不同萃取方法對山楂汁香氣成分測定的影響

田甜甜，王積武，吳志蓮，王洋洋，牛 浩，趙玉平，*

（1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺264005；2.綠杰股份有限公司，山東龍口265718）

不同萃取方法對山楂汁香氣成分測定的影響

田甜甜1，王積武2，吳志蓮2，王洋洋1，牛 浩1，趙玉平1，*

（1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺264005；2.綠杰股份有限公司，山東龍口265718）

為研究不同的萃取方法對山楂汁香氣成分測定的影響，采用頂空固相微萃取（HS-SPME）和液液萃?。↙LX）對山楂汁中的香氣成分進(jìn)行富集，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）對其進(jìn)行定性和半定量分析。結(jié)果表明，HSSPME共檢測出21種香氣成分，主要是順-3-己烯醇、α-萜品醇、順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、苯甲醇和甲酸己酯等，其含量分別為79.4、68.1、60.4、60.1、49.9、33.2μg/L；LLX共檢測出20種香氣成分，主要是順-3-己烯醇、順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、丁子香酚、丙酮酸乙酯和檸檬酸，其含量分別67.9、63.4、57.4、51.4、34.5、30.3μg/L。通過比較分析可知，不同的方法因工作原理不同，得到的香氣成分不同且含量差異較大。

山楂汁，香氣成分，頂空固相微萃?。℉S-SPME），液液萃?。↙LX），氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）

山楂作為傳統(tǒng)的藥食兩用植物，其營養(yǎng)成分極其豐富，且含有黃酮類、酚酸類、有機(jī)酸和萜類等物質(zhì)[1]，具有降血脂、抗癌、抗衰老等功能[2-3]。香氣成分是構(gòu)成和影響果實(shí)及果汁質(zhì)量與典型性的主要因素[4]。雖然食品中香氣成分的含量非常低，但是這些物質(zhì)直接影響著人們的食欲，同時(shí)在飲料的生產(chǎn)調(diào)配過程中也有著重要影響。

國內(nèi)外有關(guān)山楂香氣成分的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少[5]。近年來，朱曉蘭等[6]采用連續(xù)液液萃取技術(shù)并結(jié)合GC-MS收集山楂中的揮發(fā)性物質(zhì)，認(rèn)為順-3-己烯醇和丁子香酚等是山楂香氣的代表性化合物；謝筆鈞等[7]采用蒸餾-萃取法收集山楂中的揮發(fā)性物質(zhì)，認(rèn)為順-3-己烯醇、順-3-乙酸己烯酯和α-萜品醇等是山楂汁香氣成分的代表。HS-SPME技術(shù)操作簡便、耗費(fèi)低、易于實(shí)現(xiàn)自動化，而LLX可以充分將樣品中的痕量物質(zhì)萃取出來。由于山楂汁中的香氣成分較為復(fù)雜，各種提取方法的原理不同，所得到的香氣物質(zhì)是否一致，差異是否顯著，目前尚無相關(guān)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用HS-SPME和LLX兩種萃取方法并結(jié)合GC-MS對山楂汁中香氣成分進(jìn)行定性和內(nèi)標(biāo)法定量分析，并對兩種不同的提取方法進(jìn)行對比研究，為進(jìn)一步完善山楂的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮山楂果 山東煙臺，市售，無腐爛，無病蟲害；果膠酶（10U/m L） RAPIDASE公司；NaCl上海國藥集團(tuán)，分析純；3-辛醇（內(nèi)標(biāo)） Sigma公司，色譜純；正十七烷（內(nèi)標(biāo)） 天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司，色譜純；C10～C25直鏈烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司，色譜純；二氯甲烷 天津化學(xué)試劑廠，分析純；無水硫酸鈉 青島市盛美化工有限公司，分析純。

GC-MS-2010 日本津島公司；DB-Wax型色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm） 美國Agilent公司；SPME萃取頭（50μm/30μm CAR/DVB/PDMS） 美國Supelco公司；微量進(jìn)樣器 上海安亭微量進(jìn)樣器廠；低速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；磁力攪拌器 龍口先科儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 選取1kg無腐爛的山楂，去梗后稱重并清洗干凈，按山楂和水質(zhì)量1∶1，煮至山楂開裂，停止加熱，制成果醬，冷卻至50℃時(shí)加入1m L果膠酶，混勻，酶解6h，然后以轉(zhuǎn)速4000r/m in離心20m in，取上清液，即為山楂汁[8]。

1.2.2 樣品預(yù)處理

1.2.2.1 頂空固相微萃取 取5.00m L山楂汁加入20m L的萃取瓶中，加入2.0g NaCl、1μL的內(nèi)標(biāo)3-辛醇和轉(zhuǎn)子，加蓋封口；置于50℃恒溫水浴中預(yù)平衡10min，將萃取頭插入樣品瓶中的頂空部分，吸附5m in后進(jìn)行GC-MS分析。樣品重復(fù)6次。

1.2.2.2 液液萃取 取5.00m L山楂汁加入100m L 100g/L食鹽水、100μL的內(nèi)標(biāo)正十七烷，充分?jǐn)噭蚝筠D(zhuǎn)移至預(yù)先在底部加入10m L二氯甲烷的萃取器后，再向燒瓶中加入40m L二氯甲烷，置于65℃恒溫水浴進(jìn)行加熱，連續(xù)萃取5h。取下裝置后，向二氯甲烷溶液中加入無水硫酸鈉固體，干燥后，濃縮至1m L，取1μL進(jìn)行GC-MS分析[6]。樣品重復(fù)6次。

1.2.3 GC-MS條件

1.2.3.1 GC條件 色譜柱：DB-Wax柱（30m×0.25mm× 0.25μm）；升溫程序：初始溫度40℃，保持2m in，然后以6℃/m in升溫至100℃，再以5℃/m in升溫至150℃，最后以10℃/min升溫至230℃，保持4min；溶劑延遲1m in；進(jìn)樣口溫度和檢測器溫度230℃；載氣（He）流速2m L/m in，壓力61.8kPa；采用不分流進(jìn)樣模式。

1.2.3.2 MS條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70eV；離子源溫度200℃；接口溫度230℃；掃描范圍：m/z 30～500。

1.3 香氣成分的鑒定

1.3.1 香氣成分的定性 將C10～C25的直鏈烷烴標(biāo)準(zhǔn)品單獨(dú)進(jìn)樣，進(jìn)行GC-MS分析，得到每一種烷烴的保留時(shí)間；根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]保留指數(shù)的計(jì)算公式，計(jì)算每一種組分的保留指數(shù)；與NIST Library工作站標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)、參照試劑公司提供的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對機(jī)檢結(jié)果進(jìn)行核對確認(rèn)以及相關(guān)的文獻(xiàn)資料[11，15，18，20]進(jìn)行比較，進(jìn)一步確定香氣成分。

1.3.2 香氣成分的定量 根據(jù)以下方法計(jì)算各組分含量[10-11]：

2 結(jié)果與討論

圖1為山楂汁經(jīng)過不同方法萃取后，在DB-Wax柱上通過GC-MS分析得到的總離子流圖。各組分質(zhì)譜經(jīng)NIST Library檢索并根據(jù)C10～C25直鏈烷烴標(biāo)準(zhǔn)品和資料分析共檢測出27種香氣成分及含量如表1所示。

所檢測的27種香氣成分中，酯類、萜烯類、芳香類、醇類、酸類、呋喃類和醛類構(gòu)成了山楂汁的主要的香氣成分。HS-SPME和LLX得到的組分幾乎相同，各有21和20種。每種方法所檢測到的香氣成分相似但又有所差別。就HS-SPME而言，順-3-己烯醇的含量最高，依次是α-萜品醇、順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯和苯甲醇等。這些組分的大量存在與文獻(xiàn)中的結(jié)果是相一致[7]；而LLX萃取到的組分中，順-3-己烯醇的含量最高，依次是順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、丁子香酚、丙酮酸乙酯和檸檬酸等。

圖1 不同方法萃取山楂汁香氣成分的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of differentextractionmethod on aroma components of hawthorn juice

2.1 酯類組分分析

由表1可以看出，使用HS-SPME共檢測出8種酯類物質(zhì)，主要包括順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、甲酸己酯、乙酸乙酯和己酸乙酯等；而使用LLX檢測出11種酯類物質(zhì)，順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、丙酮酸乙酯、己酸乙酯和檸檬酸三乙酯等，其中7種物質(zhì)是兩種方法都檢測到的且各物質(zhì)之間的含量差異較小。丙酮酸乙酯、肉桂酸乙酯、檸檬酸三乙酯和硬脂酸乙酯這4種物質(zhì)是LLX檢測到而HS-SPME沒有檢測到的。另外，HS-SPME檢測出乙酸乙酯，而LLX沒檢測出，這是因?yàn)長LX容易受到溶劑的干擾，低沸點(diǎn)的物質(zhì)如乙酸乙酯檢測不出[12]。

表1 山楂汁中各香氣成分及含量Table 1 Aroma components and its contents of hawthorn juice

乙酯類組分的合成由醇類和乙酰-CoA在醇酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下縮合而成的[13]。有研究發(fā)現(xiàn)順-乙酸-3-己烯酯的含量可以作為山楂成熟的標(biāo)志[7]，是主要的香氣成分之一。順-乙酸-3-己烯酯具有山楂汁特有的清香味，甲酸己酯具有蘋果或未成熟梅子香氣，己酸乙酯具有水果味和甜味，而順-丁酸-3-己烯酯具有清香或花香型香氣[11]。

2.2 萜烯類組分分析

本實(shí)驗(yàn)中使用HS-SPME共檢測出5種萜烯類物質(zhì)，包括α-萜品醇、4-松油醇、里那醇、香葉酮和紫羅蘭酮，其中α-萜品醇、4-松油醇和里那醇的含量非常高；而LLX只檢測到少量的紫羅蘭酮。

揮發(fā)性萜類物質(zhì)如α-萜品醇、4-松油醇和里那醇等物質(zhì)是由各種化學(xué)反應(yīng)和酶轉(zhuǎn)移反應(yīng)形成的[14]。α-萜品醇是酸解后產(chǎn)生的，有鳳梨香氣，4-松油醇具有泥土香氣和香辛料香氣，而里那醇賦予山楂汁強(qiáng)烈的花香并具有柑橘香氣[11，15]。紫羅蘭酮具有紫羅蘭的香氣，它是由檸檬醛與丙酮經(jīng)縮合、環(huán)化直接合成得到的[16]。

2.3 醇類組分分析

從表1中可以看出，使用HS-SPME和LLX都檢測出2種醇類物質(zhì)，包括順-3-己烯醇和反-3-己烯醇，且這兩種物質(zhì)的含量差異較大，順-3-己烯醇是含量最高的香氣成分，而反-3-己烯醇含量較少。

山楂中亞油酸和亞麻酸的含量較高，通過脂肪氧化酶的降解途徑，亞麻酸最終轉(zhuǎn)化為順-3-己烯醇，而順-3-己烯醇具有強(qiáng)烈的新鮮青草香味，而且擴(kuò)散力強(qiáng)，用于香精中，能產(chǎn)生滿意的新鮮香氣和自然感，并能掩蓋其他不良?xì)馕禰6]。

2.4 芳香類組分分析

根據(jù)表1所示，在山楂汁中共檢測到5種芳香類物質(zhì)，其中2種物質(zhì)是這兩種方法都檢測出的，分別為間二甲苯和鄰二甲苯，兩種物質(zhì)含量差異較小。苯甲醇和2，4-二叔丁基苯酚是HS-SPME檢測出的，2，4-二叔丁基苯酚有香草味，而含量較大的苯甲醇具有花香味。LLX檢測出具有強(qiáng)烈的丁香氣味的丁子香酚[17]，其含量非常高，HS-SPME沒有檢測出這一物質(zhì)。雖然有些物質(zhì)含量很低，但是各香氣成分間的相互作用對山楂汁香氣形成有重要作用，即可構(gòu)成該果汁的特征香氣成分，賦予山楂汁獨(dú)特的香氣風(fēng)味。

2.5 其他組分分析

根據(jù)表1可以看出，HS-SPME和LLX同時(shí)都檢測出1種醛和1種呋喃類物質(zhì)，分別為具有水果味的壬醛和燒烤味的糠醛[18]，且不同方法檢測出的各物質(zhì)的含量差異不是很明顯?？啡┦怯晌炀厶窃谒岬淖饔孟滤馍晌焯?，再由戊糖脫水環(huán)化而成。LLX中還檢測到檸檬酸，檸檬酸是山楂汁中重要的物質(zhì)[19]，酸類化合物的產(chǎn)生源于脂肪酸合成酶的合成以及脂質(zhì)β-氧化的降解。

3 結(jié)論

HS-SPME利用萃取頭直接頂空吸附樣品，吸附的物質(zhì)主要是低沸點(diǎn)的酯類、醇類、萜烯類和芳香類等，LLX萃取的物質(zhì)除了低沸點(diǎn)的酯類、醇類、芳香類外，還有高沸點(diǎn)的酸類和酯類等。HS-SPME和LLX分別檢測出21和20種香氣成分，其中酯類、醇類、芳香類和萜烯類是對香氣貢獻(xiàn)最大的四類組分。對于HS-SPME來說，順-3-己烯醇、α-萜品醇、順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、苯甲醇和甲酸己酯是主要香氣成分，其含量分別79.4、68.1、60.4、60.1、49.9、33.2μg/L；對于LLX，順-3-己烯醇、順-乙酸-3-己烯酯、順-丁酸-3-己烯酯、丁子香酚、丙酮酸乙酯和檸檬酸是主要香氣成分，其含量分別67.9、63.4、57.4、51.4、34.5、30.3μg/L。各香氣成分含量之間存在較大差異，但是各香氣成分間相互作用，共同賦予山楂汁獨(dú)特的香氣風(fēng)味。

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Effect of different extraction method on the identification of aromatic com ponents of haw thorn juice

TIAN Tian-tian1，WANG Ji-wu2，WU Zhi-lian2，WANG Yang-yang1，NIU Hao1，ZHAO Yu-ping1，*
（1.College of Life Science，YantaiUniversity，Yantai264005，China；2.LvJie Co.，Ltd.，Longkou 265718，China）

To study the effect of different extrac tion methods on the aromatic com ponents of haw thorn juice，headspace solid phase m icro-extraction（HS-SPME）and liquid-liquid extraction（LLX）coup led w ith gas chromatog raphy mass spectrometry（GC-MS）were developed and app lied for the qualitative and sem iquantitative characterization of aroma com ponents of haw thorn juice.The results showed that a total of 21 com pounds were identified by HS-SPME.（Z）-3-hexen-1-ol，α-terp ineol，（Z）-3-hexenyl acetate，（Z）-3-hexenyl butyrate，benzyl alcohol and hexyl formate were the main com ponents，and its contents were 79.4，68.1，60.4，60.1，49.9，33.2μg/L，respec tively.Compared w ith HS-SPME，6 main aroma components were found by LLX，such as（Z）-3-hexen-1-ol，（Z）-3-hexenyl acetate，（Z）-3-hexenyl butyrate，eugenol，ethyl pyruvate and citric acid，and its contents were 67.9，63.4，57.4，51.4，34.5，30.3μg/L，respectively.Nevertheless，based on different p rincip les，the contents of aroma components were obvious d ifferences in contents w ith differentmethods.

haw thorn juice；aroma com ponents；HS-SPME；LLX；GC-MS

TS201.1

A

1002-0306（2014）18-0153-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.024

2013－12－09 *通訊聯(lián)系人

田甜甜（1987-），女，碩士研究生，研究方向：蒸餾酒風(fēng)味分析。

山東省自然科學(xué)基金（ZR2011CM206）。