堿性蛋白酶提高玉米醇溶蛋白乳化性的研究

張京京，董艷嬌，修 琳，劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118）

堿性蛋白酶提高玉米醇溶蛋白乳化性的研究

張京京，董艷嬌，修 琳，劉景圣*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118）

采用Alcalase水解玉米醇溶蛋白以提高其乳化性，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，研究了底物濃度、反應(yīng)溫度、加酶量、pH及水解時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白乳化性的影響。實(shí)驗(yàn)得出最佳反應(yīng)條件為底物濃度2%，反應(yīng)溫度45℃，加酶量2200U/g，pH8.0，反應(yīng)時(shí)間80min。所得產(chǎn)物的乳化性為0.558，與未經(jīng)水解的玉米醇溶蛋白乳化性相比提高了5.26倍。

玉米醇溶蛋白，Alcalase，乳化性

玉米蛋白是玉米深加工過(guò)程中主要的副產(chǎn)物之一，其中60%以上是醇溶蛋白[1]。玉米醇溶蛋白具有很好的成膜性、黏結(jié)性，且耐熱、耐酯，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品等行業(yè)[2]。吳國(guó)際等[3]研究表明，玉米醇溶蛋白在體內(nèi)體外均能降解，因此在食品工業(yè)中可作為被膜劑，是一種良好的生物可降解材料。但由于玉米醇溶蛋白具有特殊的氨基酸組成，缺乏帶有極性基團(tuán)的氨基酸，因此水溶性、乳化性（EA）、發(fā)泡性較差，限制了人體的吸收和利用，因此需要對(duì)其進(jìn)行改性以提高其應(yīng)用價(jià)值。隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展，酶的限制性水解改性手段受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞[4-5]。通過(guò)酶的水解可以改變蛋白的空間結(jié)構(gòu)從而改善其功能特性，同時(shí)保留了更多的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。筆者通過(guò)查閱相關(guān)資料篩選了幾種蛋白酶，其中A lcalase與其他的蛋白酶相比較，催化效率較高[6-7]，且在醇溶條件下仍具有較高的活性[8]。因玉米醇溶蛋白水溶性差，因此在水溶條件下限制了水解反應(yīng)，水解度較低，因此本文選用A lcalase，在醇溶條件下對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行水解改性。旨在提高玉米醇溶蛋白的乳化性，為玉米醇溶蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米醇溶蛋白 上海金穗生物科技有限公司；諾維信A lcalase 北京高瑞森科技有限公司代理銷售；無(wú)水乙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS） 北京鼎國(guó)昌盛技術(shù)有限公司；大豆油 市售。

723-PC可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司；恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；LD5-2B低速離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；FA25上海弗魯克乳化機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-III循環(huán)真空泵 上海亞榮生化儀器場(chǎng)；LGJ-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水解玉米醇溶蛋白 取一定量的玉米醇溶蛋白，用70%的乙醇配制50m L一定質(zhì)量濃度的蛋白溶液，用0.2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，加入Alcalase預(yù)處理20m in，迅速將反應(yīng)液與50℃下進(jìn)行真空濃縮出去1/2的乙醇，用去離子水補(bǔ)充至原體積，用0.2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至原pH，繼續(xù)水解，85℃水浴滅酶終止反應(yīng)，產(chǎn)物過(guò)濾，凍干待用[9]。

1.2.2 蛋白質(zhì)乳化性的測(cè)定 配制蛋白含量為1%的溶液50m L。加入15m L大豆油，在10000r/m in，25℃下攪拌1m in，從攪拌后的溶液底部吸取50μL乳濁液，加入到5m L 0.1%SDS溶液中，測(cè)定其在500nm處的吸光值，以SDS溶液為空白，0m in時(shí)測(cè)得的吸光值A(chǔ)0即乳化性EA[10-11]。

1.3 Alcalase水解玉米醇溶蛋白單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 底物濃度對(duì)水解產(chǎn)物乳化性的影響 用70%的乙醇溶液分別配制濃度為1%、2%、3%、4%、5%的玉米醇溶蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0，按照1.2.1水解過(guò)程于40℃條件下水解60m in，加酶量為1760U/g。將產(chǎn)物凍干，分別測(cè)定其乳化性。

1.3.2 溫度對(duì)水解產(chǎn)物乳化性的影響 用70%的乙醇配制成2%的蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0，按照1.2.1水解過(guò)程，分別于40、45、50、55、60℃的條件下水解水解60min，加酶量為1760U/g。將水解產(chǎn)物凍干，測(cè)定其乳化性。

1.3.3 加酶量對(duì)水解產(chǎn)物乳化性的影響 用70%的乙醇配制2%的蛋白溶液，分別按照加酶量1320、1760、2200、2640、3080U/g分別加入A lcalase水解蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至8.0。按照1.2.1水解過(guò)程于45℃條件下水解60min。將水解產(chǎn)物凍干，測(cè)定其乳化性。

1.3.4 pH對(duì)水解產(chǎn)物乳化性的影響 用70%的乙醇配制2%的蛋白溶液，分別調(diào)至pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，按照1.2.1水解過(guò)程于45℃條件下水解60m in，加酶量為2200U/g。將水解產(chǎn)物凍干，測(cè)定其乳化性。

1.3.5 水解時(shí)間對(duì)產(chǎn)物乳化性的影響 用70%的乙醇配制2%的蛋白溶液，調(diào)pH至8.0，加酶量為2200U/g，于45℃條件下經(jīng)20m in初步水解后，分別于40、60、80、100、120min時(shí)取樣，將水解產(chǎn)物凍干，測(cè)定其乳化性。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物濃度對(duì)水解產(chǎn)物乳化性的影響

圖1 底物濃度對(duì)蛋白乳化性的影響Fig.1 Theeffectofconcentrateofsubstrateon emulsibilityofZein

由圖1可知，隨著底物濃度的增加，玉米醇溶蛋白的乳化性有所增加，而后又降低，隨后又有所增加，在底物濃度為2%時(shí)蛋白水解物獲得最大的乳化性0.498。其原因分析為，隨著底物濃度的增加水解度也有所提高，同時(shí)多肽數(shù)量增加，蛋白質(zhì)分子中靜電荷數(shù)量增加，因此蛋白的乳化性有所提高。但隨著底物濃度的增加，水解度的進(jìn)一步增加，親水性也隨之增加，吸附油滴的能力有所下降，反而又降低了乳化性[12]，因此在底物濃度為3%時(shí)乳化性降低，隨后在底物濃度為4%時(shí)又有所升高，分析原因可能為，底物濃度與酶解反應(yīng)速度直接相關(guān)，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí)水解度是有所下降的[13]，因此乳化性有略微升高。

2.2 溫度對(duì)水解產(chǎn)物乳化性的影響

圖2 水解溫度對(duì)蛋白乳化性的影響Fig.2 The effectof temperature on emulsibility of Zein

圖2可知，隨著溫度的升高，玉米醇溶蛋白的乳化性呈先升高后降低的趨勢(shì)，在水解溫度為45℃時(shí)獲得最大的乳化性0.516。沈?qū)幒蜅罟鈁13]在研究中發(fā)現(xiàn)花生蛋白使用枯草桿菌蛋白酶水解后也出現(xiàn)了類似的結(jié)果。原因分析可能為：溫度對(duì)酶的活性有著直接的影響，隨著溫度的升高酶促反應(yīng)速率增加，蛋白水解度升高，肽鏈數(shù)量增加，減小了油-水界面張力，從而提高了乳化性，但溫度高于45℃以后酶逐漸失活，反應(yīng)速率大幅下降，乳化性也隨之下降[14]。

2.3 加酶量對(duì)水解產(chǎn)物乳化性的影響

圖3 加酶量對(duì)水解產(chǎn)物乳化性的影響Fig.3 The effectof concentrate ofenzyme on emulsibilityof Zein

由圖3可知，隨著加酶量的增加，玉米醇溶蛋白的乳化性呈先升高后降低的趨勢(shì)。在加酶量為2200U/g時(shí)獲得最大乳化性0.542。當(dāng)加酶量較小時(shí)酶分子與底物充分接觸，蛋白水解度隨著加酶量的增加而增大[15]，肽鏈數(shù)量增加，肽鏈水解程度增大提高了蛋白分子的柔韌性，減小了油-水界面張力[16]，從而使蛋白的乳化性升高。當(dāng)水解度過(guò)高時(shí)，蛋白的分子量過(guò)低，吸附油滴性能力下降，因此乳化性下降。

2.4 pH對(duì)蛋白乳化性的影響

圖4 pH對(duì)蛋白乳化性的影響Fig.4 The effectof pH on emulsibility of Zein

由圖4可知，隨著pH的升高，玉米醇溶蛋白的乳化性呈先增高后降低的趨勢(shì)，在pH（8.0）時(shí)乳化性最高，為0.542。由圖4可見(jiàn)，在pH 7.0～8.0區(qū)間乳化性上升趨勢(shì)較為明顯，pH低于7.0時(shí)乳化性較低，原因可能為：反應(yīng)體系的pH直接影響酶的活性及蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)，A lcalase在酸性條件下活性較差，所以pH低于7.0時(shí)蛋白的水解度較低，肽鏈的水解程度較低，因此乳化性較差；當(dāng)?shù)鞍兹芤簆H高于8.0時(shí)，蛋白的解離度增加，所帶靜電荷數(shù)增加，但由于A lcalase在該條件下的活性較高，肽鏈水解程度過(guò)高，分子量過(guò)低，吸附油滴的能力下降，因而乳化性總體呈下降趨勢(shì)。

2.5 水解時(shí)間對(duì)蛋白乳化性的影響

圖5 水解時(shí)間對(duì)蛋白乳化性的影響Fig.5 The effectof reaction time on emulsibility of Zein

由圖5可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由于酶促反應(yīng)不斷進(jìn)行，蛋白的水解度逐漸升高。蛋白的乳化性在前80m in不斷升高，80m in以后乳化性逐漸下降。分析原因可能為，在前80min里，隨著蛋白水解度的增加，肽鏈數(shù)量增加，蛋白分子的柔韌性增加，減小了油-水界面的張力，因此乳化性有所提高。但是80m in以后，由于蛋白水解度過(guò)大，蛋白的親水能力增加，吸附油滴的能力降低，乳化性也隨之降低。因此最適反應(yīng)時(shí)間為80m in，此時(shí)乳化性為0.558。

2.6 未經(jīng)水解的蛋白乳化性與水解后蛋白乳化性的比較

按照單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳水解條件將玉米醇溶蛋白進(jìn)行水解，水解后玉米醇溶蛋白蛋白乳化性為0.558，而未經(jīng)水解的蛋白乳化性僅為0.106。

3 結(jié)論

根據(jù)本研究的單因素實(shí)驗(yàn)可知，A lcalase提高玉米醇溶蛋白乳化性的最佳酶解條件為底物濃度2%、反應(yīng)溫度45℃、加酶量2200U/g、pH 8.0、水解時(shí)間為80min。該條件下玉米醇溶蛋白的乳化性為0.558，與未經(jīng)水解處理的玉米醇溶蛋白乳化性相比提高了5.26倍。

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Study on zein modified by alcalase to im prove the emulsifying ability

ZHANG Jing-jing，DONG Yan-jiao，XIU Lin，LIU Jing-sheng*
（Jilin Agricultural University，National Engineering Laboratory of theWheat and Corn Deep Processing，Changchun 130118，China）

To imp rove the emulsification of zein，this research app lied the method of Alcalase hyd rolyzation.The hyd rolysis cond ition was op tim ized on the basis of substrate concentration，reaction tem perature，alcalase concentration，pH，reaction time experiments.After the op timal reaction cond itions of im p roving the emulsification of zein were conc luded as follows：substrate concentration 2%，reac tion tem perature 45℃，enzyme amount 2200U/g，pH8，reac tion time 80m in.Under the op timal cond ition，the EA of zein was 0.558.The emulsification imp roved 5.26 times compared w ith non-hyd rolyzed zein.

zein；Alcalase；emulsification

TS201.1

B

1002-0306（2014）18-0253-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.047

2013－10－10 *通訊聯(lián)系人

張京京（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學(xué)與生物技術(shù)。

“十二五”支撐計(jì)劃（2012BAD37B05）。