人正常及骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定

張慶，翁繩健，陳寶軍，閆虎，王藝茹，張子怡，蘇友新

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122；2.福州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，福建福州350007）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又稱(chēng)骨關(guān)節(jié)病，是以關(guān)節(jié)軟骨退變及破壞為主要病理特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，其病理過(guò)程的中心環(huán)節(jié)是關(guān)節(jié)軟骨的退變［1-2］。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)組成，軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨的唯一細(xì)胞成分，其生物學(xué)特征的變化與OA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］。借助人軟骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法進(jìn)行人正常關(guān)節(jié)及人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生物學(xué)特征觀(guān)察，可為OA的防治提供研究基礎(chǔ)［4］。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源從福州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科獲得因下肢損毀性創(chuàng)傷手術(shù)廢棄的髖、膝正常關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本各2例［男2例，女2例；年齡42～57歲，平均（51.00±6.98）歲］，6例原發(fā)性膝OA患者行全膝人工關(guān)節(jié)置換術(shù)廢棄的退變關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本［男2例，女4例；年齡58～73歲，平均（67.50±5.24）歲］。原發(fā)性膝OA診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)《骨關(guān)節(jié)炎診治指南》［5］。以上標(biāo)本的獲取已獲得福州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得患者知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑0.25%胰蛋白酶消化液、高糖DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)等胎牛血清（美國(guó)Hyelone公司）；II型膠原酶（美國(guó)Invitrogen公司）；Rabbit Anti-Colla?gen II（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；甲苯胺藍(lán)染色劑（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；免疫組化試劑盒（SABC法）（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS株式會(huì)社）；二氧化碳培養(yǎng)箱（香港利康公司）；電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；全自動(dòng)高壓滅菌鍋（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 原代軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)操作［6］。手術(shù)取下軟骨標(biāo)本后立刻用生理鹽水反復(fù)沖洗殘留的血液和組織液，低溫?zé)o菌保存，90 min內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)。用含1%雙抗（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）PBS液漂洗3遍后，先用手術(shù)刀片薄層削棄關(guān)節(jié)面外層軟骨組織以避開(kāi)增生骨贅表面的薄層纖維軟骨，然后薄層削取關(guān)節(jié)中心區(qū)域的軟骨薄片并避開(kāi)軟骨下骨組織，再用含1%雙抗PBS液漂洗軟骨薄片3遍后用手術(shù)刀將軟骨切碎至1 mm3大小，再次用含1%雙抗PBS液漂洗小軟骨粒3遍（見(jiàn)圖1）。漂洗后的軟骨粒投入0.25%胰蛋白酶消化液中（軟骨組織與消化液體積比約為1∶5）37℃消化30 min，吸棄胰蛋白酶消化液，再用0.2%Ⅱ型膠原酶（用含1%雙抗的10%FBS/DMEM配制）37℃恒溫水浴搖床中震蕩消化約16 h，離心，棄上清，細(xì)胞經(jīng)DMEM培養(yǎng)基洗滌3遍后再離心，棄上清，加20%FBS／DMEM培養(yǎng)液5 mL，200目鋼網(wǎng)過(guò)濾后將細(xì)胞懸液稀釋成2.5×105/mL密度接種于培養(yǎng)瓶，37℃5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后視細(xì)胞貼壁情況更換培養(yǎng)液，每天用倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)速度和形態(tài)并照相，每3 d更換1次培養(yǎng)液。

1.4.2 軟骨細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底約80%時(shí)傳代，吸棄原培養(yǎng)液，加5 mL PBS漂洗2次，加0.25%的胰蛋白酶消化液2.5 mL，稍振蕩培養(yǎng)瓶后放入37℃培養(yǎng)箱中消化3 min，倒置顯微鏡下觀(guān)察并稍振蕩培養(yǎng)瓶，待軟骨細(xì)胞大部分懸浮時(shí)，加5 mL 20%FBS/DMEM培養(yǎng)液中止消化，反復(fù)輕輕吹打培養(yǎng)瓶底壁后將細(xì)胞懸液移至15mL離心管，1000r/min離心5 min。棄上清，加入9 mL的20%FBS/DMEM培養(yǎng)液輕輕吹打使細(xì)胞均勻懸浮，分別吸取3 mL細(xì)胞懸液接種于3個(gè)培養(yǎng)瓶中，依次再向每個(gè)培養(yǎng)瓶中添加20%FBS/DMEM培養(yǎng)液2 mL。輕輕振蕩后將細(xì)胞置于37℃5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天用倒置顯微鏡觀(guān)察軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況并照相，每3 d更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底約80%時(shí)再次傳代。

圖1 分離軟骨組織

1.4.3 形態(tài)學(xué)觀(guān)察每天用倒置顯微鏡分別對(duì)原代、第1代、第2代人正常和人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)察并照相記錄。

1.4.4 甲苯胺藍(lán)染色將第2代人正常和人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分別接種于置有蓋玻片（經(jīng)4%多聚賴(lài)氨酸處理）的6孔板中，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，48 h后觀(guān)察細(xì)胞貼壁情況，并更換培養(yǎng)液，以后每3 d更換1次培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀(guān)察并照相記錄。當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)蓋玻片約60%時(shí)棄培養(yǎng)基，取出蓋玻片，PBS緩沖液輕輕漂洗3遍，滴加4%多聚甲醛室溫固定30 min，再用PBS緩沖液輕輕漂洗3遍，加入體積分?jǐn)?shù)1%甲苯胺藍(lán)染色液室溫放置30 min，然后用蒸餾水沖洗至藍(lán)色大致消失，自然晾干，封片并照相記錄。

1.4.5 Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色嚴(yán)格按照Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒說(shuō)明操作。最后加第二抗體室溫孵育30 min，加SABC工作液，室溫孵育20 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加DAB工作液，室溫顯色5 min，水洗，自然晾干，封片并照相記錄。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察倒置顯微鏡下觀(guān)察，人正常原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種24 h即可貼壁，貼壁后的軟骨細(xì)胞多呈圓形、橢圓形或短梭形，胞漿豐富，胞核呈圓形，居中，有1～3個(gè)核仁，呈“笑臉狀”，均勻散在生長(zhǎng)，部分細(xì)胞融合生長(zhǎng)，呈“鋪路石狀”，約14 d單層即鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底80%；傳代后的第1代、第2代軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，約10 d即可傳代，至第3代軟骨細(xì)胞表型仍穩(wěn)定。人OA原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種后在24～48 h貼壁，貼壁后的軟骨細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形、不規(guī)則形或樹(shù)突狀，呈“鋪路石狀”細(xì)胞群落少見(jiàn)，生長(zhǎng)速度較慢，原代細(xì)胞接種后20 d才鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底80%。第1、2代軟骨細(xì)胞傳代時(shí)間均需14 d，至第3代軟骨細(xì)胞形態(tài)更多樣，生長(zhǎng)更加緩慢。見(jiàn)圖2。

圖2 第2代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞

2.2 甲苯胺藍(lán)染色取第2代人正常和人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，二者均可見(jiàn)藍(lán)紫色異染顆粒，細(xì)胞核染成深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淺藍(lán)色。人正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，體積較大，藍(lán)紫色異染顆粒較多（圖3-A）。人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積較小，藍(lán)紫色異染顆粒較少（圖3-B）。

圖3 第2代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色（100×）

2.3 Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色取第2代人正常和人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色，二者均可見(jiàn)棕黃色異染顆粒，細(xì)胞核呈深棕黃色，細(xì)胞質(zhì)呈淺棕黃色。人正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，體積較大，棕黃色異染顆粒較多（圖4-A）。人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，體積較小，棕黃色異染顆粒較少（圖4-B）。

圖4 第2代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色（100×）

3 討論

目前研究普遍認(rèn)為，OA是以關(guān)節(jié)軟骨退變及破壞為主要病理特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，因此體外分離培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞是研究OA復(fù)雜病理機(jī)制的重要途徑。利用酶消化分離原代軟骨細(xì)胞的方法較多［7-8］，本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶兩步酶消化法，第一步用胰蛋白酶可以水解軟骨基質(zhì)中的蛋白聚糖，并且可以除去軟骨組織中可能混雜的其它組織成分，如結(jié)締組織、滑膜及血細(xì)胞等；第二步經(jīng)過(guò)膠原酶的消化及振蕩，能針對(duì)性地水解軟骨基質(zhì)中的膠原網(wǎng)架，促進(jìn)軟骨細(xì)胞周?chē)z原蛋白的水解，加快軟骨細(xì)胞的解離速度，大量高純度的軟骨細(xì)胞就可以分離出來(lái)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)兩步酶消化法能從人關(guān)節(jié)軟骨中分離獲取足夠的軟骨細(xì)胞進(jìn)行原代、傳代培養(yǎng)。

軟骨組織由唯一的軟骨細(xì)胞和其合成并分泌的基質(zhì)構(gòu)成，所以軟骨細(xì)胞的活性對(duì)維持細(xì)胞外基質(zhì)代謝平衡和軟骨組織的正常功能起重要作用。研究［9-10］表明：OA病理過(guò)程與軟骨細(xì)胞退化、合成分泌基質(zhì)能力的降低，以及軟骨基質(zhì)的降解加速密切相關(guān)。軟骨基質(zhì)中最主要的成分是Ⅱ型膠原和蛋白多糖，其中的蛋白多糖分子由一個(gè)核心蛋白和許多附著于其上的糖胺多糖（GAG）組成。GAG包括透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和硫酸皮膚素等，均是由軟骨細(xì)胞合成并分泌。故觀(guān)察軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原及蛋白多糖構(gòu)成成分GAG等合成的情況，可以判斷軟骨細(xì)胞的功能狀態(tài)。并且有研究［11-12］證實(shí)，OA中晚期伴隨著軟骨細(xì)胞的退化，其合成并分泌Ⅱ型膠原及蛋白多糖的功能逐漸下降。

本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到人正常關(guān)節(jié)軟骨顏色潔白略黃，表面光滑整齊，質(zhì)地柔軟有彈性；人OA關(guān)節(jié)軟骨則為淡黃色，表面粗糙不平整，中間有剝脫與局灶性侵蝕缺損，嚴(yán)重者軟骨下骨外露，彈性下降，呈現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨明顯的退變破壞病理表現(xiàn)；同時(shí)實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到的軟骨細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)狀況顯示，人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞比正常關(guān)節(jié)來(lái)源的軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，傳代后表型多樣且欠穩(wěn)定。細(xì)胞的形態(tài)及其功能具有一致性，本研究采用目前常用的甲苯胺藍(lán)染色和免疫組織化學(xué)染色方法來(lái)觀(guān)察軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖成分的含量改變［13］，顯示體外分離培養(yǎng)的人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞兩種染色法出現(xiàn)的異染顆粒均少于正常關(guān)節(jié)來(lái)源的軟骨細(xì)胞，提示OA來(lái)源的軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖的能力降低。因此，本研究從細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、形態(tài)與相關(guān)功能觀(guān)察均表明，分離自O(shè)A患者退變關(guān)節(jié)軟骨并培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞符合軟骨細(xì)胞退變的表現(xiàn)，可為OA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供細(xì)胞來(lái)源。

本研究只比較分離自人正常關(guān)節(jié)軟骨和人OA關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細(xì)胞部分生物學(xué)特征，未考慮年齡及其它因素對(duì)軟骨細(xì)胞形態(tài)與功能的影響。引起原發(fā)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退化的原因尚未完全明確，可能與增齡、應(yīng)力負(fù)荷、性別、遺傳等多因素有關(guān)，針對(duì)相關(guān)因素對(duì)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞影響的研究有待于今后進(jìn)一步開(kāi)展。

［1］ BIAN Q，WANG Y J，LIU S F，et al.Osteoarthritis：genetic factors，animal models mechanisms，and therapies［J］.Front Biosci（Elite Ed），2012（4）：74-100.

［2］ 邱貴興，榮國(guó)威.骨科學(xué)［M］.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2002：506.

［3］ KIM H A，BLANCO F J.Cell death and apoptosis in osteoarthritic cartilage［J］.Curr Drug Targets，2007，8（2）：333-345.

［4］ JIANG Y Z，ZHANG S F，QI Y Y，et al.Cell transplantation for ar?ticular cartilage defects：principles of past，present，and future practice［J］.Cell Transplant，2011，20（5）：593-607.

［5］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì).骨關(guān)節(jié)炎診治指南［S］.中國(guó)醫(yī)刊，2007，42（12）：30-32.

［6］ 胡炯，李笑顏，鄧廉夫，等.人正常軟骨細(xì)胞和骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)對(duì)照研究［J］.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2010，18（10）：8-12.

［7］ MANNING W K，BONNER WM JR.Isolation and culture of chon?drocytes from human adult articular cartilage［J］.Arthritis Rheum，1967，10（3）：235-239.

［8］ Klagsbrun M.Large-scale preparation of chondrocytes［J］.Meth?ods Enzymol，1979（58）：560-564.

［9］ ALMONTE-BECERRIL M，NAVARRO-GARCIA F，GONZA?LEZ-ROBLES A，et al.Cell death of chondrocytes is a combina?tion between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of Osteoarthritis within an experimental model［J］.Apoptosis，2010，15（5）：631-638.

［10］ VENN M，MAROUDAS A.Chemical composition and swelling of normal and osteoarthrotic femoral head cartilage.I.Chemical com?position［J］.Ann Rheum Dis，1977，36（2）：121-129.

［11］ JALBA B A，JALBA C S，VLADOI A D，et al.Alterations in ex?pression of cartilage-specific genes for aggrecan and collagen type II in osteoarthritis［J］.Rom J Morphol Embryol，2011，52（2）：587-591.

［12］ TASKIRAN D，STEFANOVIC-RACIC M，GEORGESCU H，et al.Nitric oxide mediates suppression of cartilage proteoglycan synthe?sis by interleukin-1［J］.Biochem Biophys Res Commun，1994，200（1）：142-148.

［13］ SCHWARTZ N B，PIROK EW 3RD，MENSCH JR JR，et al.Do?main organization，genomic structure，evolution，and regulation of expression of the aggrecan gene family［J］.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1999（62）：177-225.