微藻DHA油脂中膽固醇脫除方法的研究

張業(yè)峰，胡耀池，黃 和

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京210009）

微藻DHA油脂中膽固醇脫除方法的研究

張業(yè)峰，胡耀池*，黃 和

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京210009）

為脫除微藻DHA油脂膽固醇，提高油脂品質(zhì)，選擇了β-環(huán)糊精包合法、硅膠吸附法和分子蒸餾法，對(duì)其進(jìn)行脫除膽固醇。分析了3種方法脫除膽固醇后，對(duì)油脂的酸價(jià)、過氧化值、氧化穩(wěn)定性和脂肪酸組分的影響。結(jié)果表明，采用β-環(huán)糊精包合法，膽固醇脫除率達(dá)50%，高于硅膠吸附法和分子蒸餾法的33%和22%。同時(shí)β-環(huán)糊精包合法相對(duì)于硅膠吸附法和分子蒸餾法明顯降低了油脂的酸價(jià)，提高了油脂氧化穩(wěn)定性，對(duì)脂肪酸成分幾乎無影響。通過對(duì)比表明，采用β-環(huán)糊精包合法，符合今后微藻DHA油脂脫除膽固醇精煉工藝的要求。

DHA，膽固醇，脫除

DHA（Docosahexaenoic acid，C22∶6Δ4，7，10，13，16，19，全稱二十二碳六烯酸）是一種重要的ω-3型長鏈多不飽和脂肪酸，具有促進(jìn)腦細(xì)胞生長發(fā)育，降血脂，降血糖，保護(hù)視力，抗癌及提高免疫力等多種重要生理功能，目前已廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)療行業(yè)[1-3]。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的DHA油脂，具有易于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，多不飽和脂肪酸含量高，易分離純化和氧化穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)[4]。但目前微藻DHA油脂中膽固醇含量高達(dá)19.99mg/g[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇和飽和脂肪食物的大量攝取易導(dǎo)致血液膽固醇含量升高，而血清中高膽固醇含量被認(rèn)為是誘發(fā)高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等眾多心血管疾病的重要因素[6]。現(xiàn)今微藻DHA油脂作為一種食品添加劑，其過高的膽固醇含量勢(shì)必會(huì)影響微藻DHA油脂的商業(yè)化應(yīng)用。因此，降低其膽固醇含量顯得尤為重要。

目前去除膽固醇的方法報(bào)道很多，主要有溶劑抽提法、超臨界萃取法、吸附法、微生物法、酶法、β-環(huán)糊精包合法、分子蒸餾法等[7]。這些方法在黃油、奶油、豬油、奶酪、雞蛋、牛奶等物質(zhì)中已被成功脫除90%左右的膽固醇[8-10]，而目前脫除微藻DHA油脂中的膽固醇，鮮有報(bào)道。本文選擇幾種具有工業(yè)化應(yīng)用前景的方法，β-環(huán)糊精包合法、硅膠吸附法和分子蒸餾法對(duì)微藻DHA油脂進(jìn)行脫除膽固醇，并考察油脂脫除膽固醇前后的酸價(jià)、過氧化值、氧化穩(wěn)定性、油脂微組分和脂肪酸組分，旨在選擇出適合脫除微藻DHA油脂膽固醇的方法，為今后的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DHA脫色油（產(chǎn)自裂殖壺菌Schizochytrium） 江蘇天凱生物科技有限公司；硅膠（400～800目）、β-環(huán)糊精 國藥集團(tuán)試劑有限公司；氫氧化鉀、氯化鈉、正已烷、甲醇、乙醇、BF3-乙醚、氯仿、硫酸、乙酸酐等 均為分析純。

KDL5型刮模式分子蒸餾設(shè)備 德國UIT公司；油脂氧化穩(wěn)定儀 瑞士萬通公司；GC2010型氣相色譜儀 日本島津公司；GZX-9140型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；752s型紫外/可見分光光度計(jì) PerkinElmer公司；TH 48SYLD-1型電子調(diào)溫電爐 中西遠(yuǎn)大科技有限公司；M 124A型電子分析天平 意大利BEL有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膽固醇脫除方法

1.2.1.1 分子蒸餾脫除膽固醇法[11]取50g DHA脫色油，設(shè)置分子蒸餾真空度0.3Pa，進(jìn)料預(yù)熱溫度30℃，冷凝水25℃，蒸餾溫度達(dá)到200℃時(shí)，打開進(jìn)料閥，設(shè)定進(jìn)料速度2m L/m in進(jìn)料，刮膜器轉(zhuǎn)速150r/m in，反應(yīng)結(jié)束后收集重相，保存待測。

1.2.1.2 β-環(huán)糊精包合脫除膽固醇法[8]取50g DHA脫色油于250m L燒杯中，加入5%的β-環(huán)糊精、50g去離子水，置于45℃的恒溫水浴鍋中機(jī)械攪拌，轉(zhuǎn)速200r/min，攪拌1.5h后，5000r/min，離心15min，取出上層油樣，保存待測。

1.2.1.3 硅膠吸附脫除膽固醇法[12]取50g DHA脫色油于250m L燒杯中，加入5%的硅膠，置于50℃的水浴鍋中恒溫機(jī)械攪拌，轉(zhuǎn)速200r/m in，攪拌1h后，5000r/m in，離心15m in，取出上層油樣，保存待測。

1.2.2 膽固醇含量測定 參照GB/T 5009.128-2003《食品中膽固醇的測定》方法測定。

1.2.3 油脂氧化穩(wěn)定性測定[13]Rancimat法加速氧化：分別準(zhǔn)確稱取三種方法脫出膽固醇后DHA油脂3.00g置于樣品管中，于測定溫度70℃、空氣流速9L/h的條件下測定DHA油脂氧化的誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.4 油脂酸價(jià)和過氧化值測定 參照GB/T 5009.37-2003進(jìn)行分析，其中過氧化值測定采用第一法滴定法。

1.2.5 油脂組分含量測定 按照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行脂肪酸甲酯化的操作及GC分析，脂肪酸甲酯化，氣相色譜（GC）分析DHA占脂肪酸含量并用十九烷酸（C19∶0）作為內(nèi)標(biāo)測定DHA的含量。

1.2.6 膽固醇脫除率計(jì)算[15]

式中：M0—處理前微藻DHA油脂膽固醇含量（mg/100g）；M1—處理后微藻DHA油脂膽固醇含量（mg/100g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照1.2.2方法，以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由相關(guān)系數(shù)可見，R2=0.999，表明相關(guān)性很強(qiáng)，因此該曲線可以作為膽固醇定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 幾種脫除膽固醇方法對(duì)微藻DHA油脂膽固醇和微組分的影響

采用三種不同的方法脫除微藻DHA油脂膽固醇，從圖2看出，β-環(huán)糊精包合法對(duì)膽固醇的脫除效果最好，膽固醇含量減少到0.67g/100g，遠(yuǎn)低于未處理脫色油中的膽固醇含量1.35g/100g，膽固醇脫除率達(dá)到50%；硅膠吸附法脫除膽固醇效果次之，膽固醇含量0.92g/100g，膽固醇脫除率為33%；分子蒸餾法脫除膽固醇效果最弱，膽固醇含量1.06g/100g，膽固醇脫除率為22%。硅膠在工業(yè)中是較好的吸附材料，但是在微藻DHA油脂中脫除膽固醇的效果不盡理想，原因可能是硅膠雖然表面有多孔結(jié)構(gòu)，但孔徑不規(guī)則，且孔徑的大小和膽固醇的分子大小不一致[7]，難達(dá)到特異性包埋的效果。分子蒸餾法雖然在其他體系中膽固醇脫除率能達(dá)到90%以上，但是在微藻DHA油脂體系中沒有顯示出很高的脫除率，原因可能是采用分子蒸餾法時(shí)，微藻DHA油脂的其他組分與膽固醇存在分子平均運(yùn)動(dòng)自由程差別，其他組分進(jìn)入分子蒸餾的輕相中，而膽固醇分子卻大部分留在了分子蒸餾的重相中，導(dǎo)致膽固醇脫除效果不佳。β-環(huán)糊精包合法借助其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，與微藻DHA油脂中的膽固醇結(jié)合在一起形成一種既不溶于水也不溶于油脂的包合物[18]，通過離心可以除去。同時(shí)從表1可知，分子蒸餾法可以降低油脂中32%的色素，硅膠吸附法可以降低油脂中43%的磷脂含量，β-環(huán)糊精包合法對(duì)微藻DHA油脂中的微組分變化微弱。由此可知，β-環(huán)糊精包合法在微藻DHA油脂脫除膽固醇的效果和對(duì)油脂微組分的影響上要優(yōu)于另外兩種方法，它可以很好的指導(dǎo)今后的工業(yè)化應(yīng)用。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of cholesterol

圖2 幾種方法作用后微藻DHA油脂膽固醇含量和脫除率Fig.2 The cholesterol and cholesterol removal rate of microalgae DHA oil after severalmethods

表1 幾種方法作用后微藻DHA油脂的微組分Table 1 Theminor compound inmicroalgae DHA oil after severalmethods

2.3 幾種脫除膽固醇方法對(duì)微藻DHA油脂氧化穩(wěn)定性的影響

圖3 幾種方法作用后微藻DHA油脂的誘導(dǎo)時(shí)間Fig.3 The induction time ofmicroalgae DHA oil after severalmethods

為了客觀的反映這三種方法對(duì)微藻DHA油脂氧化穩(wěn)定性的影響，本實(shí)驗(yàn)采用Rancimat法來比較此三種方法對(duì)微藻DHA油脂的相對(duì)氧化穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3所示。Rancimat法評(píng)價(jià)油脂氧化穩(wěn)定性的原[9]：在一定的加熱溫度下，向油樣中通入一定流量的空氣使油樣加速氧化，氧化產(chǎn)生的揮發(fā)性小分子如醛、酮、酸等導(dǎo)入到裝有蒸餾水的瓶中，通過記錄并分析水的電導(dǎo)率變化情況，然后二階求導(dǎo)計(jì)算出誘導(dǎo)時(shí)間（電導(dǎo)率變化最快的時(shí)間點(diǎn)）；誘導(dǎo)時(shí)間越長，表明油樣氧化穩(wěn)定性越強(qiáng)。

從圖3可知，氧化穩(wěn)定性（誘導(dǎo)時(shí)間）：分子蒸餾法（0.59h）＜脫色油（0.62h）＜硅膠吸附法（0.89h）＜β-環(huán)糊精包合法（0.93h）。由此可以得出：分子蒸餾法作用后油脂氧化穩(wěn)定性最差，主要是可能是由于分子蒸餾時(shí)高溫致使油脂中的胡蘿卜素及酚類物質(zhì)大幅降低，或者因?yàn)镈HA油脂中的微組分在高溫條件下分解或者聚合的產(chǎn)物不利于油脂氧化穩(wěn)定性；硅膠吸附法和β-環(huán)糊精包合法均增加了油脂氧化穩(wěn)定性，這主要?dú)w因于使用二者脫除膽固醇的同時(shí)，可以夾帶磷脂、皂角、水分等不利于氧化穩(wěn)定性的極性雜質(zhì)；β-環(huán)糊精包合法高于硅膠吸附法，是由于β-環(huán)糊精包合法包合膽固醇的同時(shí)，會(huì)部分包合游離脂肪酸，進(jìn)而降低了易氧化物質(zhì)的分解，增加了油脂的氧化穩(wěn)定性。

2.4 幾種脫除膽固醇方法對(duì)微藻DHA油脂酸價(jià)和過氧化值的影響

由圖4看出，微藻DHA油脂的酸價(jià)采用β-環(huán)糊精包合法下降近50%，其余兩種方法均有所降低，油脂過氧化值采用硅膠吸附法后明顯高于其他兩種方法。這主要由于β-環(huán)糊精包合膽固醇的同時(shí)部分游離脂肪酸也被包合，致使油脂的酸價(jià)降低幅度大[17]。采用硅膠吸附法時(shí)油脂的過氧化值明顯高于另外兩者，可能原因是采用硅膠反應(yīng)時(shí)，部分氧在攪拌過程中溶解在油脂中，且其氧的溶解量大于使用β-環(huán)糊精包合時(shí)，而分子蒸餾是在一個(gè)密閉真空環(huán)境中反應(yīng)的，過氧化值稍有升高有可能是發(fā)生在結(jié)束后油脂暴露在空氣中時(shí)夾帶的氧，導(dǎo)致過氧化值上升。

圖4 幾種方法作用后微藻DHA油脂酸價(jià)和過氧化值Fig.4 The acid value and peroxide value ofmicroalgae DHA oil after severalmethods

2.5 幾種脫除膽固醇方法對(duì)微藻DHA油脂脂肪酸組分的影響

氣相色譜分析顯示，幾種方法脫除油脂膽固醇后，微藻DHA油脂中的主要脂肪酸成分一致，個(gè)別組分含量有差別，見表2。其中采用分子蒸餾法時(shí)可以將微藻DHA油脂中的角鯊烯脫除32%，EPA脫除達(dá)27.3%。硅膠吸附法和β-環(huán)糊精包合法對(duì)油脂的脂肪酸成分影響不大。這主要在于分子蒸餾是利用分子平均運(yùn)動(dòng)自由程的差別來實(shí)現(xiàn)分離的，EPA和角鯊烯的分子平均運(yùn)動(dòng)自由程與其他組分差別明顯，在分子蒸餾塔中可以部分除去[11]。而硅膠吸附是一種物理吸附過程，因其對(duì)于油脂的脂肪族成分吸附力微弱，故影響不大。β-環(huán)糊精包合法則是借助其自身的特殊結(jié)構(gòu)形成的一種化學(xué)包合，專一性較強(qiáng)，對(duì)油脂脂肪酸組分影響弱。

表2 幾種方法作用后微藻DHA油脂脂肪酸組分（%）Table 2 The fatty acid composition ofmicroalgae DHA oil after severalmethods（%）

3 結(jié)論

采用β-環(huán)糊精包合法、硅膠吸附法和分子蒸餾法對(duì)微藻DHA油脂的膽固醇進(jìn)行研究，考察了此3種方法脫除膽固醇后，對(duì)油脂的酸價(jià)、過氧化值、氧化穩(wěn)定性、和脂肪酸組分的影響。采用β-環(huán)糊精包合法膽固醇脫除率達(dá)50%，高于硅膠吸附法和分子蒸餾法的33%和22%，同時(shí)相對(duì)于硅膠吸附法和分子蒸餾法，它同時(shí)降低了油脂的酸價(jià)，提高了油脂的氧化穩(wěn)定性，對(duì)油脂的脂肪酸成分和微組分幾乎無影響，是今后工業(yè)化應(yīng)用的方向。

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Cholesterol removal from m icroalgae DHA oil

ZHANG Ye-feng，HU Yao-chi*，HUANG He
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

To imp rove the quality ofm icroalgae DHA oil，these methods ofβ-cyc lodextrin，Silica geland molecular d istillation were respectively adop t to remove the cholesterol in the oil.Effects of the three methods on the acid value，peroxide value，oxidative stability and fatty acid com position were measured.The result ind icated that cholesterol reduction reached 50%，higher than the 33%of silica gelmethod and 22%ofmolecular d istillation method.Moreover，com pared w ith the other two methods，method ofβ-cyc lodextrin decreased oil acid value and imp roved the oxidative stability apparently，and had little effecton the fatty acid com position.The com parison showed thatβ-cyc lodextrin met the requirements for the future removal of cholesterol in m ic roalgae DHA oil refining p rocess.

m icroalgae DHA oil；cholesterol；removal

TS22

B

1002-0306（2014）18-0249-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.046

2013－12－09 *通訊聯(lián)系人

張業(yè)峰（1990-），男，在讀碩士研究生，主要從事油脂精煉及分析方面的研究。

國家杰出青年科學(xué)基金（21225626）；國家自然科學(xué)基金（21406112）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA022300；2014AA021206）。