接種量對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)期及生長(zhǎng)界面的影響

周小紅，李學(xué)英，楊憲時(shí)，遲 海

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海200090）

接種量對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)期及生長(zhǎng)界面的影響

周小紅，李學(xué)英，楊憲時(shí)*，遲 海

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海200090）

為了初步了解接種量對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)狀況及生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)單增李斯特菌在0、4、10、25℃下通過(guò)培養(yǎng)菌液在600nm下的吸光光度值對(duì)其生長(zhǎng)周期曲線分別進(jìn)行了測(cè)定，并分析了不同接種量的單增李斯特菌菌液在25℃下的生長(zhǎng)周期狀況，探討了純培養(yǎng)條件下不同鹽度和pH下，接種量對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況的影響。結(jié)果表明：不同的溫度下，單增李斯特菌的生長(zhǎng)周期有很大的差別；而在相同溫度下，接種量對(duì)單增李斯特菌的生長(zhǎng)周期有較大的影響，隨著接種水平的降低，菌種生長(zhǎng)所需的延滯時(shí)間越長(zhǎng)，接種量為107CFU/mL時(shí)，其生長(zhǎng)延滯期為0～4h，而當(dāng)接種量減少為10CFU/mL時(shí)，其生長(zhǎng)延滯期為0～16h；而對(duì)于單增李斯特菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面而言，接種量對(duì)其也有一定的影響，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入的研究。

單增李斯特菌，接種量，生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)界面

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，LM）是目前國(guó)際公認(rèn)的重要食源性病原菌之一，曾多次引起食物中毒事件，臨床死亡率高達(dá)20%～70%，WTO將其列為四大食源性致病菌之一[1-2]。它是一種人畜共患的致病菌，能引起人類腦膜炎、敗血癥等疾病，尤其對(duì)孕婦、新生兒、老年人以及免疫功能缺陷者具有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)[3]。雖然發(fā)病率不高，但致死率（20%～30%）[4]遠(yuǎn)高于其他常見(jiàn)食源性病原菌。雖然在國(guó)內(nèi)基本還沒(méi)有爆發(fā)由單增李斯特菌引起的嚴(yán)重中毒事件，但在國(guó)外時(shí)有此類相關(guān)報(bào)道，所以引起了廣泛的關(guān)注和重視，國(guó)外對(duì)單增李斯特菌的研究也較多，但是有關(guān)接種量對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)狀況的影響還相當(dāng)有限，所以本文旨在探討接種量對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)及生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況的影響，以期為進(jìn)一步建立單增李斯特菌在純培養(yǎng)和實(shí)際產(chǎn)品中的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型奠定基礎(chǔ)和提供參考依據(jù)。本文在0、4、10、25℃溫度下通過(guò)菌液的OD600值對(duì)單增斯特菌的生長(zhǎng)周期進(jìn)行了測(cè)定，分析了不同接種量菌液在25℃下的生長(zhǎng)周期狀況，并探討了純培養(yǎng)條件下不同鹽度和pH下，接種量對(duì)單增增李斯特菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況的影響。旨在進(jìn)一步建立純培養(yǎng)條件下不同接種量下單增李斯特菌在不同溫度、鹽度和pH下的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型，為實(shí)際產(chǎn)品中單增李斯特菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型的建立提供參考依據(jù)，預(yù)測(cè)和控制單增李斯特菌在食品中的污染。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌種單核細(xì)胞增生李斯特菌（LM 54001） 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品研究所；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE），含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、腦心浸液（BHI） 北京陸橋技術(shù)有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀、硼砂、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸等化學(xué)試劑（AR） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海分公司。

ESCO CA2-4A1型操作安全柜 上海生叉儀器有限公司；YXQ-LS-50SII型全自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Sanyo M IR 150、153型恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋科研設(shè)備公司；721型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司數(shù)顯；Sanyo M IR 253、553高精度低溫培養(yǎng)箱 日本三洋科研設(shè)備公司；pHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；SA-960-II SHJ-系列凈化工作臺(tái) 上海凈化設(shè)備廠；LabMASTER-aw型水分活度儀 瑞士Novasina公司；Power wave XS型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bioteck公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的準(zhǔn)備 菌株采取斜面低溫保藏法于4℃冰箱中保藏[5]。每月移種一次，實(shí)驗(yàn)前用無(wú)菌接種環(huán)挑取一至兩環(huán)加入無(wú)菌TSB-YE液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到108CFU/m L[6-7]，以作為菌懸液備用。

1.2.2 單增李斯特菌在不同溫度和接種量下生長(zhǎng)周期的測(cè)定 選擇0、4、10、25℃四個(gè)溫度，參照PMP數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)數(shù)據(jù)，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)菌液的OD600值，分別對(duì)單增李斯特菌在該幾個(gè)溫度下的生長(zhǎng)周期進(jìn)行測(cè)定；取滅菌后的TSB-YE培養(yǎng)基無(wú)菌操作移取到滅菌的96孔板里，每個(gè)小孔分裝200μL，分別做四個(gè)平行[8]。將菌懸液分別稀釋到10、103、105、107CFU/m L數(shù)量級(jí)，分別吸取50μL到上述的小孔中，然后滴加50μL的無(wú)菌石蠟油并蓋上無(wú)菌塑料蓋，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)[9-10]，每?jī)尚r(shí)取出培養(yǎng)板放入微孔板掃描分光光度計(jì)中讀取各孔在光波波長(zhǎng)600nm下的OD值。

1.2.3 不同接種量下單增李斯特菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)的測(cè)定 基于前期實(shí)驗(yàn)的單因素實(shí)驗(yàn)[11]以及一些相關(guān)參考文獻(xiàn)，選擇溫度25℃，鹽度分別為0.5%、2.5%、4.5%、6.5%、8.5%，pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在接種量分別為10、103、105、107C FU/m L四個(gè)水平下對(duì)單增李斯特菌的生長(zhǎng)與非生長(zhǎng)狀況進(jìn)行了部分因子實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，配制TSB-YE液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其鹽度、pH到各實(shí)驗(yàn)所需的條件下，然后將各培養(yǎng)基分裝到各個(gè)試管中，121℃下滅菌20m in。將菌懸液分別以10倍梯度稀釋到10、103、105、107CFU/m L的接種水平，單增李斯特菌的初始接種量通過(guò)涂布TSA-YE平板計(jì)算得到。各試管振蕩混勻后放入相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱，根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)做兩個(gè)平行，培養(yǎng)結(jié)束后觀察各試管的混濁度。

1.2.4 單增李斯特菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)的判定方法 如果試管中菌液混濁度明顯，則判定其生長(zhǎng)，并記為1；對(duì)于菌液混濁度不明顯或者有質(zhì)疑的試管，則對(duì)該試管進(jìn)行涂布確認(rèn)，并將菌種培養(yǎng)48h后的菌落總數(shù)與初始接種菌數(shù)進(jìn)行比較，如果最終的菌量比初始接種量多于0.5lg CFU/m L[12]，則判定單增李斯特菌生長(zhǎng)，并記為1，否則記為0。對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果有偏差的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，按上述方法再次進(jìn)行重新測(cè)定確認(rèn)，如果還是與預(yù)測(cè)結(jié)果不符，則作為異常點(diǎn)保留。

2 結(jié)果與分析

2.1 各溫度下單增李斯特菌的生長(zhǎng)曲線

如圖1所示，圖（a）、（b）、（c）、（d）分別表示單增李斯特菌在0、4、10、25℃下的生長(zhǎng)周期曲線，單增李斯菌在該四個(gè)溫度下的生長(zhǎng)穩(wěn)定期分別為12～20d、12～18d、6～8d、20～24h，由此可以看出，菌種在不同的溫度下其生長(zhǎng)周期是不同的，一般溫度越低，生長(zhǎng)所需的時(shí)間越長(zhǎng)。所以在后期實(shí)驗(yàn)中，可分別選擇不同溫度下單增李斯特菌對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)穩(wěn)定期作為菌液的培養(yǎng)時(shí)間。

溫度作為影響微生物生長(zhǎng)最直接的因素之一，對(duì)菌種的生長(zhǎng)有較大的影響，因此在實(shí)際產(chǎn)品貯藏過(guò)程中，可以適當(dāng)提高和降低貯藏溫度，再結(jié)合其他生長(zhǎng)控制條件來(lái)控制菌種的生長(zhǎng)。

2.2 不同接種量下單增李斯特菌的生長(zhǎng)曲線

如圖2所示，接種量1、接種量2、接種量3、接種量4分別對(duì)應(yīng)單增李斯特菌的菌液接種濃度為107、105、103、10CFU/m L，由圖2可以看出，4條生長(zhǎng)曲線中，接種的菌液濃度越高，菌種對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)延滯期越短。接種量為107CFU/m L的時(shí)候，其生長(zhǎng)延滯期為0～4h；接種量為105CFU/m L的時(shí)候，其生長(zhǎng)延滯期為0～8h；接種量為103CFU/m L的時(shí)候，其生長(zhǎng)延滯期為0～14h；接種量為10CFU/m L的時(shí)候，其生長(zhǎng)延滯期為0～16h。由此可以得出，接種量對(duì)于單增李斯特菌的生長(zhǎng)周期有很大的影響。

接種量不同的情況下，單增李斯特菌生長(zhǎng)的延滯時(shí)間的差別，可針對(duì)實(shí)際產(chǎn)品中微生物污染率的不同，預(yù)測(cè)其致病性和食品的安全性。與腐敗菌達(dá)到一定數(shù)量食品才會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題不同，致病菌處于任何生長(zhǎng)期就有引起中毒的潛在危險(xiǎn)，因此對(duì)于含有潛在致病菌和產(chǎn)毒素菌株的食品來(lái)說(shuō)，描述接種量對(duì)其生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)情況具有重要的意義。

2.3 不同接種量下單增李斯特菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況

由表1～表4可看出，在溫度為25℃的環(huán)境下，當(dāng)培養(yǎng)基的pH≤4.5時(shí)，在鹽度為0.5%～8.5%的范圍內(nèi)，接種量為10、103、105、107CFU/m L的菌液均不生長(zhǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基的pH≥6.0時(shí)，在鹽度為0.5%～8.5%的范圍內(nèi)，接種量為10、103、105、107CFU/m L的菌液均生長(zhǎng)，即pH≥6.0時(shí)，鹽度和接種量對(duì)單增李斯特菌的生長(zhǎng)基本沒(méi)什么影響；而當(dāng)4.5≤pH＜6.0時(shí)，菌液的濃度低于105CFU/m L時(shí)，例如接種濃度分別為10、103CFU/m L時(shí)，接種量為10CFU/m L的菌液對(duì)鹽度和酸度的耐受性反而高于接種量為103CFU/m L的菌液，當(dāng)接種菌液濃度為105CFU/m L和107CFU/m L，單增李斯特菌的生長(zhǎng)與非生長(zhǎng)狀況基本沒(méi)什么差異；而接種量為103CFU/m L和105CFU/m L作比較，可以看出菌液接種濃度越高，單增李斯特菌對(duì)鹽度和酸度的耐受性越強(qiáng)。

圖1 單增李斯特菌在0、4、10、25℃下的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Liseriamonocytogenes under 0，4，10，25℃

圖2 25℃下單增李斯特菌在接種量10、103、105、107CFU/mL下的生長(zhǎng)曲線Fig 2 Growth curve of Liseriamonocytogenes under 25℃with inoculation level of 10，103，105，107CFU/mL

表1 25℃環(huán)境下單增李斯特菌在接種量為10CFU/mL下的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況Table 1 Growth and no growth state of Liseriamonocytogenes under 25℃with inoculation level of 10CFU/mL

表2 25℃環(huán)境下單增李斯特菌在接種量為103CFU/mL下的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況Table 2 Growth and no growth state of Lismonocytogenes under 25℃with inoculation level of 103CFU/mL

單增李斯特菌作為一種重要的食源性致病菌，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其生長(zhǎng)及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型做了大量的研究，雖然在研究其微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)中很少將接種量作為影響因子，但是有研究表明它可能對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。Baranyi[13]、Baranyi和Pin[14]在其研究中表明隨著接種的細(xì)胞數(shù)的減少，接種水平達(dá)到102～103細(xì)胞數(shù)的菌液生長(zhǎng)延滯期延長(zhǎng)[15]。最新研究也表明接種量對(duì)于微生物開始能夠生長(zhǎng)這種能力具有的重要性，Robinson等的報(bào)道中指出單增李斯特菌開始生長(zhǎng)所需的細(xì)胞數(shù)在理想生長(zhǎng)條件下為1CFU/m L，在1.8mol/L濃度的NaCl作用下增加到105CFU/m L，類似的結(jié)論在降低pH和增加化學(xué)抗菌劑濃度的研究中也有報(bào)道[16-17]。因此本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步了解和證實(shí)接種量對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)的影響，對(duì)其在10、103、105、107CFU/m L接種水平下的生長(zhǎng)周期和生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況做了研究。

表3 25℃環(huán)境下單增李斯特菌在接種量為105CFU/mL下的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況Table 3 Growth and no growth state of Liseriamonocytogenes under 25℃with inoculation level of 105CFU/mL

表4 25℃環(huán)境下單增李斯特菌在接種量為107CFU/mL下的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況Table 4 Growth and no growth state of Liseriamonocytogenes under 25℃with inoculation level of 107CFU/mL

本實(shí)驗(yàn)先對(duì)單增李斯特菌在0、4、10、25℃下的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定，是為下一步生長(zhǎng)與非生長(zhǎng)模型的建立過(guò)程中各溫度所需的培養(yǎng)時(shí)間提供一定的參考依據(jù)。另外接種量對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)狀況的影響，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，接種量對(duì)單增李斯特菌的生長(zhǎng)周期有顯著的影響，隨著接種水平的降低，菌種生長(zhǎng)所需的延滯時(shí)間越長(zhǎng)，接種量為107CFU/m L時(shí)，其生長(zhǎng)延滯期為0～4h，而當(dāng)接種量減少為10CFU/m L時(shí)，其生長(zhǎng)延滯期為0～16h；而對(duì)于單增李斯特菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)而言，接種量對(duì)其可能有一定的影響，當(dāng)接種菌液濃度較低時(shí)，如10CFU/m L和103CFU/m L時(shí)，接種量低的菌液對(duì)環(huán)境的耐受性反而強(qiáng)于接種量高的菌液，這有可能受菌與菌之間的相互競(jìng)爭(zhēng)影響，而當(dāng)接種菌液濃度達(dá)到一定值時(shí)，接種量對(duì)其生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)基本沒(méi)有什么影響，如105CFU/m L和107CFU/m L接種量時(shí)，單增李斯特菌的生長(zhǎng)與非生長(zhǎng)狀況基本沒(méi)什么差異，而將接種量為103CFU/m L和105CFU/m L作比較，又得出菌液接種濃度越高，單增李斯特菌對(duì)鹽度和酸度的耐受性越強(qiáng)，但差異也不是很明顯，所以接種量對(duì)于微生物的生長(zhǎng)與非生長(zhǎng)界面可能有一定的影響，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入的研究。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明溫度不同，單增李斯特菌的生長(zhǎng)周期有很大的差別，溫度越低，延滯期的時(shí)間越長(zhǎng)，這對(duì)于不同溫度下確定微生物的致病性具有一定的參考意義；而在相同溫度下，接種量對(duì)單增李斯特菌的生長(zhǎng)周期有較大的影響，隨著接種水平的降低，菌種生長(zhǎng)所需的延滯時(shí)間越長(zhǎng)，接種量為107CFU/m L時(shí)，其生長(zhǎng)延滯期為0～4h，而當(dāng)接種量減少為10CFU/m L時(shí)，其生長(zhǎng)延滯期為0～16h，所以可以預(yù)測(cè)在實(shí)際產(chǎn)品中，致病菌的污染率不一樣，其致病性也會(huì)有一些差別；而對(duì)于單增李斯特菌的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面而言，接種量對(duì)其也有一定的影響，但其在純培養(yǎng)條件下波動(dòng)性較大，變化趨勢(shì)不是特別有規(guī)律，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入的研究，而且在實(shí)際產(chǎn)品中其生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面情況還會(huì)更復(fù)雜，所以需要更進(jìn)一步的研究和探索。

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Effect of inoculum size on grow th phase and grow th interface of Listeria monocytogenes under different cultural conditions

ZHOU Xiao-hong，LIXue-ying，YANG Xian-shi*，CHIHai
（East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai200090，China）

To p relim inary understanding the influence of inoculation levelon g row th/no g row th interface of Listeria monocytogenes，the experiment was carried on 0，4，10，25℃under 600nm absorp tion values to determ ine its grow th phase by its turbid ity of bacteria liquid respec tively，and the g row th state of Listeria monocytogenes in different inoculum size under 25℃ was analyzed，and the effect of inoculation level on grow th/no grow th interface of Listeriamonocytogenes under pure cultivation combined w ith d ifferentsalinity and pH was d iscussed. The results showed that there was a big difference among the g row th of Listeria monocytogenes under different tem peratures.And at the same tem perature，inoculation level had a great influence on the g row th of Listeria monocytogenes.With the decrease of inoculation level，the lag phase required for bac terial g row th was p rolonged.When the inoculation level was 107CFU/m L，its lag phase was 0～4h.However，its lag phase increased to 0～16h when the inoculation level reduced to 10CFU/m L In term s of grow th/no grow th of Listeria monocytogenes，inoculum size also had certain influence on its interface，but the mechanism requires further specific studies.

Listeriamonocytogenes；inoculum size；grow th phase；g row th interface

TS201.3

A

1002-0306（2014）18-0180-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.030

2013－11－20 *通訊聯(lián)系人

周小紅（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程。

農(nóng)業(yè)部引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（2011-Z12）。