雙孢蘑菇工廠化栽培中四種木霉病害的精準鑒定

宋曉霞 王 倩 雋加香 張津京 陳 輝 陳明杰 黃建春* 謝斌強

（1上海市農業(yè)科學院食用菌研究所，上海奉賢201403；2上海聯中食用菌專業(yè)合作社，上海金山201516）

雙孢蘑菇栽培量占世界總食用菌產量的31.8%[1]。中國雙孢蘑菇工廠化栽培起步較晚，但增長速度卻很快[2]，其中勞動力成本低、原材料來源廣泛、環(huán)保要求低、鮮菇市場需求量大、地方政府支持力度大等是主要原因[3]。但與國外發(fā)達國家的雙孢蘑菇工廠化栽培相比，我國雙孢蘑菇工廠化栽培存在著設備設施精準度和穩(wěn)定性不足、生產原料質量難以控制并保持穩(wěn)定、管理體制不配套等問題，使得我國將在引進和消化國外雙孢蘑菇工廠化栽培技術并根據我國特有情況進行創(chuàng)新的道路上還要走很久[3-5]，相應的病蟲害數量和種類也在不斷增多[6]。

木霉屬（Trichoderma）真菌為世界性分布真菌，可以在多種基質上生長：木材、纖維素、軟木、幾丁質、稻草、蘑菇以及植物根際環(huán)境、植物病原菌菌體、不銹鋼、柴油、合成橡膠、聚乙烯以及瀝青等[7]，是許多食用菌栽培過程中極易感染和傳播的真菌性病害[8-9]。由于許多木霉屬的菌落多數呈現綠色，所以在雙孢蘑菇工廠化栽培過程中，大家一看到綠色的菌落都會稱為綠霉，而且許多便于企業(yè)技術人員參考的病蟲害鑒定和防治的專業(yè)書籍在介紹時也統(tǒng)稱為綠霉，并沒有具體介紹是木霉屬的哪個物種，更沒有對應的顯微形態(tài)特征和分子特征[8-9]。

精準鑒定木霉是有效預防和控制雙孢蘑菇工廠化栽培中木霉病害的前提，許多學者都對木霉屬的分類進行了研究[10-16]，并詳細描述了各個木霉屬物種的顯微形態(tài)特征。隨后，加入了內轉錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）、延伸因子 1-α（EF-1α）等分子數據的支撐[17]，Druzhinina等[15]還利用每個物種的ITS1、ITS2序列發(fā)展出了一個DNA條形碼系統(tǒng)用于快速鑒定木霉（http：//www.isth.info/tools/molkey/index.php）。但專業(yè)性和生產指導性書籍之間銜接性很差，其中最關鍵的是缺少每個木霉物種病害特征、顯微形態(tài)特征和分子數據之間的聯系性。

為了建立三者之間的聯系，筆者對收集到的四種木霉屬病害進行病害、形態(tài)特征觀察和ITS序列測定，希望能摸索出一套精準鑒定雙孢蘑菇工廠化栽培過程中木霉屬病害的通用方法，為企業(yè)技術人員能在生產中精準鑒定木霉屬病害提供技術參考，為我國雙孢蘑菇工廠化栽培事業(yè)的發(fā)展貢獻力量。

1 材料與方法

1.1 病害樣本收集

筆者在2018年4-7月分別在上海聯中食用菌專業(yè)合作社（以下簡稱聯中）和山東臨沂瑞澤生物科技股份有限公司（以下簡稱瑞澤）的雙孢蘑菇工廠化出菇房采集病蟲害樣本，共收集到了10份木霉病害樣本。具體收集過程如下：先用相機拍照病害樣本，然后手戴無菌手套取2～3塊表面攜帶病害樣本的覆土或2個雙孢蘑菇子實體放入無菌的塑料培養(yǎng)皿中（直徑90 mm），用封口膜封住培養(yǎng)皿，平放進袋內帶回實驗室。整個運輸過程中保證培養(yǎng)皿呈平放狀態(tài)。等樣本帶入實驗室后，立即在實體解剖鏡下觀察病害樣本的形態(tài)特征、拍照，并確定菌種分離的位置。

圖1 綠木霉病害及形態(tài)特征

1.2 菌種分離

在超凈工作臺中進行菌種分離。由于木霉病害樣本有許多孢子，所以分種時不通風，在近酒精燈處操作即可。用無菌的接種針輕輕接觸一下菌種分離的位置，然后在事先做好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上劃一下，封口后在25℃下暗光培養(yǎng)。每天觀察培養(yǎng)皿中的菌落情況，如有細菌污染，通過不斷轉接挑取菌落最前沿菌絲的方式獲得純菌種；如有多種真菌，也通過挑取每個形態(tài)單一的真菌菌落最前沿菌絲的方式獲得每個真菌的純菌種。每個純菌種各有2個培養(yǎng)皿。

1.3 形態(tài)鑒定

取一個快長滿菌絲培養(yǎng)皿，揭去培養(yǎng)皿蓋拍照，并在實體解剖鏡和電子顯微鏡下觀察菌絲的顯微結構；另外1個培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)，等產孢區(qū)出現后，開蓋拍照并在實體解剖鏡和電子顯微鏡下觀察菌絲、孢子等顯微結構。將觀察到的形態(tài)特征與文獻[16]進行比對，最終確定所屬物種。

1.4 分子鑒定

利用ITS序列對各菌絲進行分子鑒定。菌絲裂解液制備、PCR反應體系、PCR反應條件及產物檢測、PCR產物回收、連接、轉化、克隆和測序詳情參照參考文獻[18]。每個菌絲測3個克隆。

用DNASTAR Lasergene 7.1.0軟件中的SeqMan合并同一菌絲的ITS序列，剔除上游引物前端和下游引物后端冗余的序列，將各個物種的ITS序列遞交 到 NCBI（National Center Biotechnology Information）申請GenBank號。然后，將每個菌絲的ITS序列在NCBI和 TrichOKEY：molecular Barcode數據庫中進行檢索以確定所屬物種。

用DNASTAR Lasergene 7.1.0中的EditSeq軟件統(tǒng)計各個物種ITS序列的堿基組成、長度和GC含量。用MEGA 7.0比對各個物種序列，并用DNAMAN 5.2.2將比對結果輸出。

2 結果與分析

2.1 綠木霉Trichoderma virens

病害特征：菌絲在覆土表面呈蘑菇圈分布，里層綠色，邊緣白色（圖1a），隨著菌落的擴大，中間部分的菌絲會變弱（圖1b）。被該病害覆蓋的地方，子實體萎縮或腐爛。一般在第一潮菇分布較少，但一旦出現，隨著潮次的增加，病害現象不斷加重，最后可能分布于整個覆土表面。該病害樣本在聯中采集到4份，在瑞澤采集到2份。除聯中1份樣品中分離到綠木霉和2種非木霉真菌之外，其他5份樣品都僅分離到1種綠木霉真菌。

形態(tài)特征：菌絲在PDA平板上呈現白色、卷毛狀，2～3 d長滿整個平板。隨著菌落不斷擴大，中間部分的菌絲變弱（圖1c）。25℃暗光培養(yǎng)3 d后開始出現產孢區(qū)，產孢區(qū)平展，從中間不斷向邊緣擴散，直至覆蓋整個培養(yǎng)皿（圖1d）。分生孢子梗半透明，從沒有分化的菌絲上生出（圖1e），向基部不分枝，向頂分枝不規(guī)則（圖1e-g）。瓶梗基部縊縮，中部膨大，逐漸向頂變細，呈壇形至安瓿形（圖1f，g）。分生孢子闊橢球形至倒卵圓形，基部細（圖1 h），相鄰瓶梗上的分生孢子常常聚合為頭狀體（圖1f）。

ITS序列：GenBank號為MK552404，序列長度為614 nt，GC 含量為 55.54%（圖 2）。在 NCBI和 Tri-chOKEY：molecular Barcode數據庫中比對到的都是綠木霉。

圖2 四種木霉病害的ITS序列比對

2.2 哈茨木霉Trichoderma harzianum

病害特征：大片子實體表面有褐斑，特別是菌蓋表面（圖3 a）。等帶回實驗室的第二天，褐變的菌蓋表面長出許多卷毛狀的白色菌絲（圖3 b、c）。該病害樣本在聯中采集到1份，僅分離到1種哈茨木霉真菌。

形態(tài)特征：菌絲在PDA培養(yǎng)基上白色、卷毛狀，3～4 d長滿平板（圖3d）。25℃暗光培養(yǎng)4 d后開始出現扁平產孢簇，邊緣出現的較早，隨著培養(yǎng)時間延長，許多致密的扁平產孢簇愈合為形狀不規(guī)則的聚合體，邊緣包圍有不育的白色菌絲體。產孢區(qū)綠色至灰綠色（圖3e、f）。由于分生孢子豐富，產孢區(qū)表面常呈顆粒狀或者粉狀（圖3f）。在顯微鏡下，分生孢子梗透明，初級分枝幾乎呈直角或稍微向頂方向彎曲，二次分枝復雜，終極分枝多數為單細胞（圖3g）。瓶?；靠O縮，中部膨大，頂部突然變細，呈安瓿形或壇形（圖3h）。分生孢子亞球形至倒卵形，尖端闊圓，基部細圓（圖3i）。

ITS序列：GenBank號為MK552405，序列長度為619 nt，GC 含量為 55.09%（圖 2）。在 NCBI和 TrichOKEY：molecular Barcode數據庫中比對到的都是哈茨木霉。

圖3 哈茨木霉病害及形態(tài)特征

2.3 子座木霉Trichoderma stromaticum

病害特征：在覆土表面呈現致密的、絨毛狀的白色、淡綠色或灰綠色菌落（圖4a、b），被該菌落覆蓋的地方，子實體萎縮或腐爛。該病害樣本在聯中和瑞澤各采到1份，都分離到了1種子座木霉。

形態(tài)特征：在PDA培養(yǎng)基上，菌絲絨毛狀、雪白，6～7 d長滿平板（圖4c）。25℃暗光培養(yǎng)15 d后才出現明顯的產孢區(qū)，初期為綠色，后期為灰黃色（圖4d）。在顯微鏡下，分生孢子梗的不育和可育延伸物明顯突出在孢子堆外面（圖4e）?？捎稚咦庸］^長，分枝少或不分枝，瓶梗位于分枝頂端，單生或成對（圖4f、g）。分生孢子橢圓形或短圓柱形（圖4h）。

ITS序列：GenBank號為MK552406，序列長度為618 nt，GC含量為 55.50%（圖2）。在 TrichOKEY：molecular Barcode數據庫中比對到的是俄羅斯木霉T.rossicum，在NCBI中比對到相似度在98%以上的物種較多，有俄羅斯木霉、T.barbatum，長枝木霉T.longibrachiatum，T.ivoriense，子座木霉T.stromaticum等，其中匹配度最高的是俄羅斯木霉。但比對俄羅斯木霉與本樣本的形態(tài)特征、產孢簇特征、分生孢子梗形態(tài)都明顯不同。經過逐個形態(tài)比對，最終確定該樣本為子座木霉。

2.4 鉤狀木霉Trichoderma hamatum

病害特征：在覆土層呈現許多白色斑點（圖5a、b），打水后白色斑點會消失，在實體解剖鏡下觀察會發(fā)現這些白色斑點為白色菌絲（圖5c）。該病害樣本在聯中采集到1份，分離到了1種鉤狀木霉。

圖4 子座木霉病害及形態(tài)特征

圖5 鉤狀木霉病害及形態(tài)特征

形態(tài)特征：在PDA培養(yǎng)基上，菌絲白色，多數為基內菌絲，氣生菌絲有限、呈卷毛狀，4～5 d長滿平板（圖5d）。25℃暗光培養(yǎng)7 d后出現產孢區(qū)，產孢區(qū)墊狀或半球形，初期白色，后期綠色，從菌落邊緣開始生長（圖5e）。分生孢子梗主軸直，多次分枝。瓶梗亞球形或安瓿形，基部縊縮，頂端突然變細，呈緊密的渦狀排列（圖5f），分生孢子橢球形（圖5g）。

ITS序列：GenBank號為MK552407，序列長度為602 nt，GC 含量為 53.65%（圖 2）。在 NCBI和 TrichOKEY：molecular Barcode數據庫中比對到的都是鉤狀木霉。

3 小結與討論

觀察到的綠木霉、哈茨木霉、子座木霉和鉤狀木霉的產孢出現時間分別為3 d、4 d、15 d和7 d，綠木霉在聯中和瑞澤許多菇房都采到過，而且隨著雙孢蘑菇潮次的增加，為害程度也上升，有的菇房在第3潮菇時整個覆土表面都會有該病害；哈茨木霉的為害面積從圖4a中就能看出；子座木霉在菇床上的菌落一般都很?。汇^狀木霉病害面積雖然較大，但打水后白色菌絲會消失，后期覆土中也能長出子實體，并且沒有病害特征出現?？梢?，雙孢蘑菇工廠化栽培過程中某一木霉病害的為害時間、范圍與該木霉產孢區(qū)出現的時間長短有關，產孢區(qū)出現時間短的木霉為害時間較長、范圍較廣，產孢區(qū)出現時間長的木霉為害時間較短、范圍較小。因此，可從產孢區(qū)時間長短上來判斷木霉病害對雙孢蘑菇工廠化栽培的為害時間和范圍，做好針對性的預防和控制。

雖然分子數據鑒定物種有不受環(huán)境影響、方便快捷等優(yōu)勢，但現在界定的木霉種類絕大多數還是基于培養(yǎng)、產孢簇和分生孢子梗分枝形式等形態(tài)特征，基因序列分析只作為確認手段或者特征描述的補充[16]。除子座木霉的ITS序列鑒定與形態(tài)特征不一致以外，綠木霉、哈茨木霉和鉤狀木霉的形態(tài)和分子鑒定結果都一致。雖然TrichOKEY：molecular Barcode數據庫將子座木霉的ITS序列鑒定為俄羅斯木霉，NCBI也首推的是俄羅斯木霉，但筆者經過形態(tài)比對之后還是鑒定為子座木霉。為了保證鑒定的正確性，又將原始菌株進行重新培養(yǎng)、形態(tài)觀察和ITS序列測定，結果是一樣的，所以這里保留筆者自己鑒定的結果。

因雙孢蘑菇工廠化栽培是一個開放的環(huán)境，觀察到的病害樣本可能是許多病害樣本的混合體，所以除了精準鑒定分離到的病原菌外，最好是將分離到的病原菌進行回接試驗，以確認分離到的病原菌就是引起病害微生物。因采集到病害樣本的是兩個較大的雙孢蘑菇工廠化企業(yè)，每個菇房至少有三排三層床架，如果做回接試驗造成的污染和經濟損失不可估量，而實驗室也無法模擬雙孢蘑菇工廠化栽培的條件，所以回接試驗未做。為了確定分離到的4種木霉就是引起病害的病原菌，筆者只能通過多點采樣、多次分種，分種前和分種后菌絲形態(tài)保持一致等間接性證明。

多點采樣和多次分種：共10份樣本，每份樣品分離純化時至少取了3個不同的地方分種，每個地方又分了2個平板，如果這6個平板分出的真菌形態(tài)和分子數據都一致就認為分離到了該病害樣本。10份樣本中有9份僅分離到了一種真菌，而在1份從聯中采集到的樣本中除了綠木霉，還分離到了1株凍土毛霉Mucor hiemalis和1株被孢霉屬物種Mortierellasp.。分種前就是菇床上，分種后就是PDA培養(yǎng)基上，分別在實體解剖鏡下觀察病害樣本在分種前和分種后的形態(tài)特征：綠木霉無論是在菇床上還是在PDA上，隨著菌落的擴大，中間菌絲都會變弱；哈茨木霉無論是在子實體上還是PDA上，菌絲都為白色卷毛狀；鉤狀木霉無論是在覆土上還是在PDA上，氣生菌絲都不如其他3種木霉那么明顯等等。