液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)花生抗氧化肽和中性蛋白酶的工藝優(yōu)化

劉紅梅，師廣波，馬艷芳，李向東，孫中濤，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東泰安271018）

液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)花生抗氧化肽和中性蛋白酶的工藝優(yōu)化

劉紅梅1，師廣波1，馬艷芳1，李向東2，孫中濤1，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東泰安271018）

以花生粕為原料，采用枯草芽孢桿菌AS1.398進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)抗氧化肽的過程中，可以積累大量的副產(chǎn)物——中性蛋白酶。單因素和中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同時(shí)生產(chǎn)抗氧化肽和中性蛋白酶的最佳工藝條件為接種量1%（v/v），pH自然，發(fā)酵溫度34℃，發(fā)酵時(shí)間71h，在此條件下，發(fā)酵液的理論DPPH自由基清除率為81.51%，中性蛋白酶活力為600U/mL。

花生粕，抗氧化肽，枯草芽孢桿菌AS1.398，液態(tài)發(fā)酵，中性蛋白酶，中心組合實(shí)驗(yàn)

我國(guó)花生粕資源豐富，年產(chǎn)量逾150萬t，位列世界首位[1]?；ㄉ傻鞍踪|(zhì)含量高達(dá)50%左右，氨基酸組成合理，價(jià)格相對(duì)低廉，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源。但因其溶解性較差，目前多用作蛋白飼料，在食品工業(yè)中應(yīng)用很少[2]。近年來，采用蛋白酶對(duì)花生粕進(jìn)行適度水解生產(chǎn)抗氧化肽的研究備受關(guān)注，花生蛋白水解成低分子肽后，不僅溶解性增強(qiáng)，易于消化吸收，還具有較強(qiáng)的抗氧化性等生理活性，可用于功能性食品以減輕氧自由基對(duì)人體的損害，也可作為天然抗氧化劑用于食品工業(yè)[3]。

生物體內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生氧自由基和活性氧簇[4]。氧自由基和活性氧簇如不能及時(shí)清除，會(huì)引發(fā)許多疾病，如中風(fēng)和癌癥等[5]。在食品工業(yè)中，氧自由基和活性氧簇可引起脂質(zhì)氧化，導(dǎo)致食品變質(zhì)[6]?；ㄉ木哂泻軓?qiáng)的抗氧化性，可以狙滅氧自由基和活性氧簇，從而消除其危害性[7]。

花生肽的生產(chǎn)方式有兩種：即酶解法和發(fā)酵法。酶解法反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)周期短，但需消耗大量的食品級(jí)蛋白酶制劑，購買酶制劑的費(fèi)用高達(dá)總生產(chǎn)成本的40%～50%。發(fā)酵法雖然不需額外添加蛋白酶，但因發(fā)酵周期長(zhǎng)，發(fā)酵過程需通入大量無菌空氣，生產(chǎn)成本也居高不下。發(fā)酵法生產(chǎn)花生抗氧化肽的過程中，微生物可以分泌大量的蛋白酶，但目前沒有對(duì)其進(jìn)行綜合利用。本研究以花生粕為原料，采用枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)抗氧化肽的同時(shí)，盡可能提高發(fā)酵液的蛋白酶活力。將花生抗氧化肽和蛋白酶兩種產(chǎn)品耦合在同一個(gè)生產(chǎn)過程中，可以提高生產(chǎn)收益，降低花生抗氧化肽的生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生粕 購自泰安，蛋白質(zhì)含量46.88%（w/w）；DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼）自由基、D-果糖與福林酚試劑 均購自Solarbio公司；甘氨酸 購自Sanland-chem International Inc；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；枯草芽孢桿菌AS1.398、地衣芽孢桿菌2709、植物乳桿菌和米曲霉 均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供，其中枯草芽孢桿菌AS1.398、地衣芽孢桿菌2709和植物乳桿菌的菌種保存均采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂2.5g/L；米曲霉的保存采用麩皮培養(yǎng)基：麩皮50g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L；活化培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：花生粕100g/L；將培養(yǎng)基121℃滅菌20m in，冷卻備用。

SW-CJ-1FD凈化工作臺(tái) 常州凈化設(shè)備有限公司；THZ-C恒溫?fù)u床 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；LDZX-40BI型壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；Spectrum lab S22分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；JA1003電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；Anke TGL-16B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵菌種的選擇 從菌種斜面上挑取一環(huán)菌種，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于180r/min振蕩培養(yǎng)72h。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液于12000r/m in離心5m in，取上清液測(cè)定酸溶性多肽含量、水解度及抗氧化能力。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 從斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌種，接入活化培養(yǎng)基，37℃搖床150～180r/min活化培養(yǎng)8～12h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基。在選定的溫度和pH下，于150～180r/min進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，12000r/min離心5m in，測(cè)定上清液的DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力。

發(fā)酵時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵條件：接種量1%（v/v）、30℃和自然pH，發(fā)酵時(shí)間分別為12、24、36、48、60、72h；接種量單因素實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵條件：37℃、自然pH和72h，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%（v/v）；pH單因素實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵條件：接種量1%（v/v）、37℃和72h，pH分別為5、6、7、8、9；溫度單因素實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵條件：接種量1%（v/v）、自然pH和72h，溫度分別為30、33、37、40、44℃。

1.2.3 中心組合實(shí)驗(yàn) 由于接種量對(duì)發(fā)酵液的DPPH自由基清除率和蛋白酶活力的影響不顯著，調(diào)節(jié)pH對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量造成影響，因此選擇發(fā)酵溫度和時(shí)間兩個(gè)因素設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)。固定接種量1%（v/v），pH自然，其余因素與水平見表1。為使擬合方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，中心點(diǎn)重復(fù)5次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.1進(jìn)行多元回歸分析并構(gòu)建二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型：

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)的因素和水平Table 1 Experimental factors and levels of the independent variables in Central Composite Design

式中，Y：響應(yīng)值（DPPH自由基清除率和蛋白酶活力）；xi、xj：自變量編碼值；βo：常系數(shù)；βi：線性系數(shù)；βii：二次項(xiàng)系數(shù)；βij：交互項(xiàng)系數(shù)。

1.3 分析方法

1.3.1 酸溶性多肽含量測(cè)定 發(fā)酵液于12000r/m離心5min，取上清液，加入等體積的10%（w/w）的三氯乙酸，混勻后室溫放置10min，再于8000r/min離心20min，取上清液，利用雙縮脲法測(cè)定其酸溶性多肽的含量[8]。

1.3.2 蛋白酶活力測(cè)定 采用Folin-酚法[9]。發(fā)酵液于12000r/min離心5min，取上清液并進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測(cè)定蛋白酶的活力。

1.3.3 水解度的測(cè)定 水解度是水解過程中斷裂的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的百分比。肽鍵斷裂后生成多肽或氨基酸，ɑ-氨基氮含量增加，因此，水解度可根據(jù)水解過程中生成的ɑ-氨基氮的數(shù)量，依據(jù)式（2）計(jì)算。

水解后生成的ɑ-氨基氮的量采用茚三酮法[10]測(cè)定，樣品總含氮量采用凱氏定氮法[11]測(cè)定。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測(cè)定 采用Yama的方法[12]：發(fā)酵液于12000r/m in離心5m in，取上清液并進(jìn)行適當(dāng)稀釋。取2m L稀釋液，加入到2m L 0.1～0.2mmol/L的DPPH無水乙醇溶液中，混勻，室溫下避光放置30min，于517nm測(cè)定吸光值A(chǔ)1。以95%乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液，按上述方法測(cè)定吸光度A2，以95%乙醇溶液代替待檢樣品，按上述方法測(cè)定吸光度A3。DPPH自由基清除率按下式計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)分析

單因素實(shí)驗(yàn)采用DPS 7.05對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，中心組合實(shí)驗(yàn)采用Design Expert 7.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同菌種對(duì)多肽含量、水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖1 不同菌種對(duì)多肽含量、水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effectof different strains on TCA-soluble polypeptides content，degree ofhydrolysisand DPPH radical scavenging ability

不同菌種對(duì)發(fā)酵液的酸溶性多肽含量、水解度和DPPH自由基清除率的影響如圖1所示。不同菌種的發(fā)酵液酸溶性多肽含量、水解度和DPPH自由基清除率差異顯著（p＜0.05）?？莶菅挎邨U菌AS1.398發(fā)酵液的酸溶性多肽含量、水解度和DPPH自由基清除率均顯著高于其他菌種的發(fā)酵液，尤其是DPPH自由基清除率。這是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌AS1.398是酶制劑工業(yè)中生產(chǎn)中性蛋白酶普遍采用的菌種，具有很強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，對(duì)花生蛋白分解能力強(qiáng)。因此，本研究選擇枯草芽孢桿菌AS1.398作為發(fā)酵菌種。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液的DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響如圖2所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶活力迅速升高，水解度緩慢升高，但DPPH自由基清除率緩慢降低。DPPH自由基清除率逐漸下降，這是因?yàn)榘l(fā)酵過程中一些抗氧化能力強(qiáng)的肽段會(huì)因蛋白質(zhì)的水解而產(chǎn)生，也會(huì)因進(jìn)一步水解成小分子肽或被枯草芽孢桿菌同化吸收而喪失其抗氧化性。此規(guī)律與柳杰[13]的研究結(jié)果恰巧相反，是因?yàn)椴捎玫木N不同，導(dǎo)致產(chǎn)生的酶系不同，對(duì)花生粕的作用機(jī)理也就不同。在發(fā)酵時(shí)間12h時(shí)，DPPH自由基清除率比柳杰的高約50%，是因?yàn)榘l(fā)酵培養(yǎng)基中花生粕的質(zhì)量濃度和發(fā)酵液的稀釋倍數(shù)不一樣。發(fā)酵時(shí)間短些，雖然發(fā)酵液的DPPH自由基清除率較高，但因花生蛋白的水解度低，可溶性的肽含量少，產(chǎn)品收率低，溶解性也差。延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，雖然蛋白酶活力增高，產(chǎn)品水解度增大，但其抗氧化性會(huì)下降。因此，綜合考慮花生肽的DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力，宜選擇54h作為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響Fig.2 Effectof fermentation time on DPPH radical scavenging ability，degree of hydrolysis and protease activity

2.3 接種量對(duì)DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響

接種量對(duì)發(fā)酵液的DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響如圖3所示。當(dāng)接種量在1%～5%（v/v）之間變化時(shí)，DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力差異均不顯著（p＞0.05）。實(shí)際生產(chǎn)中，選擇1%～2%（v/v）的接種量即可。

2.4 pH對(duì)DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響

pH對(duì)發(fā)酵液的DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響如圖4所示。在pH 5～9的范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率和水解度變化不顯著（p＞0.05），蛋白酶活力變化顯著（p＜0.05）。在pH 7時(shí)，蛋白酶活力最高。發(fā)酵液的自然pH為5.7，因其緩沖性較強(qiáng)，如進(jìn)行調(diào)節(jié)，會(huì)消耗較多的NaOH，導(dǎo)致產(chǎn)品中鹽分含量過高，影響產(chǎn)品質(zhì)量。因此，綜合考慮產(chǎn)品質(zhì)量和蛋白酶活力，生產(chǎn)中宜選用自然pH進(jìn)行發(fā)酵。

圖3 接種量對(duì)DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響Fig.3 Effectof inoculum level on DPPH radical scavenging ability，degree of hydrolysis and protease activity

圖4 pH對(duì)DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響Fig.4 Effectof pH on DPPH radical scavenging ability，degree of hydrolysis and protease activity

2.5 發(fā)酵溫度對(duì)DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響如圖5所示。37℃是枯草芽孢桿菌AS1.398的最佳產(chǎn)酶溫度，此時(shí)發(fā)酵液的蛋白酶活力最大。水解度受蛋白酶數(shù)量和溫度的雙重影響，40℃時(shí)蛋白酶產(chǎn)量?jī)H為37℃時(shí)的53.6%，但其水解度卻比37℃時(shí)高（p＜0.05），其原因是溫度較高時(shí)酶促反應(yīng)速度快，彌補(bǔ)了蛋白酶數(shù)量的減少。DPPH自由基清除率的變化比較復(fù)雜，溫度在30～44℃之間變化時(shí)，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先減小后增加的變化趨勢(shì)，但變化幅度不大。DPPH自由基清除率與水解度的變化規(guī)律不一致，說明并非水解度越高抗氧化性越強(qiáng)，這與Vilailak的研究結(jié)果是一致的[14]。因此，優(yōu)化生產(chǎn)工藝時(shí)，宜以提高抗氧化性為目的，而不是單純的提高水解度。

2.6 中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。采用Design Expert 7.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得DPPH自由基清除率Y1和蛋白酶活力Y2對(duì)溫度（A）和時(shí)間（B）兩個(gè)因素的回歸方程：

圖5 溫度對(duì)DPPH自由基清除率、水解度和蛋白酶活力的影響Fig.5 Effectof temperature on DPPH radical scavenging ability，degree of hydrolysis and protease activity

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of central composite design

方差分析結(jié)果如表3所示。DPPH自由基清除率和蛋白酶活力的兩個(gè)回歸模型均高度顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9917和0.9732，表明其擬合度和可信度均較高，能夠很好的對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行描述與預(yù)測(cè)。模型的一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)AB和二次項(xiàng)A2、B2對(duì)DPPH自由基清除率的影響極顯著（p＜0.01），一次項(xiàng)A對(duì)DPPH自由基清除率的影響顯著（p＜0.05）；一次項(xiàng)A和B、交互項(xiàng)AB和二次項(xiàng)A2對(duì)蛋白酶活力的影響極顯著（p＜0.01），二次項(xiàng)B2對(duì)蛋白酶活力的影響顯著（p＜0.05）。為了更直觀地描述溫度與時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率和蛋白酶活力的影響，利用Design Expert 7.1軟件繪制其響應(yīng)面圖，如圖6所示。由圖6（a）可知，當(dāng)時(shí)間不變時(shí)，隨著溫度的升高，DPPH自由基清除率先增大后趨于平穩(wěn)，變化幅度較大；當(dāng)溫度不變時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH自由基清除率先增大后減小，變化幅度較大。綜合得出，當(dāng)溫度在36.82℃，時(shí)間在57.70h時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到極值85.45%。由圖6（b）可知，固定時(shí)間不變，當(dāng)時(shí)間較短時(shí)，隨著溫度的升高，蛋白酶活力先升高后趨于平穩(wěn)，變化幅度較??；當(dāng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，隨著溫度的升高，蛋白酶活力逐漸減小，變化幅度較大。固定溫度不變，當(dāng)溫度較低時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶活力逐漸增大，變化幅度較大；當(dāng)溫度較高時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶活力變化不明顯。由此可以看出，溫度和時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的交互影響比較大。在實(shí)際生產(chǎn)中必須兼顧DPPH自由基清除率和蛋白酶活力，因此，我們將二者設(shè)定為相同的權(quán)重進(jìn)行優(yōu)化求解，模型預(yù)測(cè)的最佳點(diǎn)的編碼值為A=-0.73、B=0.94，解碼后可得其真實(shí)值，即溫度34℃，時(shí)間71h，在此條件下，理論DPPH自由基清除率為81.51%，蛋白酶活力為600U/m L。

表3 中心組合實(shí)驗(yàn)的回歸分析結(jié)果Table 3 Regression results from the data of Central Composite Design

圖6 溫度和時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率（a）與蛋白酶活力（b）影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots showing effectof temperature and time on DPPH radical scavenging ability（a）and protease activity（b）

3 結(jié)論

采用枯草芽孢桿菌AS1.398對(duì)花生粕進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)抗氧化肽的同時(shí)，可以產(chǎn)生大量的中性蛋白酶，對(duì)此副產(chǎn)物進(jìn)行回收利用，可以提高經(jīng)濟(jì)效益。研究結(jié)果表明，同時(shí)生產(chǎn)抗氧化肽和中性蛋白酶的最佳工藝條件為接種量1%（v/v），pH自然，溫度34℃，時(shí)間71h，在此條件下，發(fā)酵液的理論DPPH自由基清除率為81.51%，中性蛋白酶活力為600U/m L。本文將花生肽的生產(chǎn)和蛋白酶的生產(chǎn)耦合到同一個(gè)發(fā)酵過程中，對(duì)花生肽、大豆肽等肽類生產(chǎn)過程中如何充分利用副產(chǎn)物蛋白酶，以及對(duì)蛋白酶生產(chǎn)過程中如何充分利用副產(chǎn)物小分子肽都具有參考價(jià)值。

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Optim ization of the production of peanut antioxidative peptides and Neutrase using liquid state fermentation

LIU Hong-mei1，SHIGuang-bo1，MA Yan-fang1，LIXiang-dong2，SUN Zhong-tao1，*
（1.College of Life Science，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China；2.College of Agronomy，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

A large amount of by-p roduc t-Neutrase could be accumulated during the liquid state fermentation of Bacillus sub tilis AS 1.398 to p roduce antioxidant pep tides w ith peanut meal as raw material.The results of sing le factor investigations and central com posite design showed that，the op timum conditions to p roduce antioxidantpep tides and Neutrase at the same time were inoculation amountof 1%（v/v），naturalpH，fermentation tem perature of 34℃，fermentation time of 71h.Under these cond itions，the DPPH rad ical scavenging ability of fermentation liquid p redicted was 81.51%and the activity of Neurtase was 600U/m L.

peanutmeal；antioxidative pep tides；Bacillus sub tilis AS 1.398；liquid state fermentation；Neutrase；central com posite design

TS218

A

1002-0306（2014）18-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.029

2013－12－09 *通訊聯(lián)系人

劉紅梅（1988-），女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程與酶工程。