100

式中：A為第一次離心中層清液中蛋白質的含量（mg）；B為第二次離心上清液中蛋白質的含量（mg）；C為原料中堿溶蛋白質的含量（mg）。

1.4 數據統計分析和繪圖

所有實驗數據為三次平行測定值的平均值。數據分析采用SPSS 17（Statistical Product and Service Solutions）軟件；數據繪圖采用Origin 8.0。

2 結果與討論

2.1 鰱魚魚糜采肉下腳料的組成

目前，制備魚糜的鰱魚采肉前一般要去除魚鱗、內臟和魚頭。這種預處理后鰱魚產生的采肉下腳料構成如表1所示。

表1 鰱魚魚糜采肉下腳料的構成Table 1 The composition ofwaste of silver carp after surimi processing

從表1可以看出，鰱魚魚糜采肉下腳料中的殘肉約占下腳料總量56%左右，應該是較好的蛋白制備原料，但這部分殘肉實際上是與其他成分混在一起的，實際操作難以用簡單物理方法分離。

鰱魚魚糜采肉下腳料的化學組成如表2所示，可見，其中非水部分主要是蛋白質，含量約為16%，占固形物總量的76%，是比較理想的蛋白制備原料。

表2 鰱魚魚糜采肉下腳料的化學組成Table 2 The proximate composition ofwaste of silver carp after surimi processing

鰱魚魚糜采肉下腳料中蛋白質組分組成的測定的結果如表3所示，其中約60%的為堿溶蛋白，約40%為堿不溶蛋白。堿溶蛋白中主要蛋白成分為肌原纖維蛋白具有良好的凝膠性能及其他功能性，并且具有較好的萃取性，適合采用酸堿法（pH-shifting）制備，為本研究的目標蛋白；堿不溶蛋白的主要成分為膠原蛋白，是制取明膠的好原料，但是該部分蛋白在較弱的酸堿條件下具有非萃性，酸堿法（pH-shifting）對該部分蛋白提取率不高，該部分蛋白主要存在于本研究第一次離心后的沉淀中。

2.2 提取工藝條件的確定

2.2.1 pH對蛋白提取率的影響 pH對鰱魚魚糜采肉下腳料中堿溶蛋白的提取率的影響如圖1所示，由圖1可以看出堿溶蛋白在pH 5～6范圍內提取率最小，偏酸或偏堿條件下蛋白質提取率都增加，但偏堿一側蛋白質提取率增加更明顯，pH=12時堿溶蛋白的提取率達到89%左右。由圖1可以推斷該蛋白體系的等電點在pH 5～6之間。選取pH=12進行進一步研究。

圖1 pH對蛋白提取率的影響Fig.1 Effectof pH on the extraction rate of protein

2.2.2 提取時間對蛋白提取率的影響 pH=12時，時間對蛋白提取率的影響如圖2所示。提取時間對蛋白提取率影響比較顯著，并且提取時間從5～15m in時，提取率會有大約15%增加，15m in后，提取率穩(wěn)定在90%左右。蛋白較短的提取時間是工業(yè)化生產的一個重要的具有吸引力的條件。提取時間取15m in。

圖2 提取時間對蛋白提取率的影響Fig.2 Effectof time on the extraction rate of protein

圖3 提取溫度對蛋白提取的影響Fig.3 Effectof temperature on the extraction of protein

表3 鰱魚魚糜采肉下腳料中蛋白的組分組成Table 3 The Component composition of ptotein ofwaste of silver carp after surimiprocessing

2.2.3 提取溫度對蛋白提取的影響 固定料液比1∶9、提取時間15m in、pH=12，溫度對蛋白提取的影響如圖3所示，由實驗結果可以看出從5～30℃，總氮的提取率從88.55%上升到93.32%，但是隨著溫度的升高，蛋白的水解程度也顯著增加，TCA處理后上清中非蛋白氮的提取率從5.12%升高到14.82%，蛋白質氮的提取率反而從83.82%降到78.5%，最佳的提取溫度在5℃左右，根據實際生產條件可以適當的提高提取溫度，但是不宜超過15℃。低溫蛋白的水解程度小，更有利于保持蛋白的活性。提取溫度選5℃。

2.2.4 提取料液比對蛋白提取率的影響 溫度5℃，pH=12條件下，采用兩種方式提取回收蛋白，一段式提取時間為15m in，兩段式每次提取時間為7.5m in。如圖4所示，一段式隨著固液比的增加提取率約從74%增加到92%，并且當固液比大于1∶12時提取率趨于穩(wěn)定；如圖5所示，二段式隨著料液比的增加提取率約從78%增加到92%，并且在料液比大于1∶6時提取率趨于穩(wěn)定。由實驗結果可以看出兩段式可以節(jié)約水的用量，因此采用兩段式進行提取，料液比選用1∶6（3+3）。

圖4 提取料液比對蛋白提取率的影響Fig.4 Effectof solid-liquid ratio on the extraction of protein

圖5 提取料液比對蛋白提取率的影響Fig.5 Effectof solid-liquid ratio on the extraction of protein

2.3 蛋白質沉淀pH的確定

利用等電點沉淀技術，調節(jié)最適提取條件下的蛋白離心上清液的pH，當pH達到等電點時，蛋白質便沉淀出來。當沉淀物中蛋白質含量最高或上清液中蛋白質含量最低時，此時的pH便為蛋白質等電點沉淀的最適pH。

如圖6所示，在pH=5.5時取得最高的蛋白沉淀率，這也是蛋白最低提取率時的pH。提取液中蛋白在等電點的沉淀率約為90%，這表明大部分先前提取液中的蛋白質可以有效的沉淀。

2.4 不同儲藏條件對堿溶蛋白制備的影響

在5℃條件下，采用兩段式提取，料液比為1∶6（3+3），每段提取時間為7.5m in，選取pH=12，不同儲藏條件的原料堿溶蛋白制備的實驗結果如表4所示。結果無顯著差異，說明原料的儲藏對酸堿法制備堿溶蛋白無顯著影響。

圖6 pH對上清液中蛋白沉淀率的影響Fig.6 Effectof pH on the Sedimentation rate of protein

表4 不同儲藏條件的原料制備堿溶蛋白的結果Table 4 The effects ofmaterials at different storage conditions on the preparing of alkali-soluble protein

3 結論

酸堿法（pH-shifting）制備鰱魚魚糜采肉下腳料堿溶蛋白的最佳工藝的條件為：提取pH為12.0，提取時間為15min，提取溫度為5℃，采用兩段式提取、提取料液比為1∶6（3+3），最佳沉淀條件為pH 5.5。原料的不同處理對堿溶蛋白的制備無顯著影響，在此條件下，堿溶蛋白回收率約為82%。本研究為淡水魚糜加工下腳料的利用提供了技術參考，為提高淡水魚糜加工副產品的附加值提供了技術支持。

[1]張愍，段振華，湯堅.低值淡水魚加工利用研究進展[J].中國水產，2002（5）：70-71.

[2]段傳勝，單楊.淡水魚魚糜加工的研究進展與關鍵性技術探討[J].農產品加工學刊，2007（7）：52-58.

[3]Hultin HO，Kelleher SD.Process for isolating a protein composition from amuscle source and protein composition：US，6005073[P].1999.

[4]Hultin HO，Kelleher SD.High efficiency alkaline protein extraction：US，6136959[P].2000.

[5]Cortes-Ruiz JA，Pacheco-Aguilar R，Lugo-Sanchez ME. Functional characterization of a protein concentrate from bristly sardine made under acidic conditions[J].Aquat Food Product Technol，2001（10）：5-23.

[6]Undeland I，Kelleher SD，Hultin HO.Recovery of functionalproteins from herring（Clupea harengus）lightmuscle by an acid or alkaline solubilization process[J].Agric Food Chem，2002，50（25）：7371-7379.

[7]ChoiYJ，Park JW.Acid-aided protein recovery from enzymerich Pacific whiting[J].Food Sci，2002，67（8）：2962-2967.

[8]Kristinsson HG，Demir N.Functional fish protein ingredients from fish speciesofwarm and temperatewaters：comparison ofacid and alkali-aided processing vs.conventional surimi processing [C].In：Bechtel PJ，editor.Advances in seafood by products.Univ. of Alaska Press：Fairbanks，AK，2003：277-295.

[9]Yongsawatdigul J，Park JW.Effects of alkali and acid solubilization on gelation characteristics of rockfish muscle proteins[J].Food Sci，2004，697：499-505.

[10]Kristinsson HG，Theodore AE，Demir N，etal.A comparative study between acid-and alkali-aided processing and surimi processing for the recovery ofproteins from channelcatfishmuscle [J].Food Sci，2005，70（4）：C298-C306.

[11]Kristinsson HG，Liang Y.Effect of pH-shift processing and surimi processing on atlantic croaker（Micropogonias undulates） muscle proteins[J].Food Sci，2006，71（S5）：304-312.

[12]Hultin HO，Kelleher SD.Protein composition process for isolating a protein composition from amuscle source：US，6451975 [P].2002.

[13]劉詩長，周春霞，洪鵬志.羅非魚下腳料分離蛋白的制備及其性質研究[J].食品研究與開發(fā)，2011（6）：38-42.

[14]Batista I.Recovery of proteins from fish waste products by alkaline extraction[J].European Food Research and Technology，1999，210（2）：84-89.

[15]鴻巢章二，橋本周久.水產利用化學[M].郭曉風，鄒勝祥譯.北京：中國農業(yè)出版社，1994.

[16]Visessanguan W，Benjakul S，Riebroy S，et al.Changes in composition and functional properties of proteins and their contributions to Nham characteristic[J].Meat Sience，2004，66（3）：579-588.

[17]Kristbergsson K，Arason S.Utilization of by-products in the fish industry[M].Washington：Springer US，2007.

[18]Helrich K.Officialmethods of analysis of the association of officialanalyticalchemists[M].Arlington：Literary Licensing，1990.

Study on the preparation of alkali-soluble protein using waste of silver carp after surim iprocessing

CHEN Er-sheng，XU Xue-qin*，XU Yan-shun，JIANG Qi-xing
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The alkali-solub le p rotein was p repared by pH-shifting method using waste of silver carp after surim i p rocessing as raw material.The effect of storage of raw material，extrac ting pH，time，and temperature，ratio of material and buffer，and pH for p recipitate on p reparation of alkali-solub le p rotein was also investigated. Results showed that the op timal parameters for p reparation were extrac ting at pH12.0，for 15m in，at 5℃，using two-stage extraction，at ratio of 1∶6（3+3），at pH5.5 for p recip itate.The recovery of alkali-solub le p rotein was about82%under this condition.Different treatmenthad little difference on the yield of alkali-solub le p rotein.

waste of silver carp after surim ip rocessing；pH-shifting；alkali-solub le p rotein

TS254.9

B

1002-0306（2014）18-0264-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.050

2014－01－16 *通訊聯系人

陳二生（1987-），男，碩士研究生，研究方向：水產品加工。

國家大宗淡水魚類產業(yè)技術體系建設專項（CARS-46-22）。