比色法測(cè)定原料肉新鮮度方法的建立

胡亞云，李志成，，*，梁 娜，岳田利，白連社，李 猛，黃雪隔

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)博士后流動(dòng)站，陜西楊凌712100；2.合肥美菱股份有限公司博士后工作站，安徽合肥230601）

比色法測(cè)定原料肉新鮮度方法的建立

胡亞云1，李志成1，2，*，梁 娜1，岳田利1，白連社2，李 猛2，黃雪隔1

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)博士后流動(dòng)站，陜西楊凌712100；2.合肥美菱股份有限公司博士后工作站，安徽合肥230601）

總揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值是國家標(biāo)準(zhǔn)中用于評(píng)價(jià)肉質(zhì)鮮度的唯一理化指標(biāo)。以對(duì)二甲氨基苯甲醛（PDAB）為顯色劑，研究原料肉中TVB-N含量與吸光度的關(guān)系。結(jié)果表明，1mL的肉浸汁中加入1.8%（W/V）PDAB顯色劑4.5mL，濃鹽酸1.2mL，蒸餾水3.3mL，于80℃水浴中加熱8min，在446nm處測(cè)定其吸光度，一定范圍內(nèi)吸光度與TVB-N的含量成線性關(guān)系，因此建立了比色法測(cè)定原料肉新鮮度的方法。利用PDAB比色法檢測(cè)原料肉的新鮮度，具有較高的精確度和回收率，而且快速、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單，可作為國家標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定原料肉新鮮度的替代方法之一。

原料肉，總揮發(fā)性鹽基氮，對(duì)二甲氨基苯甲醛，比色，方法

肉類產(chǎn)業(yè)是農(nóng)業(yè)的重要組成部分，肉類工程是重要的菜籃子工程，與人民的生活息息相關(guān)。隨著人們生活質(zhì)量的提高，消費(fèi)者對(duì)肉的品質(zhì)衛(wèi)生要求不斷提高，如何準(zhǔn)確、快速地評(píng)定肉品的新鮮度不但是肉類企業(yè)和政府質(zhì)量安全監(jiān)管人員的迫切需求，也關(guān)系著廣大消費(fèi)者的身體健康[1]。目前我國對(duì)肉品新鮮度的評(píng)定主要采用感官指標(biāo)（色澤、黏度、彈性、氣味等）與理化標(biāo)準(zhǔn)相結(jié)合的方法[2-4]。感官方法主觀性強(qiáng)，不易量化；理化指標(biāo)中pH和水分的測(cè)定[5-6]不能確定肉品的新鮮度，只有總揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測(cè)定是國標(biāo)現(xiàn)行檢測(cè)方法[7-8]。國標(biāo)定量方法中的半微量定氮法和微量擴(kuò)散法[9-10]都存在操作要求條件高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，尤其最常用的半微量定氮法，蒸餾時(shí)間的長短、蒸汽通入量的大小、反應(yīng)的強(qiáng)弱、反應(yīng)終點(diǎn)的判定均對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大影響，不能達(dá)到快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的目的，而且誤差較大[8，11]。國內(nèi)外也有用近紅外法和比色法測(cè)定TVB-N的報(bào)道[12-14]，但近紅外法設(shè)備投入較高，比色法氯化對(duì)硝基重氮苯法[11]試劑配制較困難，且測(cè)定結(jié)果誤差較大，乙酰丙酮-甲醛法測(cè)定前要煮沸15m in，條件劇烈，總體測(cè)定時(shí)間較長，最主要的是這兩種比色方法并沒有建立起吸光度與肉浸汁揮發(fā)性鹽基氮之間的關(guān)系式，現(xiàn)實(shí)中無法應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)參照尿素的測(cè)定方法[15]，以對(duì)二甲氨基苯甲醛（PDAB）為顯色劑，研究原料肉中TVB-N值與吸光度的關(guān)系，探索比色法測(cè)定原料肉新鮮度的方法，為市場(chǎng)提供快速、準(zhǔn)確、批量檢測(cè)原料肉新鮮度的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉 購于楊凌農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，濃鹽酸、無水硫酸鈉、氧化鎂、硼酸、無水乙醇、甲基橙、亞甲基藍(lán)、甲基紅、對(duì)二甲氨基苯甲醛（PDAB） 均為國產(chǎn)分析純。

UV-1700雙光束紫外光分光光度計(jì)、UV-1240雙光束紫外光分光光度計(jì) 日本島津；ESJ60-4電子天平 0.0001g，上海九頂稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；SB-5200T超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；101-AB電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品肉預(yù)處理 取3個(gè)不同新鮮度的切碎、混勻的豬肉樣品，1號(hào)新鮮豬肉，2號(hào)為1號(hào)常溫放置48h的不新鮮豬肉，稍有腐敗氣味，3號(hào)為1號(hào)常溫放置7d的腐敗豬肉，各30.00g，分別放入盛有300m L無氨蒸餾水中的三角瓶中（下同）400r/min振蕩浸提5min，濾紙過濾，濾液加簽標(biāo)號(hào)1、2、3，置于4℃和-20℃待用。1.2.2 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量的測(cè)定 按照國標(biāo)GB/T 5009.44-2003執(zhí)行[8]。實(shí)際測(cè)定1、2、3號(hào)豬肉樣品的TVB-N值分別為5.76、15.17、41.13mg/100g。其中2號(hào)肉浸汁設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)肉浸汁。

1.2.3 PDAB比色法最大吸收波長的確定 取2個(gè)10m L的容量瓶，于樣品瓶中依次加入1m L標(biāo)準(zhǔn)肉浸汁，4m L PDAB顯色劑，2m L濃鹽酸，用蒸餾水定容到10m L，空白瓶用1m L蒸餾水取代樣品瓶中的肉浸汁，用1.0cm比色皿比色，用蒸餾水調(diào)零，然后在波長440～460nm，間隔2nm，測(cè)定樣品瓶和空白瓶的吸光度。

1.2.4 顯色劑濃度的確定 準(zhǔn)確稱取5.00g PDAB粉末于小燒杯中，先用少量無水乙醇溶解，再轉(zhuǎn)入25m L容量瓶中，用無水乙醇定容，配制成濃度為20%的顯色劑。精密移取20%的顯色劑0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5m L置于8個(gè)10m L容量瓶中，用無水乙醇定容，配制成濃度分別為1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3.0%的顯色劑，濃度由低到高加簽標(biāo)示1～8號(hào)。

取16個(gè)10m L的容量瓶，加簽標(biāo)示樣品瓶1～8號(hào)和空白瓶9～16號(hào)，在樣品瓶中均加入1.0m L標(biāo)準(zhǔn)肉浸汁，在空白瓶中均加入1.0m L的蒸餾水，然后按1～8的編號(hào)次序?qū)?yīng)加入樣品瓶1～8號(hào)和空白瓶9～16號(hào)已配制好的不同濃度的顯色劑各4m L、濃鹽酸各2m L，最后用蒸餾水定容，配制成不同PDAB用量梯度的樣品比色液和空白比色液。使用1cm比色皿，于波長440～460nm，間隔2nm，測(cè)定樣品瓶和空白瓶的吸光度。

1.2.5 顯色劑用量的確定 取10個(gè)10m L的容量瓶，分別加入1m L肉浸汁，再依次加入配制好的顯色劑1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、 6.00m L，加入2m L濃鹽酸，蒸餾水定容。然后在波長446nm處測(cè)得吸光度，同時(shí)用蒸餾水代替肉浸汁分別做空白對(duì)照。

1.2.6 濃鹽酸用量的確定 取9個(gè)10m L的容量瓶，分別加入1m L肉浸汁，再各加入4.5m L配制好的顯色劑。然后往1～9號(hào)試管中依次加入0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80m L濃鹽酸，蒸餾水定容，在波長446nm處測(cè)得吸光度。同時(shí)用蒸餾水代替肉浸汁分別做空白對(duì)照，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.7 顯色時(shí)間和穩(wěn)定性的確定 取1m L標(biāo)準(zhǔn)肉浸汁于10m L容量瓶中，加入4.5m L顯色劑，1.2m L濃鹽酸，蒸餾水定容，80℃水浴加熱2、3、4、5、6、7、8、9、10m in，冷卻后分別于室溫下放置15、30、45、60m in，測(cè)定其在446nm處的吸光度，同時(shí)用蒸餾水代替肉浸汁做空白實(shí)驗(yàn)，確定反應(yīng)時(shí)間及樣液的穩(wěn)定時(shí)間。

1.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取8個(gè)10m L的容量瓶，分別加入標(biāo)準(zhǔn)肉浸汁（TVB-N值15.17mg/100g）0.00、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.5m L（分別相當(dāng)于0.00、0.30、0.91、1.52、2.12、2.73、3.33、3.79mg/100g的揮發(fā)性鹽基氮，國標(biāo)蒸餾法測(cè)得），再各加入4.5m L配制好的顯色劑，然后各自緩慢加入濃鹽酸溶液1.2m L，蒸餾水定容到10m L，最后在80℃水浴加熱8m in，冷卻至室溫后在446nm處測(cè)定吸光度，以第一管做空白對(duì)照，以揮發(fā)性鹽基氮含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 精密度實(shí)驗(yàn) 取肉浸汁10m L，用國標(biāo)蒸餾法測(cè)得其揮發(fā)性鹽基氮含量為11.85mg/100g，按2.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件和方法，測(cè)定吸光度，做6個(gè)平行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性鹽基氮的含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.10 加標(biāo)回收率及準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 取已知TVB-N含量分別為11.85mg/100g和25.78mg/100g肉浸汁各50m L（相當(dāng)于5g豬肉），分別加入TVB-N含量為15.17mg/100g肉浸汁50m L，混勻，其TVB-N含量分別為13.51mg/100g和20.48mg/100g，分別取1m L加標(biāo)混合肉浸汁于10m L容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的條件和方法測(cè)定各自的吸光度，同時(shí)用等量蒸餾水代替肉浸汁做空白對(duì)照，然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性鹽基氮的含量，并分別與實(shí)際濃度作比較，平行測(cè)定6次。計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)誤差。

加標(biāo)回收率（%）=測(cè)定濃度（mg/100g）/實(shí)際濃度（mg/100g）×100

1.2.11 實(shí)際樣品的測(cè)定 取A、B、C三個(gè)未知新鮮度的豬肉浸汁濾液，分別按照本文建立的比色法和國標(biāo)蒸餾法測(cè)定其揮發(fā)性鹽基氮含量，計(jì)算其相對(duì)誤差。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)以上平行，采用DPS 7.55和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、制作圖表。所得結(jié)果多以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDAB比色條件的確定

2.1.1 PDAB比色法吸收波長的確定 由圖1可以看出在波長為446nm時(shí)，樣品吸光度與空白吸光度的差值最大。按照在試劑空白影響盡量低的情況下，盡可能選擇較大樣品吸光值的原則，PDAB比色法的最佳波長應(yīng)該為446nm。因此，選擇446nm作為PDAB比色法測(cè)定TVB-N的最佳波長。

圖1 最佳波長的確定Fig.1 The choice of optimalwavelengths

2.1.2 顯色劑濃度的確定 由圖2可知，當(dāng)顯色劑濃度為1.8%時(shí)，樣品吸光度與空白吸光度的差值最大，按照在試劑空白影響盡量低的情況下，盡可能選擇較大樣品吸光值的原則，選擇PDAB顯色劑最佳濃度為1.8%（W/V）。

圖2 顯色劑濃度的確定Fig.2 The concentration choice of chromogenic reagent

2.1.3 顯色劑用量的確定 由圖3可知，在肉浸汁和濃鹽酸用量不變的情況下，隨著PDAB顯色劑用量（1.8%，W/V）的增加，在相當(dāng)寬的范圍內(nèi)，樣品吸光度幾乎呈線形增加。當(dāng)加入4.5m L顯色劑時(shí)，吸光度達(dá)到最大，繼續(xù)加大顯色劑用量，變化幅度很小。因此選擇PDAB顯色劑最佳用量為4.5m L。

圖3 顯色劑用量對(duì)樣品吸光度的影響Fig.3 The effectofaddition of chromogenic agenton absorbance

2.1.4 濃鹽酸用量的確定 由圖4可知，在樣品液和顯色劑加入量一致的情況下，隨著溶液酸度的增加，溶液吸光度增大，當(dāng)濃鹽酸的加入量達(dá)到1.2m L時(shí)，溶液吸光度最大，繼續(xù)增大鹽酸用量，吸光度下降且會(huì)產(chǎn)生白色沉淀。因此，濃鹽酸的適宜加入量為1.2m L。

圖4 鹽酸用量對(duì)吸光度的影響Fig.4 The effectof addition of HCl on absorbance

2.1.5 顯色時(shí)間和穩(wěn)定性的確定 由圖5可知，反應(yīng)時(shí)間2～7m in時(shí)吸光值幾乎呈直線下降，7m in時(shí)趨于穩(wěn)定，8～60min吸光度均很穩(wěn)定，因此適合的顯色時(shí)間為8m in，穩(wěn)定時(shí)間可達(dá)60m in。

圖5 顯色和穩(wěn)定時(shí)間的對(duì)吸光度的影響Fig.5 The effectof chromogenic and setting time on absorbance

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由圖6可知，揮發(fā)性鹽基氮含量與吸光度成良好線性關(guān)系，線性方程為：y=9.2979x+0.2123，R2= 0.9915。

圖6 吸光度與揮發(fā)性鹽基氮含量關(guān)系Fig.6 The standard curvewhich shows the relationship between the absorbance and TVB-N content

樣液TVB-N含量在0.2～4.0mg/100g均保持良好的線性關(guān)系。由于樣品測(cè)定時(shí)稀釋了10倍，因此，樣品的TVB-N含量y=10×（9.2979x+0.2123）。

按照分光光度法的要求，以吸光度為0.002時(shí)的濃度為極限，實(shí)驗(yàn)得出揮發(fā)性鹽基氮含量最低檢測(cè)限為2.31mg/100g。不同批次的原料肉最好用該批原料肉做標(biāo)準(zhǔn)肉浸汁建立吸光度與TVB-N之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，這樣誤差較小。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

豬肉樣品（TVB-N=11.85mg/100g）平行測(cè)定6次的結(jié)果，不論是以吸光度還是換算為TVB-N的值，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%（表1），說明比色法測(cè)定豬肉揮發(fā)性鹽基氮的方法精密度高，可靠性好，是測(cè)定肉品新鮮度的好方法。

表1 比色法測(cè)定揮發(fā)性鹽基氮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 The relative standard deviation of colorimetric determination of TVB-N

2.4 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確度是測(cè)定值或測(cè)定平均值與真值之間的接近程度，用誤差或相對(duì)誤差來表征。從表2可以看出，樣品總相對(duì)誤差小于5%，說明用比色法測(cè)定原料肉的TVB-N結(jié)果準(zhǔn)確度較高。從表2還可以看出，樣品加標(biāo)回收率在94.50%～104.91%之間，輔助說明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，測(cè)定方法可行。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定與驗(yàn)證

按照本文建立的方法測(cè)定3個(gè)未知豬肉樣品A、B、C的吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=10×（9.2979x+0.2123），R2=0.9915計(jì)算3個(gè)樣品液中揮發(fā)性鹽基氮含量。再按國標(biāo)蒸餾法測(cè)定該3個(gè)樣品的揮發(fā)性鹽基氮含量，測(cè)得結(jié)果見表3。由表3得知，與用蒸餾法測(cè)定的結(jié)果相比較，比色法測(cè)定TVB-N的值的相對(duì)誤差小于5%，標(biāo)準(zhǔn)偏差遠(yuǎn)小于蒸餾法。而國標(biāo)蒸餾法要經(jīng)過蒸餾裝置安裝，通蒸汽蒸餾、餾分收集、配制混合指示劑、滴定等繁瑣步驟，單獨(dú)測(cè)定一個(gè)樣品需要1h以上，而且測(cè)定結(jié)果誤差較大。因此，用比色法測(cè)定肉中揮發(fā)性鹽基氮的含量準(zhǔn)確度高、方便、省時(shí)，每個(gè)樣總共需不到30m in，批量檢測(cè)所需時(shí)間更少，可用于原料肉新鮮度的快速測(cè)定，可以作為國標(biāo)蒸餾法的替代方法之一。

表3 三個(gè)豬肉樣品TVB-N含量的測(cè)定與驗(yàn)證Table 3 Determination and verification of TVB-N of three beef samples

3 結(jié)論

建立了比色法測(cè)定原料肉新鮮度的方法。1m L的肉浸汁中加入1.8%（W/V）PDAB顯色劑4.5m L，濃鹽酸1.2m L，蒸餾水補(bǔ)足至10m L，于80℃水浴中加熱8m in，在446nm處測(cè)定其吸光度，吸光度與TVB-N的含量在一定范圍成線性關(guān)系。利用PDAB比色法檢測(cè)原料肉的新鮮度，具有較高的精確度和準(zhǔn)確度，而且快速、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單，可以作為國家標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定原料肉新鮮度的替代方法之一。

本文雖然以豬肉為樣品，建立了比色法測(cè)定原料肉新鮮度的方法，以同樣的方法還成功建立了比色測(cè)定牛肉新鮮度的方法，推斷以所測(cè)定畜禽肉種類的肉浸汁為標(biāo)準(zhǔn)肉浸汁能夠測(cè)定該畜禽肉的新鮮度，但實(shí)際是否全部適合還要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。另外，肉浸汁振蕩浸提、標(biāo)準(zhǔn)液的制備、標(biāo)準(zhǔn)，肉浸汁標(biāo)準(zhǔn)品的具體成分、含量、比例，不同種類畜禽、水產(chǎn)原料的新鮮度的標(biāo)準(zhǔn)品是否可以共用等等，還需要進(jìn)一步的研究。

表2 比色法測(cè)定揮發(fā)性鹽基氮的回收率Table 2 The recovery rate of colorimetric determination of TVB-N

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Establishment of colorimetric determ ination method of raw meat freshness

HU Ya-yun1，LIZhi-cheng1，2，*，LIANG Na1，YUE Tian-li1，BAILian-she2，LIMeng2，HUANG Xue-ge1
（1.The Postdoctoral Station of Food Science，Northwest A&FUniversity，Yangling 712100，China；2.The PostdoctoralWorking Station，HefeiMeiling Co.，Ltd.，Hefei230601，China）

Total volatile basic nitrogen（TVB-N）was the unique physicaland chem ical indicators to evaluate the freshness of meat in the national standard.The p-d imethylam inobenzaldehyde（PDAB）being chromogenic reagent，the relationship between the TVB-N contentand its absorbance was studied.Colorimetric determ ination method of raw meat freshness was estab lished.The results showed that 1m L of extraction from raw meatwas added 1.8%（W/V）PDAB chromogenic agent 4.5m L，and concentrated hyd rochloric acid 1.2m L，and distilled water 3.3m L，and heated for eightm inutes in a water bath at 80℃.The relationship between the absorbance which was measured at 446nm and TVB-N content of raw meat was linear.The method of colorimetric determ ination of raw meat freshness by PDAB was estab lished，which was fast，stab le，and easy to operate and w ith high p recision and recovery.This m ight be one of the alternative formeasuring freshness of raw meat in future nationalstandards.

raw meat；totalvolatile basic nitrogen（TVB-N）；p-dimethylam inobenzaldehyde（PDAB）；colorimetric；method

TS251.7

A

1002-0306（2014）18-0059-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.003

2013－12－06 *通訊聯(lián)系人

胡亞云（1974-），女，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工方面的研究。

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目（2011KTCL02-07）；合肥美菱股份有限公司博士后項(xiàng)目（201207031）。