豬脫氧膽酸精制工藝的響應(yīng)面分析優(yōu)化

李 莉，韓 玲，余群立

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅蘭州730000）

豬脫氧膽酸精制工藝的響應(yīng)面分析優(yōu)化

李 莉1，2，韓 玲1，*，余群立1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅蘭州730000）

目的：以豬脫氧膽酸粗品為原料，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，及響應(yīng)面分析法對(duì)豬脫氧膽酸精制工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法：以乙酸乙酯添加量、回流時(shí)間、回流溫度為響應(yīng)因子，豬脫氧膽酸含量為響應(yīng)值，用響應(yīng)面分析法對(duì)豬脫氧膽酸粗品的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：各因素對(duì)豬脫氧膽酸提取量的影響大小依次為乙酸乙酯添加量＞回流時(shí)間＞回流溫度。豬脫氧膽酸精制的最佳工藝參數(shù)為乙酸乙酯添加量為10∶1（v∶v），回流時(shí)間為2.5h，回流溫度為85℃，在此條件下，豬脫氧膽酸含量為98.78%。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值一致，該工藝可用于豬脫氧膽酸的精制。

豬脫氧膽酸，制備工藝，響應(yīng)面分析

豬脫氧膽酸（3α，6α－二羥基膽烷酸，HDCA）是一種白色或類(lèi)白色粉末的次級(jí)膽酸，具有降血脂、鎮(zhèn)痙、祛痰等作用[1]，豬脫氧膽酸也是人工牛黃的主要原料之一，臨床上用于治療高血壓，氣管炎及有肝膽疾病引起的消化不良[2]，而且對(duì)急性白血病的治療有良好作用，醫(yī)用前景廣闊[3]。我國(guó)豬肉資源豐富，但對(duì)豬膽汁中豬脫氧膽酸的提取利用率很低，迄今為止，對(duì)豬脫氧膽酸提取工藝研究的文獻(xiàn)少之又少，而且國(guó)外幾乎沒(méi)有對(duì)這方面內(nèi)容的研究，因此，進(jìn)一步研究經(jīng)濟(jì)高效的提取方法具有很大的前景[4]。本文采用響應(yīng)面分析法[5]對(duì)豬脫氧膽酸精制工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高其含量，增加其醫(yī)療價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益[6-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬脫氧膽酸粗品 由實(shí)驗(yàn)室制備所得，含量為33.67%；氫氧化鈉、鹽酸、乙酸乙酯、無(wú)水碳酸鈉、活性炭、醋酸、糠醛、硫酸 均為分析純。

HH-s8型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；UV765PC型紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；DZF-60A30型真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

1.2 工藝流程

1.3 操作方法

參考張文寶[9]豬脫氧膽酸的提取方法。將稱(chēng)重后的豬脫氧膽酸粗品[10-12]置于回流裝置，加入8倍量體積的乙酸乙酯和5%的活性炭粉末進(jìn)行攪拌，加熱溶解后，回流1～2h。放冷后過(guò)濾，再用3～5倍的乙酸乙酯回流殘?jiān)爬溥^(guò)濾后合并濾液。在濾液中加入0.3倍量的無(wú)水碳酸鈉粉末，脫水12h。將已脫水的濾液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，濃縮至原溶液體積的1/3～ 1/5，放冷后析出結(jié)晶[13]，濾液繼續(xù)加入乙酸乙酯回流，濾物經(jīng)干燥，粉碎研磨，過(guò)篩，即得豬脫氧膽酸精品[14-15]。

1.4 含量的測(cè)定

1.4.1 HDCA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定 參考賈霖在CACD的提取和測(cè)定時(shí)所用的方法[16]。精密稱(chēng)取12.5mg HDCA標(biāo)準(zhǔn)品，置于25m L容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%的醋酸溶液定容至刻度并搖勻，精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L，分別置于比色管中，用體積分?jǐn)?shù)為60%的醋酸溶液稀釋至1.0m L，加入1m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的糠醛溶液，置冰浴5min，加入13m L體積分?jǐn)?shù)為80%的硫酸溶液，混勻，置70℃水浴加熱10m in，迅速置冰浴2m in，取出備用，同法做試劑空白實(shí)驗(yàn)。使用紫外分光光度計(jì)在380nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)測(cè)定值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[17-18]，計(jì)算R2值[9]。

1.4.2 樣品中HDCA的測(cè)定 精密稱(chēng)取12.5mg樣品，加入適量體積分?jǐn)?shù)為60%的醋酸液，混勻后轉(zhuǎn)移至25m L容量瓶中，再用體積分?jǐn)?shù)為60%的醋酸液溶解殘?jiān)?，將溶解液并入容量瓶中，稀釋至刻度，超聲使樣品完全溶解；分別在1、2兩個(gè)試管中精密加入1m L上述溶液，在1管中加入1m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的糠醛液，2管中加1m L水作樣品空白，置冰浴中5m in，取出后加入13m L體積分?jǐn)?shù)為80%的硫酸溶液，混勻，置70℃水浴中10m in，迅速置冰浴中2m in取出，同法做空白實(shí)驗(yàn)，使用紫外分光光度計(jì)在380nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算樣品中HDCA的含量[9]。

1.5 HDCA精制工藝研究

1.5.1 HDCA精制單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) HDCA提取過(guò)程中以含量作為考察指標(biāo)。以乙酸乙酯添加量、回流溫度、回流時(shí)間作為影響因素。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)的平均值[19]。

1.5.1.1 乙酸乙酯添加量對(duì)HDCA含量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取5份相同重量的HDCA粗提物，按體積比分別加入5、7、8、9、10、11倍的乙酸乙酯，處理溫度為80℃，處理時(shí)間2h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行樣，考察乙酸乙酯添加量對(duì)HDCA含量的影響。

1.5.1.2 回流溫度對(duì)HDCA含量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取5份相同質(zhì)量的HDCA粗提物，按其質(zhì)量加入10倍體積的乙酸乙酯，處理溫度分別設(shè)定為70、75、80、85、90℃，處理時(shí)間2h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行樣，考察回流溫度對(duì)HDCA含量的影響。

1.5.1.3 回流時(shí)間對(duì)HDCA含量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取5份相同質(zhì)量的HDCA粗提物，按質(zhì)量體積比加入10倍的乙酸乙酯，處理時(shí)間分別設(shè)定為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h，處理溫度為85℃，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行樣，考察回流時(shí)間對(duì)HDCA含量的影響。

1.5.2 HDCA精制中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了進(jìn)一步優(yōu)化豬脫氧膽酸精制工藝參數(shù)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上對(duì)乙酸乙酯的添加量、處理溫度、處理時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)[5]。實(shí)驗(yàn)的因素和水平的設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.6 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)采用Excel 2010，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 8.05b程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Model Graph程序作響應(yīng)曲面圖和等高線(xiàn)圖，并對(duì)所獲得的響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HDCA精制單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙酸乙酯添加量對(duì)HDCA含量的影響 由圖1可以看出，HDCA含量隨乙酸乙酯添加量的增大呈上升趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著乙酸乙酯添加量的增大，HDCA溶解度逐漸增大，當(dāng)乙酸乙酯添加量達(dá)到HDCA質(zhì)量10倍體積時(shí)，HDCA的含量上升趨于平緩。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最佳的乙酸乙酯添加量為HDCA粗品質(zhì)量的10倍體積。

圖1 乙酸乙酯添加量對(duì)HDCA含量的影響Fig.1 Effectof acetic ether addition on HDCA content

圖2 回流溫度對(duì)HDCA含量的影響Fig.2 Effect of the reflow temperatu on HDCA content

2.1.2 回流溫度對(duì)HDCA含量的影響 由圖2可以看出，HDCA含量隨回流溫度升高而升高，這是由于隨著溫度的升高，HDCA不斷溶解，在85℃之后含量開(kāi)始緩慢下降，可能是溫度過(guò)高，部分HDCA被破壞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳的處理溫度為85℃。

2.1.3 回流時(shí)間對(duì)HDCA含量的影響 由圖3可以看出，在回流時(shí)間為1.5～2.5h范圍內(nèi)，HDCA含量呈上升趨勢(shì)，回流時(shí)間超過(guò)2.5h后含量開(kāi)始下降，這可能是由于回流時(shí)間過(guò)長(zhǎng)HDCA不斷溶解，導(dǎo)致含量下降，所以最佳的回流時(shí)間為2.5h。

2.2 HDCA精制中心組合實(shí)驗(yàn)

2.2.1 回歸方程及方差分析 采用Design-Expert 8.05b對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素回歸擬合。回歸分析結(jié)果及各項(xiàng)方差分析見(jiàn)表3。

表2 HDCA精制工藝中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental resultof response surface design

根據(jù)回歸方程各項(xiàng)方差分析結(jié)果表明，該模型回歸顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，可以作為乙酸乙酯精制HDCA的理論值。各因素回歸擬合后，得到的回歸擬合方程為：

模型具有顯著性（p＜0.01）。該模型與實(shí)際情況具有較好的擬合性，因此可用此模型對(duì)豬脫氧膽酸粗品中豬脫氧膽酸Y含量值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

根據(jù)回歸方程各個(gè)系數(shù)絕對(duì)值的大小可判斷三個(gè)因素對(duì)乙酸乙酯精制HDCA影響的主次順序?yàn)椋阂宜嵋阴ヌ砑恿浚净亓鲿r(shí)間＞回流溫度。

表3 HDCA精制工藝中心組合設(shè)計(jì)回歸方程各項(xiàng)方差分析表Table 3 Combination design of HDCA refining technology center of the variance analysis of regression equation

2.2.2 響應(yīng)面分析及最佳工藝參數(shù)的確定 根據(jù)回歸方程作三因素兩兩交互作用的響應(yīng)面圖[20]。響應(yīng)面坡度反映了實(shí)驗(yàn)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度。從圖4～圖6可以看出，回流溫度和回流時(shí)間、乙酸乙酯添加量和回流時(shí)間交互作用顯著，回流溫度和乙酸乙酯添加量交互作用不顯著。

對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，得出乙酸乙酯精制HDCA最佳工藝參數(shù)為：乙酸乙酯添加量為10倍體積，回流溫度為85℃，回流時(shí)間為2.5h，HDCA含量為97.58%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由圖4～圖6可以看出兩兩因子之間均有交互作用，為了驗(yàn)證模型的可靠性，在上述最優(yōu)工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行反復(fù)多次的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到HDCA含量為98.78%，與理論預(yù)測(cè)值相差較小，所以可以確定乙酸乙酯精制HDCA的最優(yōu)工藝為乙酸乙酯添劑量為10倍體積，回流溫度為85℃，每次回流時(shí)間為2.5h。

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面分析及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：當(dāng)乙酸乙酯添劑量為10倍體積，回流溫度為85℃，回流時(shí)間為2.5h，HDCA含量為98.78%。

本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯純化HDCA，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析得到了最佳的提取工藝參數(shù)，為利用豬膽汁進(jìn)行提取純化及加工生產(chǎn)HDCA添加了一條新途徑；其工藝簡(jiǎn)單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)也提高了豬副產(chǎn)物的附加值。

圖4 回流時(shí)間和回流溫度的交互影響響應(yīng)面圖Fig.4 Interactive effects of reflux time and temperature response surface graph

圖5 回流溫度和乙酸乙酯添加量的交互影響影響Fig.5 The reflux temperature and ethyl acetate add interactive influence the amountof influence diagram

圖6 回流時(shí)間和乙酸乙酯添加量的交互影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot reflux time and ethyl acetate add interactive influence quantity ofmap

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Optim ization of the extraction technology of Hyodeoxycholic Acid by response surface methodology

LILi1，2，HAN Ling1，*，YU Qun-li1
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Gansu Province Food and Drug Institude，Lanzhou 730000，China）

Ob jective：The crude p roduc ts of Hyodeoxycholic Acid was taken as the raw material，to op tim ize the extraction technology of Hyodeoxycholic Acid by response surface methodology.Methods：The parameters of extraction technology of Hyodeoxycholic Acid were op tim ized，w ith the additive amount of ethyl acetate，the reflow time and reflow temperature as the response fac tors and yeild rate of Hyodeoxycholic Acid as response value.Results：The effects of factors in order were as follows：the add itive amount of ethyl acetate，the reflow time and reflow tem perature.The op timal extrac tion technology was as follows：the additive amount of ethyl acetate was 10∶1（v∶v），the reflow time was 2.5h，and reflow tem perature was 85℃.Under these cond itions，the maximal yield of total content reached 98.78%.Conc lusion：The results were accordantw ith model p red ictions. The technology could be used as the extraction p rocess of Hyodeoxycholic Acid.

Hyodeoxycholic Acid；p reparation p rocess；response surface methodology

TS251.1

B

1002-0306（2014）18-0260-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.049

2013－10－28 *通訊聯(lián)系人

李莉（1985-），女，碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工。

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛牦牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目資助（CARS-38）；國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助（201203009）。