羅非魚皮膠原蛋白肽亞鐵螯合修飾及螯合物性質(zhì)的研究

段 秀，楊成濤，孫 云，孫麗平，莊永亮

（昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院食品科學(xué)研究中心，云南昆明650500）

羅非魚皮膠原蛋白肽亞鐵螯合修飾及螯合物性質(zhì)的研究

段 秀，楊成濤，孫 云，孫麗平*，莊永亮

（昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院食品科學(xué)研究中心，云南昆明650500）

以羅非魚皮為原料制備膠原蛋白肽（TSGP），膠原蛋白肽與亞鐵鹽進(jìn)行螯合反應(yīng)，對(duì)TSGP亞鐵螯合物的理化性質(zhì)及功能特性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出最佳螯合反應(yīng)條件是m多肽∶mFeCl2·4H2O=500∶1，pH為6.0，反應(yīng)時(shí)間50min，溫度35℃。通過熒光光譜、紫外光譜和紅外光譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)Fe2+與TSGP的羧基與氨基均可發(fā)生配位反應(yīng)?？寡趸钚詼y(cè)定實(shí)驗(yàn)表明，螯合物具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基和ABTS+自由基的能力。

羅非魚皮，膠原蛋白肽，亞鐵螯合物，結(jié)構(gòu)，抗氧化

羅非魚（tilapia）屬于鱸形目麗魚科羅非魚屬，是世界上重要的淡水養(yǎng)殖魚類。在過去的幾年中，羅非魚的生產(chǎn)量穩(wěn)步增長(zhǎng)，并已成為領(lǐng)先出口的水產(chǎn)品之一。

據(jù)報(bào)道，羅非魚皮膠原蛋白占魚皮干重的70%，國(guó)內(nèi)外對(duì)于魚類膠原多肽進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)其具有良好的生物活性，如抗氧化活性[1]、降血壓活性[2]、抗腫瘤活性[3]以及免疫調(diào)節(jié)[4]等。此外，魚皮膠原蛋白活性肽與金屬離子如鐵、鋅、鈣等也有很好的螯合活性[5-7]。研究表明，蛋白酶將食品蛋白質(zhì)水解成肽段，其中有些具有廣泛的生理活性，但同時(shí)大量肽段沒有生物學(xué)活性，這些肽段經(jīng)過一定修飾后具有意想不到的活性[8]。選擇合適的蛋白酶水解這些多肽鏈，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，可制備出具有各種生理功能的生物活性肽。近年來隨著科學(xué)研究的深入，各種修飾生物活性肽不斷被發(fā)現(xiàn)。

本論文以羅非魚皮為研究對(duì)象，使用中性蛋白酶進(jìn)行水解，再將制備的羅非魚皮膠原蛋白肽（TSGP）亞鐵螯合修飾，然后對(duì)所得TSGP亞鐵螯合物進(jìn)行理化性質(zhì)及功能性質(zhì)分析，為TSGP亞鐵螯合物的分離、鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚皮 由昆明新海洋食品公司提供；中性蛋白酶（≥6萬活力單位） 購(gòu)買于杰能科國(guó)際公司；其他所用試劑 均為分析純。

AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SB5200D型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；KW 1000DC型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；HJ-2磁力加熱攪拌器 國(guó)華電器有限公司；TDL-40B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；真空冷凍干燥機(jī) 南京載智自動(dòng)化設(shè)備有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RF-5310PC熒光分光光度計(jì) 日本島津公司；TENSOR27-紅外光譜儀 德國(guó)布魯克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚皮膠原蛋白提取 熱水提取法[1]：魚皮解凍后，清洗干凈并瀝干，然后用7倍體積的0.2%氫氧化鈉溶液浸泡并不斷攪動(dòng)，40m in后用流動(dòng)水沖洗至中性；再用7倍體積的0.2%硫酸溶液浸泡并不斷攪動(dòng)，40min后用流動(dòng)水沖洗至中性；最后將魚皮加10倍蒸餾水勻漿，用45℃熱水恒溫提取12h，離心（5000r/m in，20m in）所得上清液即為膠原蛋白，冷凍干燥后備用。

1.2.2 TSGP的制備 用磷酸鹽緩沖液配制10mg/m L的膠原蛋白液，用中性蛋白酶進(jìn)行水解，酶解條件為pH 7，酶用量5%，溫度45℃，時(shí)間3h。酶解完成后，95℃滅酶15min，離心收集上清液，即得TSGP。濃縮、凍干后，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 TSGP亞鐵螯合物的制備 設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1。以亞鐵螯合率為指標(biāo)，通過極差分析，得出最佳工藝條件。

表1 TSGP亞鐵螯合物制備正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of TSGP iron-chelating orthogonal experiment

1.2.4 水解度（DH）的測(cè)定 根據(jù)趙新淮等的方法進(jìn)行測(cè)定[9]。

1.2.5 亞鐵螯合活性測(cè)定 參照Park等[10]的方法稍作修改，將樣品pH調(diào)至5.5，取3m L加入0.1m L 2mmol/L FeCl2·4H2O，5min后，再加入0.2m L 5mmol/L菲洛嗪（ferrozine），室溫下放置10m in，在562nm處測(cè)定吸光值。螯合率計(jì)算公式如下：

螯合率（%）=[（A0－（A1－A2））/A0]×100

其中A0：磷酸鹽緩沖液（pH 5.5）+FeCl2·4H2O+菲洛嗪；A1：樣品+FeCl2·4H2O+菲洛嗪；A2：樣品+FeCl2· 4H2O+水。

1.2.6 TSGP氨基酸組成及含量測(cè)定 采用高效液相色譜的方法測(cè)定。

1.2.7 TSGP亞鐵螯合物的定性檢測(cè) 定性檢測(cè)：Na2S法[11]。

1.2.8 組成成分測(cè)定 水分的測(cè)定：直接干燥法；多肽的測(cè)定：凱氏定氮法；鐵含量的測(cè)定：鄰菲羅琳比色法。

1.2.9 TSGP亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)表征

1.2.9.1 熒光光譜分析 所有實(shí)驗(yàn)均在常溫下進(jìn)行，5m in后，分別對(duì)樣品及樣品與FeCl2·4H2O的混合物，在激發(fā)波長(zhǎng)為289nm，發(fā)射波長(zhǎng)310～400nm范圍內(nèi)，每隔1nm進(jìn)行光譜掃描。時(shí)間光譜掃描中，激發(fā)波長(zhǎng)為289nm，發(fā)射波長(zhǎng)為371nm，每分鐘掃描一次。

1.2.9.2 紫外掃描分析 將TSGP以及TSGP亞鐵螯合物配成一定濃度的水溶液，在190～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

1.2.9.3 紅外光譜分析 TSGP和TSGP亞鐵螯合物干燥后，分別取適量固體樣品和少量干燥的溴化鉀放入瑪瑙研缽中，在紅外燈下充分研磨后，壓至透明薄片，用紅外光譜儀測(cè)定其400～4000nm的紅外圖譜。

1.2.10 抗氧化活性的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[1]測(cè)定1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基清除活性及羥自由基（·OH）清除活性[1]，根據(jù)文獻(xiàn)[12]測(cè)定2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除活性，根據(jù)文獻(xiàn)[13]測(cè)定血漿鐵還原能力（ferric reduction ability plasma assay，F(xiàn)RAP）[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠原蛋白提取

用凱式定氮法測(cè)得羅非魚皮中的蛋白質(zhì)含量為26.71%±0.26%。而經(jīng)熱水提取后的所得的膠原蛋白約占魚皮總重的18.19%，提取率達(dá)到了68.10%。

2.2 TSGP的制備

按照1.2.2所述的條件對(duì)魚皮膠原蛋白進(jìn)行水解，所得TSGP水解度為12.35%±0.07%。

對(duì)TSGP的氨基酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，其中Gly所占比例最大，TSGP氨基酸組成中，每1000個(gè)氨基酸殘基含脯氨酸為272.58個(gè)，符合膠原蛋白氨基酸的組成特點(diǎn)。

表2 TSGP氨基酸組成及含量分析Table 2 The analysis of TSGP amino acid composition and content

2.3 TSGP亞鐵螯合物的制備

通過前期TSGP亞鐵螯合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1]，選定螯合條件：m多肽∶mFeCl2·4H2O=400∶1，pH為6.0，反應(yīng)時(shí)間40min，溫度35℃。以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)TSGP亞鐵螯合物的制備進(jìn)行優(yōu)化。由表3分析可知，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響主次順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即pH對(duì)TSGH與亞鐵螯合的影響最大，其次是m多肽∶mFeCl2·4H2O，影響最小的是時(shí)間，最佳螯合條件為A3B2C3D2m多肽∶mFeCl2·4H2O= 500∶1，pH為6.0，反應(yīng)時(shí)間50m in，溫度35℃，利用上述螯合條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定3次，亞鐵螯合率達(dá)到99.00%。高于表3其他實(shí)驗(yàn)組別的螯合率。

肽的螯合活性與分子量、結(jié)構(gòu)、氨基酸組成以及立體結(jié)構(gòu)有關(guān)。TSGP的水解度為12.35%，因此，TSGP的平均分子量在890u左右[14]，適合金屬離子的螯合。研究表明，天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的羧基有利于肽與金屬離子結(jié)合，絲氨酸的羥基和巰基可能有助于鐵螯合作用，此外，絲氨酸的磷酸化可以為帶正的金屬如鐵，鈣和鋅創(chuàng)建合適的螯合位點(diǎn)[15]。TSGP中Asp，Glu和Ser含量相對(duì)較高，這可能是TSGP具有較高的亞鐵螯合活性的原因之一。

表3 TSGP亞鐵螯合正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The orthogonal test results of iron-TSGP chelating

2.4 TSGP亞鐵螯合物的表征

2.4.1 TSGP和TSGP亞鐵螯合物成分分析 由表4可知，在定性檢測(cè)TSGP亞鐵螯合的過程中，其各個(gè)步驟的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象符合多肽螯合物的定性檢測(cè)現(xiàn)象。所以可以確定本實(shí)驗(yàn)制備的產(chǎn)品是以多肽螯合物的形式存在的。

由表5可看出，制備的TSGP亞鐵螯合物中主要成分是多肽和鐵，二者質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為60.7%和10.24%，但是其中還有較多的鈉鹽的存在，這主要是由于酶解時(shí)使用磷酸鹽緩沖液配制膠原蛋白液及調(diào)節(jié)pH時(shí)加入的NaOH或HCI所致，在后續(xù)研究中可以通過透析、超濾等方法進(jìn)一步純化產(chǎn)品。

表5 TSGP和TSGP亞鐵螯合物成分分析Table 5 The componentanalysis of TSGP andiron-TSGP chelate

2.4.2 熒光光譜圖分析 TSGP和TSGP亞鐵螯合物的熒光光譜測(cè)定見圖1。圖1（a）顯示了在激發(fā)波長(zhǎng)289nm時(shí)，不同反應(yīng)時(shí)間的熒光發(fā)射光譜圖，從圖中可以看出，隨時(shí)間的變化，發(fā)射光譜有略微紅移的現(xiàn)象，由圖1（b）可以看出10m in之前熒光強(qiáng)度衰減明顯，10min之后的變化不明顯。在蛋白質(zhì)折疊/展開研究中，熒光強(qiáng)度下降是肽折疊的一個(gè)典型指標(biāo)。根據(jù)熒光動(dòng)力學(xué)（圖1b），肽折疊伴隨TSGP亞鐵螯合的全部過程。金屬離子是蛋白質(zhì)和多肽折疊的關(guān)鍵，尤其是對(duì)于短肽，其在水溶液中不具有熱力學(xué)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[5]。

圖1 TSGH亞鐵螯合熒光光譜圖Fig.1 The fluorescence emission spectra of the iron-TSGP chelating

2.4.3 紫外掃描分析 如圖2所示，TSGP和TSGP亞鐵螯合物最大紫外吸收峰對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)分別為213nm和205nm，最大吸收峰發(fā)生位移。螯合物的生成會(huì)使其配位體對(duì)光吸收性能發(fā)生改變，這是TSGP和鐵結(jié)合后相應(yīng)原子的價(jià)電子躍遷不同的反映，證明了它們之間發(fā)生了螯合反應(yīng)[7]。

2.4.4 紅外光譜分析 如圖3所示，對(duì)TSGP的紅外光譜（A），在特征區(qū)，—NH2的吸收峰在3448cm-1；在指紋區(qū)，C=O的吸收峰在1652cm-1，-COO-的吸收峰在1407cm-1。TSGP亞鐵螯合物紅外光譜圖（B），在特征區(qū)，—NH2的吸收峰移動(dòng)到了3413cm-1，發(fā)生了變化，說明螯合物中的—NH2鍵發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)；在指紋區(qū)，C=O的吸收峰紅移至1660cm-1，-COO-的吸收峰移至1402cm-1，可見，-COO-鍵也發(fā)生了的化學(xué)反應(yīng)，表明氨基和羧基均參與了亞鐵的螯合反應(yīng)。特別地，對(duì)于螯合物，在1100cm-1左右出現(xiàn)了的（PtNH2）單吸收峰變成雙吸收峰，也證明Fe2+與-NH2有較強(qiáng)結(jié)合。由紅外吸收峰的偏移或變化進(jìn)一步證實(shí)TSGP和Fe2+之間形成了螯合物[7]。

表4 TSGP亞鐵螯合物定性檢測(cè)結(jié)果Table 4 The qualitative test results of iron-TSGP chelate

圖2 TSGP和TSGP亞鐵螯合肽的紫外吸收曲線Fig.2 Ultravioletabsorption curve of TSGP and iron-TSGP chelate

圖3 TSGP和TSGP亞鐵螯合肽的紅外光譜對(duì)比分析Fig.3 Infrared spectrum analysis of TSGP and iron-TSGP chelate

2.4.5 抗氧化活性測(cè)定 由表6可以看出，除羥自由基清除活性外，螯合物DPPH自由基清除活性、ABTS+自由基清除活性、FRAP都明顯優(yōu)于TSGP，螯合物羥自由基清除活性較弱，可能是因?yàn)樵谶^渡金屬離子（Fe2+）存在的條件下，超氧陰離子和過氧化氫可以產(chǎn)生羥自由基，使得螯合物對(duì)羥自由基的清除活性弱于TSGP。

表6 TSGP和TSGP亞鐵螯合物抗氧化活性的比較Table 6 The comparison of antioxidantactivity of TSGP and iron-TSGP chelate

3 結(jié)論

通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出TSGP最佳螯合反應(yīng)條件為m多肽∶mFeCl2·4H2O=500∶1，pH為5.5，反應(yīng)時(shí)間50m in，溫度35℃。通過熒光光譜、紫外光譜和紅外光譜等手段對(duì)TSGP亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，證實(shí)Fe2+和TSGP的羧基與氨基均發(fā)生配位反應(yīng)，TSGP和Fe2+形成了螯合物。通過對(duì)TSGP亞鐵螯合物的抗氧化活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除羥自由基清除活性外，螯合物DPPH自由基清除活性、ABTS+自由基清除活性、FRAP都明顯優(yōu)于TSGP，說明TSGP亞鐵螯合物可作為一種潛在的抗氧化劑。

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Preparation，characterization and antioxidant activity of tilapia skin collagen polypeptides chelated iron

DUAN Xiu，YANG Cheng-tao，SUN Yun，SUN Li-ping*，ZHUANG Yong-liang
（Research Centre of Food Engineering，College of Chemistry and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

Tilap ia skin collagen polypep tides（TSGP）was p repared and chelated by iron.The physical，chem ical and functional p roperties of the chelate were characterized.The op timum parameters of chelating as follows：mpolypeptides∶mFeCl2·4H2O=500∶1，pH6.0，reaction time 50m in，temperature 35℃.The formation of iron-TSGP chelate was confirmed by the Ultraviolet spectrum and Infrared spectroscopy，and found that the carboxyl and am ino group of TSGP bounded w ith iron.In add ition，chelate had a strong radical scavenging activities of DPPH·and ABTS+·.

tilap ia skin；TSGP；chelate；structure；antioxidantactivity

TS201.1

A

1002-0306（2014）18-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.025

2013－11－07 *通訊聯(lián)系人

段秀（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101392）。