正交設(shè)計(jì)優(yōu)化蕨藻紅素的微波提取工藝

牛改改，鄧建朝，李來好，*，楊賢慶，吳燕燕，郝淑賢，戚 勃，林婉玲

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300；2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266000）

正交設(shè)計(jì)優(yōu)化蕨藻紅素的微波提取工藝

牛改改1，2，鄧建朝1，李來好1，*，楊賢慶1，吳燕燕1，郝淑賢1，戚 勃1，林婉玲1

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300；2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266000）

研究了微波輔助法提取羽狀蕨藻中蕨藻紅素的工藝條件。通過單因素實(shí)驗(yàn)探究了微波溫度、乙醇濃度、微波時(shí)間、微波功率、料液比五個(gè)因素對(duì)蕨藻紅素提取率的影響，并經(jīng)過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)影響蕨藻紅素提取率的參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化。確定微波提取最佳工藝條件為：提取溶劑90%乙醇，微波溫度50℃，微波功率300W，微波時(shí)間15min，料液比1∶40g·mL-1，按此工藝條件進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到蕨藻紅素的平均提取率為92.93%，RSD為0.5003%。結(jié)果表明微波提取率高，穩(wěn)定性好，且大大縮短了提取時(shí)間。

蕨藻紅素，微波，正交，提取工藝

近年來的許多研究結(jié)果表明，海藻中存在大量結(jié)構(gòu)新穎且具有生理活性的化合物，海藻是生物活性物質(zhì)的巨大來源[1-2]。羽狀蕨藻屬于海藻中的一種，也被頻頻報(bào)道含有大量能夠被人類利用的活性物質(zhì)-蕨藻紅素[3]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)表明，蕨藻紅素具有顯著的促進(jìn)或抑制植物生長(zhǎng)[4]，延緩果實(shí)成熟，花朵衰老，競(jìng)爭(zhēng)性抑制增長(zhǎng)激素，除草劑，脫葉劑等作用[5-6]，除此之外蕨藻紅素還被發(fā)現(xiàn)具有較好的抗腫瘤活性[7]。迄今為止，關(guān)于蕨藻紅素提取工藝方面的文獻(xiàn)報(bào)道甚少，而微波作為天然產(chǎn)物提取中一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男滦图夹g(shù)，具有穿透力強(qiáng)、效率高、溶劑用量少、提取率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛關(guān)注[8]。微波加熱可使水等極性分子在微波電磁場(chǎng)中快速轉(zhuǎn)向及定向排列，從而產(chǎn)生撕裂和相互摩擦發(fā)熱，這種劇烈運(yùn)動(dòng)可使植物細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞[9]，有助于有效成分的溶出，同時(shí)微波提取的副產(chǎn)物少，有利于提純[10]。

目前，提取羽狀蕨藻中蕨藻紅素的研究甚少，實(shí)驗(yàn)采用微波輔助法提取羽狀蕨藻中的蕨藻紅素，并采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)其工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，為之后蕨藻紅素的分離純化及其性質(zhì)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羽狀蕨藻 采于海南沿海灘涂；乙醇 為分析純；甲醇 色譜純；實(shí)驗(yàn)用水 均符合GB/T 6682一級(jí)水的標(biāo)準(zhǔn)。

MAS-Ⅱ微波儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；Agilent1100高效液相色譜，配有DAD檢測(cè)器 美國(guó)Agilent公司；超聲波清洗儀 德國(guó)Elma公司；高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蕨藻紅素提取率的測(cè)定 采集的羽狀蕨藻經(jīng)過清洗、干燥、粉碎后準(zhǔn)確稱取2.00g，在一定條件下進(jìn)行微波提取，提取液定容到100m L，過膜，由高效液相色譜儀測(cè)定蕨藻紅素的峰面積A，根據(jù)因素條件變化對(duì)目標(biāo)峰面積的影響來確定正交實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)因素及其取值范圍。正交實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)先由蕨藻紅素峰面積來表示，找出最優(yōu)組合，確定蕨藻紅素的最佳提取條件。在最佳條件下，等量羽狀蕨藻經(jīng)微波提取后，測(cè)定目標(biāo)峰面積；將濾渣進(jìn)行二次提取，測(cè)定目標(biāo)峰面積；如此重復(fù)操作，直至提取液中目標(biāo)峰面積接近為零，說明羽狀蕨藻中蕨藻紅素已提取完全。將多次循環(huán)提取液的目標(biāo)峰面積相加Amax即為2.00g羽狀蕨藻中蕨藻紅素的總量，計(jì)算出各提取條件下蕨藻紅素的提取率（提取率=A/Amax）。

1.2.2 高效液相色譜法測(cè)定目標(biāo)峰面積 色譜條件[11-12]：色譜柱為Athena C18-WP，100A，4.6mm×50mm，3μm；流動(dòng)相甲醇-0.2%冰醋酸（80∶20，v∶v）；檢測(cè)器88232UV紫外檢測(cè)儀；檢測(cè)波長(zhǎng)315nm；流速0.3m L/m in；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)中蕨藻紅素的提取條件[11，13]，選定微波溫度、微波時(shí)間、微波功率、乙醇濃度和料液比五個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。分別對(duì)各個(gè)因素選取五個(gè)水平，來考察各因素對(duì)蕨藻紅素提取率的影響。

1.2.3.1 微波溫度對(duì)蕨藻紅素提取率的影響 分別精確稱取2.00g羽狀蕨藻粉末，用80%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20g·m L-1，在600W的微波功率下提取15m in，微波溫度選擇40、50、60、70、80、90℃六個(gè)點(diǎn)，提取液經(jīng)抽濾后，定容到100m L，由高效液相色譜法測(cè)定蕨藻紅素峰面積，計(jì)算出提取率，以三次實(shí)驗(yàn)平均值來表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3.2 乙醇濃度對(duì)蕨藻紅素提取率的影響 分別精確稱取2.00g羽狀蕨藻粉末，料液比為1∶20g·m L-1，在60℃，600W的微波條件下提取15min，分別選取60%、70%、80%、90%、100%乙醇為提取溶劑，提取液經(jīng)抽濾后，定容到100m L，由高效液相色譜法測(cè)定蕨藻紅素峰面積，計(jì)算出提取率，以三次實(shí)驗(yàn)平均值來表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3.3 微波時(shí)間對(duì)蕨藻紅素提取率的影響 分別精確稱取2.00g羽狀蕨藻粉末，用80%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20g·m L-1，在60℃，600W的微波條件下分別提取5、10、15、20、25m in，提取液經(jīng)抽濾后，定容到100m L，由高效液相色譜法測(cè)定蕨藻紅素峰面積，計(jì)算出提取率，以三次實(shí)驗(yàn)平均值來表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3.4 微波功率對(duì)蕨藻紅素提取率的影響 分別精確稱取2.00g羽狀蕨藻粉末，用90%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20g·m L-1，微波溫度為60℃，微波功率分別在100、200、300、400、500、600W的條件下提取10m in，提取液經(jīng)抽濾后，定容到100m L，由高效液相色譜法測(cè)定蕨藻紅素峰面積，計(jì)算出提取率，以三次實(shí)驗(yàn)平均值來表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3.5 料液比對(duì)蕨藻紅素提取率的影響 分別精確稱取2.00g羽狀蕨藻粉末，用90%乙醇為提取溶劑，料液比選取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g·m L-1五個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，在60℃、600W的條件下提取10m in，提取液經(jīng)抽濾后，定容到100m L，由高效液相色譜法測(cè)定蕨藻紅素峰面積，計(jì)算出提取率，以三次實(shí)驗(yàn)平均值來表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)提取率有較顯著影響的4個(gè)因素即微波溫度、微波時(shí)間、微波功率和乙醇濃度，其中料液比對(duì)蕨藻紅素提取率的影響顯著，直接選取1∶40的料液比為固定參數(shù)，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)方案，以蕨藻紅素提取率為指標(biāo)，通過L9（34）正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 微波溫度對(duì)蕨藻紅素提取率的影響 微波溫度對(duì)蕨藻紅素提取率的影響如圖1所示，由圖1可知，蕨藻紅素提取率隨著微波溫度的增加先增大后減小。微波溫度的升高加劇了分子熱運(yùn)動(dòng)，增大了摩擦，羽狀蕨藻中蕨藻紅素溶解及擴(kuò)散速度加快，提取率顯著提高，50℃時(shí)提取率最大。繼續(xù)升溫提取率反而降低，是因?yàn)檗г寮t素屬于生物堿類物質(zhì)，微波溫度升高使得部分有效成分分解，因此50℃為較佳的微波溫度。

圖1 微波溫度對(duì)蕨藻紅素提取率的影響Fig.1 The effectof temperature on the extraction rate

2.1.2 乙醇濃度對(duì)蕨藻紅素提取率的影響 乙醇濃度對(duì)蕨藻紅素提取率的影響如圖2所示，由圖2可知，蕨藻紅素提取率隨著乙醇濃度的增加而增大，當(dāng)提取溶劑為90%乙醇時(shí)，提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加反而提取率降低。因此90%乙醇為最佳提取溶劑。

圖2 乙醇濃度對(duì)蕨藻紅素提取率的影響Fig.2 The effectof ethonal concentration on the extraction rate

2.1.3 微波時(shí)間對(duì)蕨藻紅素提取率的影響 微波時(shí)間對(duì)蕨藻紅素提取率的影響如圖3所示，由圖3可知，蕨藻紅素提取率隨著微波時(shí)間的增加先增后降。微波時(shí)間短，微波反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的輻射能不足以改變細(xì)胞膜的電位變化，蕨藻紅素的溶解受阻，微波時(shí)間過長(zhǎng)，蕨藻紅素的水解加劇，提取率降低，因此，10min為較佳微波時(shí)間。

圖3 微波時(shí)間對(duì)蕨藻紅素提取率的影響Fig.3 The effect of time on the extraction rate

2.1.4 微波功率對(duì)蕨藻紅素提取率的影響 微波功率對(duì)蕨藻紅素提取率的影響如圖4所示，由圖4可知，微波功率在100～300W內(nèi)時(shí)對(duì)蕨藻紅素提取率的影響不大，之后隨著微波功率的增加提取率呈降低趨勢(shì)。當(dāng)微波功率在200W時(shí)提取率最大，主要是因?yàn)槲⒉üβ试酱髠鬟f能量就越多，使提取液內(nèi)部出現(xiàn)局部過熱現(xiàn)象，而蕨藻紅素對(duì)微波溫度又比較敏感，高溫使其分解，從而使提取率下降，因此200W為最佳提取功率。

2.1.5 料液比對(duì)蕨藻紅素提取率的影響 料液比對(duì)蕨藻紅素提取率的影響如圖5所示，由圖5可知，隨著溶劑量的增大蕨藻紅素提取率增大，1∶40g·m L-1時(shí)提取率最大。溶劑量小，固液相濃度差小，傳質(zhì)推動(dòng)力衰減加快，提取率低；溶劑量增大，傳質(zhì)速率提高，提取率隨之增大。料液比為1∶40～1∶50g·m L-1時(shí)提取率并無明顯增長(zhǎng)，考慮提取成本及后續(xù)純化難度，選擇料液比為1∶40g·m L-1。

圖4 微波功率對(duì)蕨藻紅素提取率的影響Fig.4 The effectof power on the extraction rate

圖5 料液比對(duì)蕨藻紅素提取率的影響Fig.5 The effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate

2.1.6 各因素與提取率的方差分析 利用SPSS軟件對(duì)不同提取條件下蕨藻紅素提取率進(jìn)行方差分析[14]，結(jié)果如表2所示。由表2可知，微波溫度、微波時(shí)間、微波功率、乙醇濃度和料液比均對(duì)蕨藻紅素提取率影響極顯著。

表2 單因素實(shí)驗(yàn)的方差分析Table 2 Single-factor analysis of variance

2.2 正交實(shí)驗(yàn)及其方差分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，為進(jìn)一步考察各因素對(duì)蕨藻紅素提取率影響的顯著性，以及提取的最佳工藝條件，以微波溫度、微波時(shí)間、微波功率和乙醇濃度為實(shí)驗(yàn)因素，以蕨藻紅素提取率為指標(biāo)，用L（934）正交表進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)測(cè)定2次，以平均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表3，正交實(shí)驗(yàn)方差分析見表4。

表3的極差分析結(jié)果表明，A微波溫度，B微波時(shí)間，C微波功率和D乙醇濃度對(duì)蕨藻紅素提取率影響的主次因素為D＞A＞B＞C。由表4可知，A、B和D因素的影響達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），而C因素的影響不顯著（p＞0.05）；說明微波溫度、微波時(shí)間和乙醇濃度對(duì)蕨藻紅素的提取率影響顯著，而微波功率對(duì)蕨藻紅素的提取率則影響不顯著。其最佳的工藝組合為A2B3C3D2，即微波溫度為50℃，微波時(shí)間為15m in，微波功率為300W，乙醇濃度為90%，料液比為1∶40g·m L-1。所得的組合為實(shí)驗(yàn)組別以外的組合，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)操作3次，提取率分別為92.58%、93.46%與92.76%，平均值92.93%大于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中的任何一組，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.5003%，重現(xiàn)性好，該工藝穩(wěn)定可行。

表3 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 L9（34）orthogonal testand results

表4 方差分析表Table 4 Analysis table of variance

3 結(jié)論

通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)得出最佳工藝條件：以體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇溶液作為提取溶劑、微波溫度50℃，微波時(shí)間15min、微波功率300W，料液比1∶40g·m L-1。在此工藝條件下，蕨藻紅素的提取率可達(dá)92.93%。正交實(shí)驗(yàn)方差分析表明：微波溫度、微波時(shí)間、乙醇濃度對(duì)蕨藻紅素的提取率影響顯著，而微波功率對(duì)蕨藻紅素的提取率影響相對(duì)不顯著。該提取工藝顯著提升了蕨藻紅素的提取率，為之后蕨藻紅素的分離純化及其性質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optim ization ofm icrowave extraction technology of caulerpin from feathery fern frond by orthogonalexperiment design

NIU Gai-gai1，2，DENG Jian-chao1，LI Lai-hao1，*，YANG Xian-qing1，WU Yan-yan1，HAO Shu-xian1，QIBo1，LINWan-ling1
（1.Key Laboratory ofAquatic ProductProcessing，MinistryofAgriculture，NationalR&DCenter forAquatic ProductProcessing，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China；2.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266000，China）

The op timal extraetion teehnology of caulerpin from feathery fern frond was stud ied by m ierowave assisted extraetion.The effect of the m ic rowave tem perature，ethanol concentration，the m icrowave extraetion times，the m icrowave power and the ratio of solid to liquid on the yield of caulerp in were studied by sing le factor experiments.Then，the op timal p rocessing cond itions of caulerp in were obtained by the orthogonal experiments.The op timal extraction p rocess parameters inc lude 90%ethanol as extraction solvent，m icrowave tem perature of 50℃，m icrowave power of 300W，m ic rowave rad ial time of 15m in and material-liquid ratio of 1∶40g·m L-1.Under the op timal extraction conditions，through dup licated experiment the yield of caulerp in was 92.93%，RSD was 0.5003%.The results showed thatm icrowave extraction rate was extremely high and stab le，and the extraction time was reduced greatly at the same time.

caulerpin；m icrowave；orthogonalexperiments；extraction p rocessing

TS254.9

B

1002-0306（2014）18-0241-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.044

2013－12－17 *通訊聯(lián)系人

牛改改（1989-），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21205138）；國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（200903030）；國(guó)家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201005020-7）。