豆甾二烯用于特級(jí)初榨橄欖油摻假檢測(cè)的研究

張 欣，楊瑞鈺，陳 迪，方曉明，*，丁卓平，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海市標(biāo)準(zhǔn)化研究院，上海200031；3.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135）

豆甾二烯用于特級(jí)初榨橄欖油摻假檢測(cè)的研究

張 欣1，楊瑞鈺2，陳 迪3，方曉明3，*，丁卓平1，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海市標(biāo)準(zhǔn)化研究院，上海200031；3.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135）

研究了利用豆甾二烯進(jìn)行特級(jí)初榨橄欖油的摻假檢測(cè)，考察了在特級(jí)初榨橄欖油中摻入不同比例油橄欖果渣油、榛子油、葵花籽油、大豆油、玉米油、花生油、米糠油、棕櫚油和核桃油，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定摻和油中的3，5-豆甾二烯含量。植物油樣品用石油醚溶解，過(guò)硅膠柱凈化，C30柱分離，乙腈/叔丁基甲醚（75∶25，V/V）作流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。結(jié)果表明，本方法具有良好的回收率及精密度，3，5-豆甾二烯是特級(jí)初榨橄欖油摻假鑒別的一個(gè)十分重要的特征性指標(biāo)，本方法能夠鑒別出了特級(jí)初榨橄欖油中摻入0.3%油橄欖果渣油、0.5%榛子油、2.1%葵花籽油、0.5%大豆油、0.3%玉米油、1.5%花生油、0.2%米糠油、0.6%棕櫚油和0.6%核桃油。

3，5-豆甾二烯，特級(jí)初榨橄欖油，高效液相色譜法，摻假

橄欖油是橄欖樹果實(shí)的汁液，是唯一從新鮮果子中提取的食用油，也是世界上唯一以自然狀態(tài)的形式供人類食用的木本植物油[1-2]。其中具有最高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的特級(jí)初榨橄欖油是市場(chǎng)上銷售的主要橄欖油品種。但隨著橄欖油日益受到人們的青睞，摻雜使假情景比比皆是。這些摻入的植物油脂不但便宜而且有些油脂用先進(jìn)的檢測(cè)手段也比較難發(fā)現(xiàn)。目前橄欖油的摻假鑒別以光譜法（如：熒光光譜法[3]，紅外光譜法[4-6]、拉曼光譜法[7]等）和色譜法為主。一般而言，光譜法需要化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法（如：主成分分析、聚類分析等）對(duì)譜圖進(jìn)行分析后才能得出結(jié)果。而色譜法通過(guò)分析橄欖油中特征性物質(zhì)組成和含量，來(lái)判斷特級(jí)初榨橄欖油是否摻入其他植物油。這些特征性物質(zhì)包括脂肪酸[8-9]、角鯊烯[10]、游離生育酚[11]、非蛋白質(zhì)氨基酸（鳥氨酸，異亮氨酸）[12]、蠟含量[13]、極性化合物[14]、揮發(fā)性物質(zhì)[15]等。鮮有報(bào)道以甾醇烯作為特征性指標(biāo)應(yīng)用于橄欖油摻假鑒別研究。甾醇烯類物質(zhì)是油在脫色、水蒸氣洗滌以及除臭等精煉過(guò)程中，油脂中的甾醇易發(fā)生脫水反應(yīng)，產(chǎn)生烯鍵，形成的具有共軛雙鍵的物質(zhì)[16-18]。在植物油精練過(guò)程中，以β-谷甾醇脫水產(chǎn)生的3，5-豆甾二烯含量最為豐富。本文研究了豆甾二烯用于特級(jí)初榨橄欖油摻假檢測(cè)，考察了特級(jí)初榨橄欖油中摻入不同比例其他植物油的摻合油后其3，5-豆甾二烯的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同品牌植物油 均來(lái)自上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，具體見表1；3，5-菜甾二烯和3，5-豆甾二烯混合溶液 挪威Chiron AS公司，100mg/L（19∶81，V/V），純度＞99.0%；石油醚、乙腈 色譜純；加拿大Caledon公司；正己烷 色譜純，美國(guó)J.T.Baker公司；叔丁基甲醚（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；無(wú)水硫酸鈉 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，于500℃烘4h以上，冷卻后儲(chǔ)存于干燥器中備用；硅膠60 德國(guó)Merck公司（0.063～0.200mm），于450℃烘5h以上，冷卻后加入2%水，混勻，轉(zhuǎn)移至廣口試劑瓶中，蓋塞備用；水 超純水。

2695型高效液相色譜儀、2487型紫外檢測(cè)器美國(guó)Waters公司；N-EVAP111型氮吹儀 美國(guó)Organomation公司；硅膠柱 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為帶活塞的砂芯玻璃層析柱（?10mm×250mm），加入30m L石油醚于柱中，加7.5g硅膠，靜置片刻，待硅膠沉積后，頂端再加0.5cm無(wú)水硫酸鈉，打開活塞，石油醚緩慢淋洗下來(lái)至高出頂端無(wú)水硫酸鈉約0.5mm，關(guān)閉活塞。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 用正己烷配制3，5-豆甾二烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用其稀釋至所需濃度，保存在-18℃條件下。

1.2.2 樣品處理 稱取植物油樣品1.0g（精確至0.01g）于燒杯中，加入5m L石油醚，混勻，倒入硅膠柱中，用5m L石油醚潤(rùn)洗燒杯2次，一并倒入柱中。當(dāng)石油醚液面與上端無(wú)水硫酸鈉層相切時(shí)，加入30m L石油醚，收集全部洗脫液至50m L收集管中，于45℃水浴中以氮?dú)獯抵粮?，用正己烷定容?.0m L，待測(cè)。若樣液濃度超出線性范圍，則稀釋一定倍數(shù)，使之在線性范圍內(nèi)。

1.2.3 液相色譜條件 C30色譜柱（250mm×4.6mm i.d，5μm，YMC公司），柱溫25℃；乙腈/叔丁基甲醚（75∶25，V/V）作流動(dòng)相等度洗脫，流速1.0m L/m in；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)235nm；進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法評(píng)價(jià)與有效性驗(yàn)證

為考察方法有效性，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。由于特級(jí)初榨橄欖油不含待測(cè)物或含量在本方法檢出限之下，故選擇其作為添加回收實(shí)驗(yàn)的樣品。樣品的添加水平分別為0.05、0.10、0.50mg/kg，每個(gè)水平重復(fù)8次，樣品回收率及精密度見表2。由表2可見，加標(biāo)樣品的平均回收率在96.3%～102.3%之間；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜4.6%（n=8）。結(jié)果表明，本方法對(duì)3，5-豆甾二烯的測(cè)定具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 各種植物油品牌及產(chǎn)地Table 1 Brand and origin of different kinds of vegetable oils

表2 添加樣品回收率及精密度（n=8）Table 2 The recovery and precision of spiked samples（n=8）

根據(jù)3倍和10倍信噪比（S/N）確定檢出限和測(cè)定低限，3，5-豆甾二烯的檢出限為0.015mg/kg，測(cè)定低限為0.05mg/kg。

3，5-豆甾二烯標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

圖1 3，5-豆甾二烯標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of stigmasta-3，5-diene

2.2 各種植物油3，5-豆甾二烯本底值的測(cè)定

取不同產(chǎn)地不同品牌植物油。其中，特級(jí)初榨橄欖油5個(gè)品種，油橄欖果渣油5個(gè)品種，榛子油3個(gè)品種，葵花籽油5個(gè)品種，大豆油3個(gè)品種，玉米油3個(gè)品種，花生油3個(gè)品種，米糠油3個(gè)品種，棕櫚油3個(gè)品種，核桃油3個(gè)品種，分別測(cè)定其3，5-豆甾二烯含量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所得結(jié)果見表3。由表3可見，不同種類植物油3，5-豆甾二烯含量相差較大，特級(jí)初榨橄欖油與其他種類植物油中3，5-豆甾二烯存在巨大差異。雖然我國(guó)GB23347-2009《橄欖油、油橄欖果渣油》中規(guī)定初榨橄欖油中3，5-豆甾二烯限量標(biāo)準(zhǔn)為≤0.15mg/kg，但其在特級(jí)初榨橄欖油中幾乎檢測(cè)不到。除特級(jí)初榨橄欖油，冷榨的葵花籽油和花生油以外，其他經(jīng)過(guò)熱處理生產(chǎn)的植物油3，5-豆甾二烯含量較高。油橄欖果渣油中雖然含有一定比例的特級(jí)初榨橄欖油，但其3，5-豆甾二烯含量較高。玉米油含有較高3，5-豆甾二烯，除了與加工方式相關(guān)外，其本身含有的大量植物甾醇也是其3，5-豆甾二烯含量高的原因。圖2為代表性樣品（特級(jí)初榨橄欖油、油橄欖果渣油、榛子油和葵花籽油）的3，5-豆甾二烯色譜圖。

2.3 3，5-豆甾二烯用于特級(jí)初榨橄欖油摻假的鑒別

本文分別考察了特級(jí)初榨橄欖油摻入油橄欖果渣油、榛子油、葵花籽油、大豆油、玉米油、花生油、米糠油、棕櫚油和核桃油的混合油中3，5-豆甾二烯含量。根據(jù)GB23347-2009中對(duì)初榨橄欖油3，5-豆甾二烯的限量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合表3測(cè)得的各植物油中的3，5-豆甾二烯含量，對(duì)特級(jí)初榨橄欖油摻入各種植物油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行估算，設(shè)定特級(jí)初榨橄欖油中摻入油橄欖果渣油、榛子油、大豆油、玉米油、棕櫚油和核桃油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.25%、0.3%、0.5%和1%；摻入葵花籽油和花生油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、5%和10%；摻入米糠油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%。以特級(jí)初榨橄欖油中摻入植物油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，3，5-豆甾二烯含量為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，所得各回歸方程見表4。由表可見，r2均大于0.99，說(shuō)明該測(cè)定方法十分可靠，隨不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加，3，5-豆甾二烯含量均呈良好線性，被測(cè)物質(zhì)無(wú)其他雜質(zhì)干擾。將限量標(biāo)準(zhǔn)0.15mg/kg代入回歸方程得出各油脂摻入特級(jí)初榨橄欖油的最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。本方法能夠鑒別出特級(jí)初榨橄欖油中摻入了0.3%油橄欖果渣油、0.5%榛子油、2.1%葵花籽油、0.5%大豆油、0.3%玉米油、1.5%花生油、0.2%米糠油、0.6%棕櫚油和0.6%核桃油。相比其他用于特級(jí)初榨橄欖油摻假鑒別指標(biāo)[8，11-12，14-15]，利用3，5-豆甾二烯含量進(jìn)行檢測(cè)更為靈敏，摻入植物油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢出限更低。

圖2 代表性樣品3，5-豆甾二烯色譜圖Fig.2 Stigmasta-3，5-diene chromatograms of representative samples

表3 各種植物油樣品中3，5-豆甾二烯測(cè)定結(jié)果Table 3 Stigmasta-3，5-diene content in vegetable oils

表4 摻入量回歸方程Table 4 Regression equation of admixture amount

2.4 實(shí)際應(yīng)用

圖3為某執(zhí)法部門查獲的摻假的特級(jí)初榨橄欖油豆甾二烯色譜圖，檢出其3，5-豆甾二烯含量為16.38mg/kg，遠(yuǎn)高于初榨橄欖油3，5-豆甾二烯≤0.15mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)，再一次印證了這一指標(biāo)的特征性和有效性，可以用于日常特級(jí)初榨橄欖油摻假鑒別中。

圖3 摻假特級(jí)初榨橄欖油色譜圖Fig.3 Chromatogram of adulterated extra virgin olive oil

3 結(jié)論

本文利用高效液相色譜技術(shù)對(duì)植物油中3，5-豆甾二烯含量分析方法的準(zhǔn)確性和精確度進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)證明該方法回收率高，重復(fù)性好。3，5-豆甾二烯是特級(jí)初榨橄欖油摻假鑒別的重要指標(biāo)，該指標(biāo)準(zhǔn)確、靈敏、可靠，能夠鑒別出特級(jí)初榨橄欖油中摻入了0.3%油橄欖果渣油、0.5%榛子油、2.1%葵花籽油、0.5%大豆油、0.3%玉米油、1.5%花生油、0.2%米糠油、0.6%棕櫚油和0.6%核桃油。

[1]段軍義.橄欖油的價(jià)值與利用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2009（4）：30-31.

[2]李勇.橄欖油——食用油中的多面手[J].中國(guó)食品，2011（20）：74-75.

[3]Poulli K I，Mousdis G A，Georgiou C A.Rapid synchronous fluorescence method for virgin olive oil adulteration assessment [J].Food Chemistry，2007，105（1）：369-375.

[4]Maggio R M，Cerretani L，Chiavaro E，et al.A novel chemometric strategy for the estimation of extra virgin olive oil adulteration with edible oils[J].Food Control，2010，21（6）：890-895.

[5]Lerma-garci M J，Ramis-ramos G，Herrero-martinez JM，et al.Authentication of extra virgin olive oils by Fourier-transform infrared spectroscopy[J].Food Chemistry，2010，118（1）：78-83.

[6]王傳現(xiàn)，褚慶華，倪昕路.近紅外光譜法用于橄欖油的快速無(wú)損鑒別[J].食品科學(xué)，2010，31（24）：402-404.

[7]Baeten V，Meurens M，Morales M T，et al.Detection of virgin olive oil adulteration by fourier transform raman spectroscopy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44（8）：2225-2230.

[8]Dourtoglou VG，Dourtoglou T，Antonopoulos A，etal.Detection of olive oil adulteration using principal component analysis applied on total and regio FA content[J].Journal of the American Oil Chemists’Society，2003，80（3）：203-208.

[9]Hajmahmoodi M，Vander H Y，Sadeghi N，et al.Gaschromatographic fatty-acid fingerprints and partial least squares modeling as a basis for the simultaneous determination of edible oilmixtures[J].Talanta，2005，66：1108-1116.

[10]張青齡.橄欖油中角鯊烯含量的氣相色譜/質(zhì)譜法分析[J].福建分析測(cè)試，2011，20（3）：1-4.

[11]Chen H L，AngiuliM，F(xiàn)errari C，et al.Tocopherol speciation as first screening for the assessment of extra virgin olive oil quality by reversed-phase high-performance liquid chromatography/fluorescence detector[J].Food Chemistry，2011，125（4）：1423-1429.

[12]Laura S H，Marina M L，Crego A L.A capillaryelectrophoresis-tandem mass spectrometry methodology for the determination of non-protein amino acids in vegetable oils as novelmarkers for the detection of adulterations in olive oils[J]. Journal of Chromatography A，2011，1218（30）：4944-4951.

[13]張蕊，薛雅琳，趙會(huì)義.蠟含量法鑒別初榨橄欖油的方法研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26（8）：119-122.

[14]Caponio F，Summo C，Bilancia M T，et al.High performance size-exclusion chromatography analysis of polar compounds applied to refined，mild deodorized，extra virgin olive oils and their blends：An approach to their differentiation[J].LWT-Food Science and Technology，2011，44（8）：1726-1730.

[15]Sylwia M S，Jelen H H.The potential of different techniques for volatile compounds analysis coupled with PCA for the detection of the adulteration of olive oilwith hazelnutoil[J].Food Chemistry，2008，110（3）：751-761.

[16]Crews C，Calvet-Sarrett R，Brereton P.The analysis of sterol degradation products to detect vegetable fats in chocolate[J]. Journal of the American Oil Chemists’Society，1997，74（10）：1273-1280.

[17]Kochhar S P.Influence of processing on sterols of edible vegetable oils[J].Progress in Lipid Research，1983，22：161-188.

[18]DobarganesM C，Cert A，Dieffenbacher A.The determination of stigmastadienes in vegetable oils[J].Pure and Applied Chemistry，1999，71（2）：349-359.

Study on stigmastadienes used for extra virgin olive oil adulteration detection

ZHANG Xin1，YANG Rui-yu2，CHEN Di3，F(xiàn)ANG Xiao-m ing3，*，DING Zhuo-ping1，*
（1.College of Food Science&Technology，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China；2.Shanghai Institute of Standardization，Shanghai200031，China；3.Shanghai Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai200135，China）

The stigmastad ienes used for extra virgin olive oiladulteration detection was investigated.Stigmasta-3，5-d iene content of the extra virgin olive oilb lended w ith d ifferent p roportion of olive pomace oil，hazelnut oil，sunflower oil，soybean oil，corn oil，peanut oil，rice b ran oil，palm oil and walnut oil were detected by highperformance liquid chromatography（HPLC）.Vegetab le oil samp les were dissolved w ith petroleum ether，c leaned up with a silica gel column，separated w ith C30column and determ ined by ultraviolet detection at 235nm.Acetonitrile/tert-butylmethyl ether（75∶25，V/V）was served as mobile phase in isocratic elution.The results showed that the method had good recovery and p recision，and stigmasta-3，5-d iene was an im portant characteristic index which could be used for extra virgin olive oil adulteration detection.The p roposed method could reliab ly identify extra virgin olive oilb lended w ith 0.3%olive pomace oil，0.5%hazelnutoil，2.1%sunflower oil，0.5%soybean oil，0.3%corn oil，1.5%peanut oil，0.2%rice b ran oil，0.6%palm oil and 0.6%walnut oil，respectively.

stigmasta-3，5-d iene；extra virgin olive oil；high performance liquid chromatog raphy（HPLC）；adulteration

TS207.3

A

1002-0306（2014）18-0080-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.008

2013－10－10 *通訊聯(lián)系人

張欣（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品安全分析。

國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目（2012IK184）；上海市技術(shù)性貿(mào)易措施應(yīng)對(duì)專項(xiàng)項(xiàng)目（12TBT010）。