漢中油菜花黃色素微波輔助提取及抗氧化活性研究

史 娟，李紅英

（1.陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000；2.陜西省延安市子長(zhǎng)縣寺灣鄉(xiāng)中心衛(wèi)生院，陜西延安717307）

漢中油菜花黃色素微波輔助提取及抗氧化活性研究

史 娟1，李紅英2

（1.陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000；2.陜西省延安市子長(zhǎng)縣寺灣鄉(xiāng)中心衛(wèi)生院，陜西延安717307）

以漢中油菜花為原料，采用微波助提對(duì)所含黃色素進(jìn)行提取，利用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，考察色素對(duì)食用油的抗氧化活性、對(duì)羥自由基及過氧化氫的清除能力。結(jié)果表明，油菜花黃色素的最佳提取工藝條件是：95%乙醇為提取溶劑，微波時(shí)間為30s，水浴溫度為80℃，料液比為1∶40（g/mL），回流時(shí)間為15min?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)表明，油菜花中所含黃色素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可抑制植物油氧化。在一定的濃度范圍內(nèi)，色素對(duì)羥自由基及過氧化氫的抗氧化活性隨濃度升高而增強(qiáng)。

油菜花，黃色素，微波助提，工藝條件，抗氧化活性

油菜為一年生或越年生草本植物，在我國(guó)農(nóng)村大面積種植，每年3～4月開花，花期長(zhǎng)，花量大，所含黃色素顏色鮮艷，是一種理想的食用天然色素資源。近年來研究表明，油菜花所含黃色素是大自然中稀少的二酮類有色物質(zhì)[1]。杜敏華等發(fā)現(xiàn)，油菜花黃色素溶液濃度在0.05%以上時(shí)對(duì)蘋果原汁具有顯著的防腐性[2-3]。魏亞冉等發(fā)現(xiàn)[4]，油菜花黃色素還對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸埃希氏菌有一定的抑制作用。漢中地處北暖溫帶和亞熱帶氣候的過渡帶，是傳統(tǒng)的油菜種植生產(chǎn)基地，大約有112萬m2油菜花，蘊(yùn)藏著巨大的資源優(yōu)勢(shì)。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)油菜花黃色素的研究較少，僅涉及到色素溶劑提取、防腐、抑菌及穩(wěn)定性研究[2-4]。采用微波助提油菜花黃色素，并對(duì)其抗氧化能力的研究尚未見報(bào)道。微波輔助提取技術(shù)具有加熱速度快、高效省時(shí)、回收率高、產(chǎn)品質(zhì)量高、原料利用率高、節(jié)能無污染、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[5]。采用微波輔助提取植物色素，具有色素溶出率高，節(jié)約溶劑，生產(chǎn)周期較短等優(yōu)點(diǎn)，并可避免長(zhǎng)時(shí)間高溫引起的熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分解破壞，故具有較好的應(yīng)用前景[6-9]。本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助提取油菜花中黃色素，探索最佳提取工藝及其抗氧化性，旨在為油菜花黃色素的進(jìn)一步研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油菜花花瓣 采自陜西漢中市芥菜型油菜四月份的鮮花；食用油 金龍魚第二代食用調(diào)和油；30% H2O2、95%乙醇、無水乙醇、石油醚、氯仿、KI、Na2S2O3、冰乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、FeSO4、丙酮、VC、濃硫酸、可溶性淀粉 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

AL204-IC電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Cary50型紫外可見分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安中國(guó)有限公司；DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；HH系列恒溫水浴鍋 黃驊市渤海電器廠；WP700型微波爐 佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司；722G可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JYL-350A九陽(yáng)料理機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝 新鮮油菜花瓣→清洗去雜→低溫烘干粉碎→微波助提→水浴回流→真空濃縮→產(chǎn)品。

1.2.2 提取劑的選擇及最大吸收波長(zhǎng)的確定 稱取0.5g預(yù)處理后的油菜花粉末6份，分別加入水、70%乙醇、95%乙醇、丙酮、氯仿和石油醚各20m L，放入700W微波爐內(nèi)預(yù)處理20s，60℃恒溫水浴回流15min，抽濾，吸取濾液1m L定容至10m L。以各溶劑為空白對(duì)照，用紫外分光儀在400～500nm掃描其最大吸收波長(zhǎng)（λmax）及吸光度（A）。比較吸光度大小，同時(shí)目視提取液顏色及清亮程度，選擇最佳提取劑。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 提取溫度對(duì)色素提取結(jié)果的影響 稱取等量油菜花粉末，料液比為1∶6，微波預(yù)處理20s后，分別在50、60、70、80、90℃下回流60min，測(cè)吸光度值A(chǔ)，選擇最佳提取溫度。

1.2.3.2 回流時(shí)間對(duì)色素提取結(jié)果的影響 稱取等量油菜花粉末，料液比為1∶6，微波預(yù)處理20s后，在70℃下分別回流0、5、15、30、45min，測(cè)吸光度值A(chǔ)，選擇最佳回流時(shí)間。

1.2.3.3 料液比對(duì)色素提取結(jié)果的影響 稱取等量油菜花粉末，改變料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，微波爐內(nèi)預(yù)處理20s，70℃下回流15min，測(cè)吸光度值A(chǔ)，選擇最佳料液比。

1.2.3.4 微波預(yù)處理時(shí)間對(duì)色素提取結(jié)果的影響 稱取等量油菜花粉末，料液比為1∶50，微波爐內(nèi)預(yù)處理10、20、30、40、50、60s，70℃下回流15min，測(cè)吸光度值A(chǔ)，選擇最佳微波處理時(shí)間。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用95%乙醇作為提取劑，以提取溫度、回流時(shí)間、料液比和微波時(shí)間四個(gè)因素，以油菜花黃色素吸光度為考察指標(biāo)，選擇L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.3 油菜花黃色素的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 油菜花黃色素對(duì)食用油抗氧化活性的測(cè)定 采用過氧化值（POV）評(píng)定油菜花黃色素對(duì)食用油抗氧化活性的影響。根據(jù)文獻(xiàn)[10]方法，稱取0.081g油菜花黃色素加入到50.415g食用油中混勻，避光保存24h。稱取3g試樣，放入250m L碘量瓶中，加入30m L氯仿-冰醋酸（1∶1）混合液使試樣完全溶解。然后加入飽和碘化鉀溶液1m L，塞好瓶蓋并輕搖半m in，置于暗處3m in。取出后加30m L水并搖勻，立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.0020mol/L）滴定，出現(xiàn)淡黃色時(shí)，加淀粉指示液1m L，繼續(xù)滴至藍(lán)色消失為終點(diǎn)，取相同量的氯仿-冰醋酸溶液、碘化鉀溶液和水，按相同方法，做試劑空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 油菜花黃色素對(duì)羥基自由基清除作用的測(cè)定 采用水楊酸法研究油菜花黃色素清除·OH作用[11-12]。向25m L容量瓶中依次加入6mmol/L的FeSO4溶液、6mmol/L的水楊酸各3m L及6.2×10-3g/m L一定體積的色素溶液，最后加入3m L 6mmol/L的H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，用95%的乙醇定容至25m L，搖勻，靜置。

1.3.2.1 油菜花黃色素清除·OH的最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 吸取6份上述色素溶液，分別在20、40、60、80、100、120min下測(cè)定溶液吸光度，研究一定色素濃度下，反應(yīng)時(shí)間對(duì)·OH清除率的影響。

1.3.2.2 油菜花黃色素濃度對(duì)清除·OH的能力的影響 測(cè)定濃度為1.2×10-3、1.8×10-3、2.4×10-3、3.0×10-3、3.6×10-3、4.2×10-3、4.8×10-3g/m L的色素溶液的吸光度，研究色素濃度對(duì)·OH清除率的影響。

1.3.3 油菜花黃色素對(duì)H2O2的清除能力的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)原理基于過氧化氫在230nm處有吸收峰，加入抗氧化劑后因過氧化氫氧化抗氧化劑，使其濃度下降，導(dǎo)致在230nm處吸光度減少[13]。稱取新鮮油菜花黃色素0.119g，用95%的乙醇配制成1.19×10-3g/m L的溶液，分別移取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0m L的色素溶液于25m L容量瓶中，各加入pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液1m L和43mmol/L H2O2溶液1.50m L，定容至25m L，反應(yīng)10min后，在230nm處測(cè)吸光度Aj（參比溶液為：色素+緩沖溶液）。取pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液1m L和43mmol/L的H2O2溶液1.5m L，定容至25m L，反應(yīng)10m in后，測(cè)吸光度A0（參比溶液為：蒸餾水），計(jì)算清除率，并以相同濃度的VC作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。清除率計(jì)算公式：P（%）=（A0-Aj）/A0×100，其中A0為空白吸光度，Aj為樣品吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)，取平均值，數(shù)據(jù)分析采用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑及最大波長(zhǎng)的確定

2.1.1 提取劑的選擇 6種溶劑對(duì)色素的提取效果見表2。表2中，水的提取效果最差，色素提取液接近無色；在95%乙醇、丙酮、石油醚中的提取效果較好，氯仿提取液出現(xiàn)渾濁。說明油菜花黃色素為脂溶性色素。95%乙醇和丙酮提取效果最佳，吸光度值分別為1.954、2.039，提取顏色為金黃色。鑒于95%乙醇價(jià)格低廉、安全性好，易于回收再利用。本實(shí)驗(yàn)選取95%乙醇為最佳提取溶劑。

表2 不同提取劑的提取效果Table 2 Results of different solvents

2.1.2 最大波長(zhǎng)的確定 將油菜花黃色素的95%乙醇提取液在400～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，以溶劑為空白對(duì)照，掃描結(jié)果見圖1。由圖1可知，油菜花色素液，在400～500nm可見光區(qū)間的440、470nm處都有吸收峰，與文獻(xiàn)一致[14-15]。因440nm處吸收峰最大，故確定λmax為440nm。

圖1 色素在95%乙醇溶液中的紫外-可見光光圖譜Fig.1 UV spectra of pigment in 95%ethanol

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 最佳提取溫度的確定 由圖2可知，在50～70℃提取溫度范圍內(nèi)，吸光度值A(chǔ)隨溫度的升高而加大，至80℃反而下降。這是由于溫度過高，易引起溶劑揮發(fā)損失，導(dǎo)致色素提取不完全。此外，溫度過高，還可引起色素被氧化變質(zhì)或者分解，導(dǎo)致在440nm吸光度減小。綜合各因素考慮，確定70℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對(duì)色素吸光度的影響Fig.2 Effectof extraction temperature on pigment yield

2.2.2 最佳回流時(shí)間的確定 從圖3可以看出，在0～15m in內(nèi)，提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，說明延長(zhǎng)回流時(shí)間可以提高色素的提取率；但從不同時(shí)間間隔中吸光度的變化量來看，15min后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率下變化不明顯。綜合提取率、耗能及成本等各項(xiàng)因素，確定回流時(shí)間以15m in為宜。

圖3 提取時(shí)間對(duì)色素吸光度的影響Fig.3 Effectof extraction time on absorbance of pigment

2.2.3 最佳料液比的確定 由圖4可知，料液比對(duì)色素提取效果影響比較大，提取率隨料液比增大兒升高。但當(dāng)料液比高于1∶50時(shí)，繼續(xù)增大料液比，吸光度反而降低。這可能是由于在料液比1∶50時(shí)，溶劑對(duì)于色素的溶解趨于飽和。過多溶劑的加入除造成資源浪費(fèi)，還可能導(dǎo)致其他脂溶性雜質(zhì)被溶入，干擾測(cè)定結(jié)果。故選擇最佳料液比為1∶50。

圖4 料液比對(duì)色素吸光度的影響Fig.4 Effectofmaterial/liquid ratio on absorbance of pigment

2.2.4 最佳微波時(shí)間的確定 在圖5中，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸上升。但在20s后，提取率開始減小，可能因?yàn)槭窃谖⒉ㄝ椛溥^程中，電磁波把能量直接傳播到原料內(nèi)部，使之瞬時(shí)加熱，因色素對(duì)熱的穩(wěn)定性不好，而快速地加熱使其被破壞，導(dǎo)致提取率下降。綜合各方面因素考慮，確定微波時(shí)間20s為宜。

圖5 微波時(shí)間對(duì)色素吸光度的影響Fig.5 Effectofmicrowave time on absorbance of pigment

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

由表3可知，最佳的提取條件是A3B2C1D3，即提取溫度為80℃，回流時(shí)間為15m in，液料比為1∶40，微波時(shí)間為30s。同時(shí)，由極差分析可知，在實(shí)驗(yàn)所選水平內(nèi)四個(gè)因素對(duì)油菜花黃色素提取率影響程度大小順序?yàn)椋阂毫媳龋疚⒉〞r(shí)間＞回流時(shí)間＞提取溫度。

表3 正交實(shí)驗(yàn)及極差分析Table 3 Orthogonal test design and results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由表4方差分析可知，在油菜花黃色素提取工藝正交實(shí)驗(yàn)所選擇的因素和水平范圍內(nèi)，A、B、C、D因素的影響均未達(dá)到顯著性水平，即提取溫度、時(shí)間、料液及微波預(yù)處理時(shí)間比對(duì)色素的產(chǎn)率的影響均不顯著。究其原因可能是受到色素穩(wěn)定性的影響，使得本例實(shí)驗(yàn)誤差較大，使檢驗(yàn)的靈敏度低，從而掩蓋了考察因素的顯著性。而F值結(jié)果表明方差分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致。

2.4 抗氧化性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 油菜花黃色素對(duì)食用油抗氧化活性的研究結(jié)果 由表5可知，未加色素的食用油POV值為2.0995，加色素后的食用油POV值為1.2756。由此說明，油菜花黃色素具有一定的抗氧化性。

表5 過氧化值（POV）的測(cè)定結(jié)果Table 5 Resultof POV

2.4.2 油菜花黃色素對(duì)羥基自由基清除作用的研究結(jié)果

2.4.2.1 油菜花黃色素清除·OH的最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 分別移取濃度為6.2×10-3g/m L的油菜花黃色素溶液300μL，測(cè)定反應(yīng)不同時(shí)間時(shí)黃色素的清除率。由圖6可以看出，油菜花黃色素的清除·OH的能力在15～60m in逐漸增大，在60m in達(dá)到最大。故選擇60m in為最佳反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 時(shí)間對(duì)黃色素清除·OH的能力的影響Fig.6 Effectof time on hydroxyl radical（·OH）scavenging capacity of pigment

2.4.2.2 油菜花黃色素濃度對(duì)清除·OH的能力的影響 圖7可以看出，油菜花黃色素對(duì)羥基自由基有較強(qiáng)的清除能力，且對(duì)自由基的清除率隨著色素濃度的增大而增大。即色素濃度越大，清除羥基自由基能力越強(qiáng)。清除能力與色素濃度有一定的量效關(guān)系，但當(dāng)增加到一定濃度（3.0×10-3g/m L）時(shí)，清除率基本不變。

圖7 濃度對(duì)黃色素清除·OH的能力的影響Fig.7 Effectof pigmentconcentration on hydroxyl radical（·OH）scavenging capacity of pigment

2.4.3 過氧化氫清除率 如圖8所示。隨著油菜花黃色素濃度的增加，過氧化氫清除率增大，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；當(dāng)黃色素濃度增加5.95×10-3g/m L以上，清除率在50%以上，表明黃色素對(duì)過氧化氫有較強(qiáng)的清除能力；油菜花黃色素的清除率曲線位于VC之下，可以看出油菜花黃色素抗氧化能力略低于同濃度的VC。

3 結(jié)論

3.1 油菜花難溶于水，易溶于95%乙醇和丙酮等有機(jī)溶劑。95%乙醇提取油菜花色素的最大吸收波長(zhǎng)為440nm。在單因素的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)選擇出油菜花黃色素微波輔助提取最佳的提取工藝條件是：提取溫度80℃，回流時(shí)間為15m in，液料比為1∶40（g/m L），微波時(shí)間為30s。各因素對(duì)黃色素提取率影響程度大小順序?yàn)椋阂毫媳龋疚⒉〞r(shí)間＞回流時(shí)間＞提取溫度。

圖8 黃色素清除過氧化氫能力測(cè)定結(jié)果Fig.8 H2O2scavenging capacity of the pigment

3.2 通過POV值（過氧化值）、·OH清除率及過氧化氫清除率的測(cè)定，表明油菜花黃色素具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

3.3 本文采用微波助提法提取油菜花黃色素，相對(duì)于浸提法有較高的提取率，且高效節(jié)能省時(shí)。油菜花資源豐富，色素含量高，顏色鮮艷，易于提取，具有一定的抗氧化能力。除可作為著色劑使用，還可用作功能性添加劑添加到保健食品中，是一種很有前途的功能性添加劑。

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Study on the extraction and anti-oxidative activities of yellow pigment w ith m icrowave-assisted extraction from Hanzhong rapeseed flowers

SHIJuan1，LIHong-ying2
（1.School of Chemistry and Environment Science，ShaanxiUniversity of Technology，Hanzhong 723000，China；2.Zichang Siwan Central Hospital，Yan’an 717307，China）

The p igmentwas extrac ted from rapeseed flowers by m icrowave-assisted extraction technology.On the basis of sing le-factor experiments，the op timal operating conditions were ob tained w ith orthogonal design. The op timum extrac tion cond itions was estab lished as follows：the concentration of ethanol 95%，extracted 30s w ith m icrowave rad iation，the reflux time was 15m in，the reaction tem perature was 80℃and the ratio ofmaterial to liquid 1∶40.The yellow pigment could inhibit the oxidant deg ree of the edib le oil.The capacity to scavenge hyd roxyl free rad icaland H2O2increased as wellas the concentration w ithin a certain degree.

rapeseed flowers；yellow pigment；m icrowave-assisted；technologicalcond ition；anti-oxidative ac tivities

TS201.1

B

1002-0306（2014）18-0236-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.043

2013－12－31

史娟（1978-），女，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)和有機(jī)合成。

國(guó)家自然科學(xué)基金（21373132）；教育廳2012年科學(xué)研究項(xiàng)目（12JK0633）。