基于Hemin/多壁碳納米管納米復合物構(gòu)建的過氧化氫生物傳感器的研究

夏 志 張 宇 李黔柱 劉 紅

(畢節(jié)學院 化學工程學院，貴州 畢節(jié) 551700)

0 前言

過氧化氫(H2O2)是生物體內(nèi)許多氧化酶如葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶和乙醇氧化酶等反應的副產(chǎn)物，也是許多工業(yè)生產(chǎn)過程的原料或中間產(chǎn)物，因此通過H2O2的測定可以間接地測定其它目標物的濃度，對其含量的測定在生物、環(huán)境、臨床、工業(yè)和食品分析中具有重要意義[1-2]。目前，測定H2O2的方法有電化學法[3-5]、分光光度法[6]、化學發(fā)光法[7-8]和滴定法[9]等，其中電化學方法因其方法簡單、靈敏度高、選擇性好、能在線監(jiān)測等特點被廣泛關注，尤其是利用辣根過氧化物酶(HRP)構(gòu)建的H2O2傳感器的報道尤其多，因為酶傳感器具有專一性高、反應速度快等優(yōu)點。然而，酶傳感器無論怎樣改進都要依賴于酶的催化，而酶又有其自身的缺陷，比如，酶的活性會隨放置的時間而降低、對pH值及溫度比較敏感、價格昂貴、在催化氧化過程中容易受水中溶解氧的干擾等。在將酶固定到電極上時也會產(chǎn)生一些問題，如將酶固定到電極上的材料生物相容性不好，致使酶變性；固定到電極表面的酶數(shù)量有限等。因此，構(gòu)建無酶型的傳感器對進一步提高生物傳感器的性能將起到積極的影響。

Hemin是一類重要的有機共軛分子，可以模擬許多酶的活性中心[10-12]。在生物體內(nèi)，許多金屬蛋白酶經(jīng)常自組裝成納米尺度的超分子結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)其基本的生物催化作用。Hemin可以通過共價或者非共價作用有序組裝在納米材料上，實現(xiàn)其模擬金屬蛋白酶的功能。而且Hemin是良好的電子媒介體，對生命過程相關小分子的氧化還原具有較好的電催化活性[13-14]。因此，Hemin納米組裝形成的納米材料復合物可用于新型電化學生物傳感器的構(gòu)建。

本研究利用Hemin具有模擬酶的這種性質(zhì)，與多壁碳納米管(MWCNTs)通過π-π鍵作用制成Hemin/MWCNTs的納米復合物，采用滴涂技術并在nafion的作用下將其固載在電極表面，構(gòu)建nafion/Hemin/MWCNTs修飾的玻碳電極(nafion/Hemin/MWCNTs/GCE)。該修飾電極具有催化作用強、制備簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性及重復性好等特點。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

CHI660D電化學工作站(上海辰華)，KS-250科生牌超聲清洗儀(寧波海曙科生超聲有限公司)，微量進樣器(10 mL，上海)，pH計(上海精科)，X85-2恒溫磁力攪拌器(上海梅穎清)，紫外光譜儀(cary50型)，實驗采用三電極體系(經(jīng)修飾的玻碳電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極、鉑絲電極為對電極)。

Hemin(C34H33FeN4O5)來自天津市光復精細化工廠、MWCNTs、氯化鉀、磷酸和氫氧化鈉均購自國藥集團化學試劑有限公司，H2O2(濃度30%，分析純)購自重慶化學試劑廠，其余試劑均為分析純。由Na2HPO4-NaH2PO4配制pH值為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.0，8.5，9.0的PBS緩沖溶液，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 Hemin/MWCNTs復合物生物傳感器的制備

將0.05 g的Hemin溶于10 mL氫氧化鈉(2 mol/L)溶液中，再稱取0.05 g的MWCNTs溶于二次蒸餾水中，進行超聲后，各取5 mL溶液充分混合。如圖1所示，將5 μL Hemin/MWCNTs的復合物滴加于玻碳電極的表面，室溫下晾干，最后將2 mL nafion(5%，V/V)滴于電極表面即制得nafion/Hemin/MWCNTs修飾的H2O2生物傳感器。

圖1 修飾電極的制備過程圖Figure 1 Schematic diagram for preparation process of the modified electrode.

2 結(jié)果與討論

2.1 Hemin/MWCNTs納米復合物的SEM及TEM表征

圖2A為Hemin/MWCNTs復合物的透射電鏡(TEM)圖?？梢钥吹?，Hemin/MWCNTs復合物呈管狀且分散均勻；圖2B為Hemin/MWCNTs復合物的掃描電鏡(SEM)圖，其在電極表面形成了一種疏松多孔的三維雜化結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于保留MWCNTs的優(yōu)良性質(zhì)，促進電子的傳輸，并增加電極的有效比表面積。

2.2 UV-Vis光譜表征

采用UV-Vis光譜技術對制得的納米復合物進行了表征，結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，Hemin溶液(b)在390 nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰，MWCNTs(c)溶液在248 nm處有明顯的吸收峰，而Hemin/MWCNTs溶液在388 nm及251 nm處均出現(xiàn)了明顯的吸收帶，這表明Hemin/MWCNTs納米復合物成功地合成了，且各自保持了其良好的性質(zhì)。

圖2 Hemin/MWCNTs納米復合物的透射電鏡(A)和掃描電鏡圖(B)Figure 2 TEM (A) and SEM (B) images of Hemin/MWCNTs composite.

圖3 Hemin/MWCNTs溶液的UV-Vis光譜表征圖Figure 3 The UV-Vis spectroscopy of Hemin/MWCNTs solution.

2.3 修飾電極的循環(huán)伏安電化學表征

圖4是不同的修飾電極在pH值為6.0的PBS(0.1 mol/L)中的循環(huán)伏安圖。圖4中a為裸的玻碳電極，沒有明顯的氧化還原峰；當修飾有MWCNTs時(圖4中b)，在0 V左右可以觀察到一對氧化還原峰，這是MWCNTs的特征峰，說明MWCNTs成功修飾到了電極表面；當電極修飾有Hemin/MWCNTs復合物時(圖4中c)，在-0.4 V及0 V左右分別有一對明顯的氧化還原峰，且氧化還原峰的峰電流均有所增大，說明Hemin具有良好的導電性。-0.4 V左右的氧化還原峰為Hemin中Fe3+的氧化還原峰[15]，0 V左右的為MWCNTs的特征峰，說明Hemin/MWCNTs成功修飾到了電極表面。

圖4 不同修飾電極的循環(huán)伏安表征圖Figure 4 Cyclic voltammogram curves of the different modified electrodes.

2.4 實驗條件的優(yōu)化

(1)pH值的優(yōu)化

測試底液的pH值對生物分子的催化反應及其活性有重要影響。圖5考察了修飾電極在pH=3.5～9.0的PBS(0.1 mol/L)緩沖溶液中對H2O2的響應。改變pH值，采用計時電流法記錄其電流響應。結(jié)果表明，當pH值由3.5升至6.0時，電極電流響應逐漸增加；當pH>6.0后，電流響應開始下降，且電極變得不穩(wěn)定，故本實驗選用的pH=6.0的PBS為測試底液。

(2)掃描速率的選擇

圖6是Hemin/MWCNTs復合物修飾玻碳電極在含有H2O2(3.5×10-1mol/L)的PBS(pH=6.0)中，在-0.6～0.0 V電位范圍內(nèi)，以不同掃描速度進行掃描的循環(huán)伏安圖。從圖6中可以看出，隨著掃描速度的不斷增加，氧化還原峰電流均明顯增大，在10～100 mV/s范圍內(nèi)氧化還原峰電流值與掃描速率呈良好的線性關系(見插圖6B)，氧化峰 和還原峰的關系式分別為 ：ipa=1 463.2v+2.1796，相關系數(shù)R=0.999；ipc=-1 506v-6.990 1，其相關系數(shù)R=0.999，其中：ipa和ipc為峰電流，單位為mA；v為電壓掃描速率，單位為V/s。說明此修飾電極在電化學過程是受擴散控制的。

圖5 pH值對修飾電極響應電流的影響Figure 5 Influence of pH on current response of a modified electrode.

(3)傳感器響應性能的研究

如圖7所示，當溶液中分別加入10 μL過氧化氫(3.5×10-1mol/L)時，Hemin/MWCNTs修飾電極在-0.2 V下電流有明顯的增加，說明在該電位下修飾電極對H2O2有較高的靈敏度。相關的實驗原理如下[16-17]：

Hemin(Fe3+)+H2O2→Compound I (Fe4+=O)+H2O

Compound I(Fe4+=O)+H++e-→Compound II

Compound II+H++e-→Hemin(Fe3+)+H2O

圖6 (A)Hemin/MWCNTs修飾玻碳電極在不同掃描速率下的循環(huán)伏安圖 (B)為掃描速率與峰電流的線性關系圖Figure 6 (A)Cyclic voltammongram curves of MWCNTs/Hemin/GCE at different scanning rates (pH=6.0). (B) The peak current vs scan rate.

圖7 修飾電極對H2O2的循環(huán)伏安響應圖Figure 7 CV responses of the modified electrode to H2O2.

圖8是在優(yōu)化的實驗條件下，修飾電極對在PBS中分別加入不同濃度的H2O2時的計時電流響應圖，從圖中可知該修飾電極對H2O2有較高的靈敏度，響應時間較快(5 s)。H2O2低濃度時的響應電流比較平坦，隨著H2O2濃度的增大，響應電流增加幅度增大。H2O2濃度在0.8～1.8 mmol/L的范圍內(nèi)具有良好的線性關系(R2=0.992 2)，線性方程為i=-70.698C-28.863，其中i為響應峰電流，單位為μA；C為H2O2的濃度，單位為mmol/L。檢測下限可達到0.2 mmol/L。

圖8 優(yōu)化條件下修飾電極對H2O2 的計時電流響應圖Figure 8 Timing amperometric response of the modified electrode to H2O2 under optimal conditions.

2.5 電極的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

用同一支電極對3.5×10-1mol/L的H2O2溶液連續(xù)測定20次，其電流響應相對偏差為2.3%，在同樣條件下制備7支修飾電極，其電流響應的相對標準偏差為4.5%，表明Hemin/MWCNTs修飾電極對H2O2有較好的重現(xiàn)性。將電極置于H2O2(3.5×10-1mol/L)溶液中連續(xù)掃描100圈，峰電流僅下降5.2%，表明此電極具有良好的操作穩(wěn)定性，試驗后將電極置于4 ℃下懸于pH值為6.0的PBS上方保存，14 d內(nèi)的電流沒有明顯變化，28 d后的響應電流為原來的89%，說明該電極具有較好的儲備穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

利用Hemin與MWCNTs之間的π-π鍵作用，在超聲分散下制備Hemin/MWCNTs納米復合物；采用滴涂技術并在nafion的作用下將其固載在電極表面，制得一種全新的H2O2生物傳感器(nafion/Hemin/MWCNTs/GCE)。實驗表明，Hemin對H2O2具有較好的催化作用，MWCNTs的加入有效地增加了電極的比表面積，促進電子傳遞，提高電極的靈敏度。在檢測中，該傳感器表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性、較低的檢出限和較寬的檢測范圍。Hemin/MWCNTs所表現(xiàn)出的高穩(wěn)定性和催化活性使其在各種生物傳感器、生物電子器件以及催化劑等方面具有廣泛的潛在應用前景。

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