蜂巢提取液的成分鑒定及抗氧化功效測定

王振斌，邵淑萍，孫 平

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

蜂巢提取液的成分鑒定及抗氧化功效測定

王振斌，邵淑萍，孫 平

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

對蜂巢乙醇提取液和水提取液進行了成分鑒定和抗氧化活性的研究。通過對這兩種提取液進行GC-MS氣質分析，各鑒定出其中17種成分，對兩種提取液的總還原力、DPPH·清除率、ABTS+·清除率、超氧陰離子清除率、羥自由基清除率以及油脂抗氧化進行測定，結果表明蜂巢水提液和蜂巢乙醇提取液與化學合成抗氧劑BHT相比均具有較強的抗氧化活性，隨著各自濃度的增加，抗氧化活性隨之增強，當濃度增加到一定值，清除率趨于穩(wěn)定，而且蜂巢水提取液的抗氧化效果比乙醇提取液的好，表明蜂巢提取液是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑和自由基清除劑。

蜂巢，成分，抗氧化

蜂巢主要功能成分為黃酮類物質，具有抗氧化、增強免疫、抗炎、祛風鎮(zhèn)痛、抑菌殺蟲、降血脂、降血壓、抗腫瘤、治療鼻炎等多種生物功效[1]。我國是世界第一的養(yǎng)蜂大國，蜂巢資源豐富，然而利用率卻很低，目前主要用作蜂蠟的提取。

蜂巢中的蜂膠、蜂王漿等均是優(yōu)質的天然抗氧化產物，其中的黃酮、有機酸、維生素、多酚類化合物等均具有抗氧化活性及清除自由基的能力[2]。Yanishliev a N等以豬油作為脂系統(tǒng)模型，證實加入1%或5%的蜂膠可明顯抑制氧化作用[3]。張海生等利用超聲波輔助提取蜂蛹黃酮并研究得到提取液對超氧陰離子、羥基自由基、烷氧基和烷過氧基均有明顯的抑制作用，且均呈現(xiàn)一定的量效關系[4]。Nagai等研究表明蜂王漿清除超氧化物能力僅次于蜂膠，且溫度對抗氧化作用影響較小[5]。

本實驗在提取蜂巢抗氧化物質的基礎上，進行了蜂巢乙醇提取液和水提取液成分的測定，并進一步考察蜂巢乙醇提取液和水提取液的成分以及提取液體外抗氧化作用對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基和ABTS+自由基等的清除能力及抗氧化能力的影響，為今后深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1，1-二苯基-2-苦基-肼（三硝基苯肼）（DPPH）購自Sigma公司；沒食子酸標準品、蘆丁標準品、Folin-Ciocalteu試劑、7.5%Na2CO3溶液、無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉，冰乙酸、異辛烷、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、高硫酸鉀、鄰苯三酚、濃鹽酸、鄰菲羅啉 國藥集團化學試劑公司，均為分析純；福臨門非轉基因葵花籽油 江蘇鎮(zhèn)江大潤發(fā)超市。

UV-1601微量紫外分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；BS124S電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；HH-S2恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療器械廠。

1.2 蜂巢乙醇提取液和水提液的制備

蜂巢提取液的制備：在預實驗的基礎上，以溶劑（水、乙醇）和蜂巢粉末質量比30∶1、提取溫度40℃的條件下，提取40m in，反復提取三次，合并水提液，濃縮，使其固形物含量達到10%。

1.3 蜂巢提取液的成分鑒定

采用氣相色譜法測定其成分。GC：載氣為氦氣，流量1m L/m in，進樣量為1μL，阱溫：170℃，阱外套：45℃，傳輸線：260℃，進樣口：250℃，柱溫：50℃（保留3m in），以5℃/m in程序升溫至100℃（保留8m in），再以10℃/min程序升溫至150℃（保留10min），最后以15℃/m in程序升溫至260℃（保留7m in）。分流比：50∶1；MS：電子轟擊源，掃描范圍40～650（m/z），掃描速度0.2s掃全程。結合查閱的有關資料[6]，經過質譜解析鑒定，進而分析出樣品成分。

1.4 蜂巢提取液的抗氧化功效測定

1.4.1 還原力的測定 將樣品溶于去離子水，加入一定量的磷酸緩沖溶液（pH 6.6）和鐵氰化鉀溶液，50℃恒溫水浴20m in，急速冷卻后加入一定量的三氯乙酸，離心后取上清液加入氯化鐵溶液常溫反應5min后，用分光光度計讀取吸光度值[7-8]。

1.4.2 DPPH自由基清除能力的測定 參照R Amarowicza和Hatano T[9]的測定方法。按表1方法加樣，即取適量提取液樣品溶于1m L甲醇中，待完全溶解后加入0.1mol/L的DPPH自由基甲醇溶液3m L，搖勻后于室溫下避光反應30m in后于517nm比色。對照組以蒸餾水代替待測液作對比。樣品對DPPH自由基的清除能力用下式計算，3次平行求清除率的平均值。

式中，A0—DPPH·與溶劑混合液的吸光度；Ai—DPPH·與樣液反應后的吸光度；Aj—樣液與溶劑混合液的吸光度。

表1 試劑和樣液加樣表Table 1 Add amountof sample and DPPH·

以樣品質量濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，計算回歸方程及樣品的半抑制質量濃度（IC50）。

1.4.3 ABTS+自由基清除率的測定結果 參照Dorman H和Re R等[10-14]的測定方法。將7mmol/L的ABTS溶液與2.45mmol/L高硫酸鉀K2S2O8混合后室溫下避光反應16h，制備ABTS+自由基儲備液，室溫避光貯藏，備用。使用前用無水乙醇稀釋該ABTS+自由基儲備液，使其在734nm波長下吸光度為0.70±0.02，形成ABTS工作液。在30℃下，取3.0m L的ABTS工作液，并添加1m L適當濃度的蜂巢提取液，反應30min，在734nm波長下測定吸光度。每個濃度的樣品平行操作3次。按照式（2）計算樣品的ABTS+自由基的清除率。以樣品質量濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，計算樣品的ABTS+自由基清除率。

式中：A0—DPPH·與溶劑混合液的吸光，Ai—DPPH·與樣液反應后的吸光度，Aj—樣液與溶劑混合液的吸光度。

表2 試劑和樣液加樣表Table 2 Add amount of sample and DPPH·

1.4.4 超氧陰離子自由基（O2－·）清除率的測定 參考郭雪峰等方法進行測定[15-16]。量取pH為8.2的Tris-HCl緩沖液5m L，加入適量待測樣品溶液，用雙蒸水補充至9.7m L，置于10m L比色管中混勻，在25℃水浴條件下保溫20m in，取出后立即加入在25℃預熱過的3mmol/L鄰苯三酚0.3m L，劇烈振蕩以使其充分反應，9m in后于319nm波長處測定其吸光度值A。空白對照以10mmol/L HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液。

1.4.5 羥自由基（·OH）清除率的測定 精密量取3mmol/L FeSO41m L置10m L比色管中，加入3mmol/L鄰菲羅啉1m L和一定濃度的蜂巢提取液0.4m L，再加入4mmol/L的H2O2溶液0.5m L，最后加去離子水至4m L，反應于37℃恒溫水浴中進行，準確反應1.5h后，于536nm下測定吸光度值記為A1。按照上述方法，不添加FeSO4溶液、鄰菲羅啉指示劑和H2O2溶液的記為A2，不添加蜂巢提取液，記為A3，對照組不添加蜂巢提取液和H2O2溶液，記為A0，以蒸餾水為空白參比。按下式計算樣品對·OH的清除率[17]：

1.4.6 蜂巢提取液的油脂抗氧化研究 過氧化值（POV）的測定依據國標GB 5538-2005動植物油脂過氧化值測定方法的測定?？ㄗ延停洔y定其初始過氧化值為2.27mmol/kg。取15個250m L錐形瓶并各稱取100g葵花籽油，分為5組，每組做3個平行實驗。之后，將樣品放于70℃恒溫培養(yǎng)箱中加速氧化，每隔1d測其過氧化值變化。實驗期間，注意要把樣品攪拌均勻，并交換它們在恒溫箱的位置，保證樣品實驗條件充分一致，以減小實驗誤差[18-20]。

1.5 實驗數(shù)據的統(tǒng)計分析方法

通過Origin 7.5軟件統(tǒng)計分析方法來比較BHT、蜂巢水提液和蜂巢乙醇提取液的抗氧化活性以及對油脂的抑制作用。

2 結果與分析

2.1 蜂巢提取液的成分鑒定

蜂巢水提液和蜂巢乙醇提取液的成分鑒定結果如圖1、圖2、表3、表4所示。蜂巢水提液中共鑒定出17種化合物，其中主要有2-丁酮（2.66%）、2，3-丁二酮（16.17%）、3-甲基-丁醇（2.14%）、2-乙基-己醇（8.91%）、苯甲醛（0.70%）、3-蒈烯（0.66%）、2-乙酸苯酯（0.20%）、苯乙醇（0.10%）等。蜂巢乙醇提取液共鑒定出17種化合物，其中主要有環(huán)氧丙烯（11.74%）、2，2-二甲甲氧基丙烷（4.14%）、1，6-庚二烯-3，5-二酮（1.17%）、鄰苯二甲酸二乙酯（2.36%）、2-乙基-1，3-己二醇（0.65%）、N，N’-二甲基-1，2-乙二胺（0.78%）、十七烷酮（0.51%）、己二酸（18.77%）等。

圖1 蜂巢水提液的氣質圖譜Fig.1 The GC-MSof honeycomb water extractings

圖2 GC-MS法測定蜂巢乙醇提取液的氣質圖譜Fig.2 The GC-MSof honeycomb ethanol extracting

表3 GC-MS法測定蜂巢水提物中的揮發(fā)性成分Table 3 The components of honeycomb water extractings

表4 GC-MS法測定蜂巢乙醇提取液中揮發(fā)性成分Table 4 The 4 components of honeycomb ethanol extractings

2.2 還原能力測定結果

蜂巢乙醇提取液、蜂巢水提液和合成抗氧化劑二甲基羥基甲苯（BHT）的還原能力測定結果如圖3所示。由圖3可以看出，蜂巢乙醇提取液、蜂巢水提液和BHT均具有較高的還原力，其中BHT的還原力最強，其次是蜂巢水提液，蜂巢乙醇提取液的還原力較弱。雖然BHT的還原能力較強，但BHT為化學合成添加劑，一般食物中，國標規(guī)定最大使用量為0.2g/kg（約0.19mg/m L）（GB 2760-2011），過量添加會引起食品安全問題。蜂巢水提液還原力雖然較弱，但是其來源于天然產物，安全無毒性，可以通過提高添加濃度達到與BHT相同的還原力。

圖3 蜂巢提取液的還原能力Fig.3 Deoxidization capability of honeycomb extracts

2.3 DPPH自由基清除率的測定結果

蜂巢乙醇提取液、蜂巢水提液和BHT的DPPH自由基清除能力測定結果如圖4所示。由圖4可以看出，兩種蜂巢提取液對DPPH自由基有一定的清除能力，并且清除率與蜂巢提取液的質量濃度呈正相關性。隨著蜂巢提取液濃度的升高，它們對DPPH自由基的清除率也逐漸增大，在各質量濃度下BHT對DPPH自由基的清除率要明顯高于蜂巢水提液和蜂巢乙醇提取液。當濃度為4mg/m L時，BHT對DPPH自由基的清除率達到56.3%，而蜂巢水提液和蜂巢乙醇提取液的清除率僅為49.5%和45.7%。

圖4 不同濃度蜂巢提取液對DPPH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging rate of honeycomb extracts on DPPH free radicals

2.4 ABTS+自由基清除率的測定結果

蜂巢乙醇提取液、蜂巢水提液和BHT對清除ABTS+自由基清除能力測定結果如圖5所示。由圖5可以看出，BHT的ABTS自由基清除能力最強，能夠迅速的將ABTS+·氧化褪色，兩種蜂巢提取液對ABTS+·均具有清除能力，且清除率與濃度呈正相關。隨著蜂巢提取液濃度的升高，它們對ABTS+·的清除率逐漸增大，其中蜂巢水提物清除ABTS+·能力較強，當其質量濃度達到0.5mg/m L時，清除率達到97.3%，而乙醇提取液在濃度為0.5mg/m L時對ABTS+·的清除率僅為75.8%。

圖5 不同濃度蜂巢提取液對ABTS+·清除率Fig.5 Scavenging rates of honeycomb extracts against ABTS free radicals

2.5 超氧陰離子清除率的測定結果

蜂巢乙醇提取液、蜂巢水提液和BHT對超氧陰離子的清除作用結果如圖6所示。由圖6可以看出，隨著濃度的增加，超氧陰離子自由基的清除率均增大。BHT對超氧陰離子的清除作用最強。蜂巢乙醇提取液和蜂巢水提取液的超氧陰離子自由基的清除率基本相當。

圖6 蜂巢提取液對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.6 The scavenging effectof honeycomb extracts on superoxide anion free radical

2.6 羥自由基清除率的測定結果

蜂巢乙醇提取液、蜂巢水提液和BHT對羥自由基清除作用的測定結果如圖7所示。由圖7可以看出，不同蜂巢提取液對羥基自由基清除作用的能力不同，隨著濃度的增加清除活性都在升高。BHT對羥自由基清除作用最強，蜂巢水提液較強，蜂巢乙醇提取液對羥自由基清除作用最弱。

圖7 蜂巢提取液對羥自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effect of honeycomb on hydroxyl radical

2.7 對油脂過氧化的抑制作用

圖8 蜂巢提取液對抑制油脂過氧化值的作用Fig.8 The scavenging effectof honeycomb on oil peroxide

蜂巢提取液對油脂過氧化的作用結果如圖8所示。由圖8可以看出，添加了抗氧化劑BHT和蜂巢提取液的葵花籽油的POV值遠低于空白組，且呈緩慢平穩(wěn)的增長趨勢，這說明加入BHT和蜂巢提取液對油脂有很強的抗氧化作用，可以明顯減緩油脂氧化。相對于對照組來說，其他各組都有一定的抑制油脂氧化作用。在前期（1～6d），各組的過氧化值差別不大，呈緩慢增長趨勢；而到后期（6～12d），各組POV直線上升，增長快速，可見自由基反應快速。相對于BHT，蜂巢的提取液抗氧化效果要微弱一些，尤其是水提物，因為有很多物質難溶于油脂中，使得抗氧化效果差一些。乙醇提取液的效果最好，說明蜂巢提取液在抑制油脂氧化方面有一定作用。

3 結論

3.1 通過對蜂巢水提取液和乙醇提取液的氣質（GC-MS）分析，分別鑒定出17種物質。蜂巢提取液中的起抗氧化作用的成分主要是黃酮類物質、有機酸類以及醇類化合物。

3.2 對蜂巢水提液、蜂巢乙醇提取液的還原能力、清除DPPH自由基、清除ABTS+自由基、超氧陰離子清除作用、羥自由基清除作用等抗氧化活性指標進行了分析。結果表明，蜂巢水提取液的抗氧化活性比蜂巢乙醇提取液的效果好，且兩者的抗氧化活性均隨著濃度的增加而增大。蜂巢水提液和蜂巢乙醇提取液的抗氧化活性較強，且安全無毒，因此具有代替BHT的可能性。蜂巢提取液對油脂過氧化的結果表明，蜂巢水提液和蜂巢乙醇提取液均對油脂有很強的抗氧化作用，后者優(yōu)于前者，可以明顯減緩油脂氧化。

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Identification com pounds and antioxidant activities of honeycomb polyphenolextracts

WANG Zhen-bin，SHAO Shu-ping，SUN Ping
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

The compounds of aqueous extrac ts and ethanol extracts from honeycomb were identified and the antioxidant activity was studied.By GC-MS techniques，17 com pounds of two extrac ts were analysised respectively.And the totalantioxidant capacity，c learing DPPH·，OH·，ABTS+·and O2－·free radicalof two kinds of extracts were com pared，the results showed that aqueous extracts and ethanol extracts both had strong antioxidant activities，as well as synthetic chem ical antioxidants BHT，the antioxidant activities increased w ith polyphenol concentration，when the concentration of polyphenol reached a certain value，the c learing rate was almost constant and the aqueous extracts’s antioxidant ac tivities was better than ethanol extracts’，which suggested that the honeycomb polyphenol extracts was an excellent natural antioxidant and free rad icals scavenger.

honeycomb；com pound；antioxidantactivity

TS201.1

A

1002-0306（2014）18-0123-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.017

2013－12－03

王振斌（1975-），男，博士，副教授，研究方向：生物質能源工程，天然產物分離及應用。

國家星火計劃（2011GA690057）；鎮(zhèn)江市科技支撐項目（NY201010）。