采后納米氧化鋅對(duì)蘋果黑斑病和青霉病的控制

劉瑾瑾，李永才，*，劉昌寧

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

采后納米氧化鋅對(duì)蘋果黑斑病和青霉病的控制

劉瑾瑾1，李永才1，*，劉昌寧2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

通過(guò)離體（in vitro）和體內(nèi)（in vivo）實(shí)驗(yàn)，研究了納米氧化鋅處理對(duì)蘋果采后主要致腐病菌Alternaria alternata和Penicillium expansum生長(zhǎng)的抑制及對(duì)病害的控制效果。結(jié)果表明：納米氧化鋅對(duì)兩種病菌的菌絲生長(zhǎng)均具有明顯的抑制作用，且抑制效果隨濃度的升高而增加，其中20%的納米氧化鋅對(duì)A.alternata和P.expansum的抑菌率分別達(dá)到86.85%和49.60%，對(duì)前者抑制效果顯著優(yōu)于后者。20%納米氧化鋅處理對(duì)A.alternata孢子萌發(fā)的抑制較對(duì)照下降了87.37%，而15%納米氧化鋅處理對(duì)P.expansum孢子萌發(fā)的抑制較對(duì)照下降了94.56%。同時(shí)納米氧化鋅也顯著降低了損傷接種A.alternata和P.expansum蘋果病斑直徑的擴(kuò)展，其中以5%納米氧化鋅處理效果最好，分別與對(duì)照相比降低了76.24%和65.32%，更高濃度處理并沒(méi)有增強(qiáng)抑制效果。由此表明，納米氧化鋅可通過(guò)直接抑菌作用來(lái)減輕蘋果黑斑病和青霉病的發(fā)生。

蘋果，納米氧化鋅，互隔交鏈孢，擴(kuò)展青霉

蘋果（Malus domestica）是我國(guó)北方地方廣泛種植的水果，雖然蘋果具有良好的貯藏性，但在貯藏后期腐爛病的發(fā)生率仍然較高。蘋果的腐爛病與多種真菌的侵染有關(guān)，鏈格孢（Alternaria alternata）引起的黑斑病以及擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是主要病害[1]。雖然化學(xué)殺菌劑可有效控制蘋果腐爛，但容易造成殺菌劑殘留和環(huán)境污染，并能誘導(dǎo)病原物產(chǎn)生抗藥性，從而使其應(yīng)用受到限制。因此，研究并利用化學(xué)殺菌劑的替代物來(lái)防治果蔬的病害已勢(shì)在必行[2]。

氧化鋅（ZnO）是一種無(wú)機(jī)金屬型氧化物，能夠補(bǔ)充人體必須的礦物元素鋅，而且納米ZnO與人體細(xì)胞有很好的組織相容性[3]，并具有極好的抗氧化和抗腐蝕能力，高的熔點(diǎn)，良好的機(jī)電耦合性、屏蔽紫外線能力及殺菌除臭性[4-5]，使其在光電器件、化工、涂料、醫(yī)藥等眾多方面有著廣泛的應(yīng)用。目前，納米氧化鋅的抗菌作用研究主要集中于細(xì)菌方面，研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抗菌性能，且對(duì)大腸桿菌的殺菌效果好于金黃色葡萄球菌，其殺菌機(jī)理是利用納米氧化鋅產(chǎn)生的活性氧種造成微生物損傷而實(shí)現(xiàn)抗菌，與其光催化機(jī)理相似[6-7]。盧亢[8]還發(fā)現(xiàn)負(fù)載納米氧化鋅的海藻酸纖維能夠在24h內(nèi)殺滅溶液中2×106cfu/mL的大腸桿菌和4×103cfu/mL的金黃色葡萄球菌，隨鋅含量增加，其抗菌能力提高。為了進(jìn)一步確定納米氧化鋅對(duì)細(xì)菌的作用方式和機(jī)理，江霞等[9]研究表明，ZnO與大腸桿菌K88作用時(shí)，首先被吸附到大腸桿菌K88的表面，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體的細(xì)胞壁被破壞，細(xì)菌的形態(tài)也隨之發(fā)生改變，這會(huì)使菌體對(duì)滲透壓的敏感性增強(qiáng)，最終破裂死亡。近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)納米ZnO能有效的抑制鐮刀菌[10]、灰葡萄孢和擴(kuò)展青霉[11]等真菌的生長(zhǎng)。但有關(guān)納米氧化鋅對(duì)蘋果A.alternata和P.expansum的體外抑菌實(shí)驗(yàn)及對(duì)采后病害的控制的研究尚未見報(bào)道。因此，本文擬采用離體（in vitro）和體內(nèi)（in vivo）實(shí)驗(yàn)，研究不同濃度納米氧化鋅對(duì)蘋果A.alternata和P.expansum的體外抑制效果和對(duì)損傷接種蘋果病斑直徑的影響，以期為蘋果采后病害的防治提供安全有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試紅富士蘋果 2013年4月購(gòu)于蘭州市安寧區(qū)桃海農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，選擇外觀整齊，大小均勻，無(wú)病蟲害的果實(shí)，單果包紙，紙箱包裝后運(yùn)抵本校實(shí)驗(yàn)室，室溫（25±2）℃貯藏待用；納米氧化鋅（20%濃度） 購(gòu)于江蘇逸振科技有限公司。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；VXH-3型微型漩渦混合器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；CX21FS1C型生物顯微鏡 奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制作 參照文獻(xiàn)[12]中的方法并進(jìn)行修改。制作馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA，培養(yǎng)基成分：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。將馬鈴薯切碎，加水煮沸30min后過(guò)濾。同時(shí)將糖和瓊脂分別溶解后與馬鈴薯過(guò)濾液混合，并定容至1000mL。分裝在三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后制備平板PDA。

1.2.2 病原菌的分離純化 參照文獻(xiàn)[12]中的方法。分別采集典型蘋果黑斑病和青霉病的病果，用70%酒精表面消毒，無(wú)菌水沖洗后，切取病健交界處組織，在無(wú)菌操作條件下移置到馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA平板上，于25℃保溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出分生孢子后，進(jìn)行單孢分離、純化后在PDA培養(yǎng)基上保存待用。

1.2.3 不同濃度納米氧化鋅處理對(duì)A.alternata和P.expansum菌落直徑的影響 參照范青等[13]方法，先分別將1mL 5%、10%、15%和20%的納米氧化鋅溶液溶于滅菌后的150mL PDA培養(yǎng)基中，以不添加納米氧化鋅作為對(duì)照，混合均勻后再分別倒入90mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，待培養(yǎng)基冷卻后，將用無(wú)菌打孔器打好的A.alternata和P.expansum菌餅（直徑10mm）接種于培養(yǎng)基中央，25℃避光培養(yǎng)。當(dāng)對(duì)照皿中菌體長(zhǎng)至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，測(cè)定病斑直徑。并按下式計(jì)算抑菌率。每處理設(shè)平行3個(gè)，重復(fù)3次。

抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-原菌餅直徑）×100

1.2.4 孢子懸浮液的制備 參照文獻(xiàn)[14]中的方法并修改。取25℃下培養(yǎng)7d的帶菌PDA平皿一個(gè)，加入含0.05%Tween80的無(wú)菌水約10mL，用玻璃棒刮下平板上的A.alternata和P.expansum孢子，然后轉(zhuǎn)入50mL三角瓶中，在微型旋渦混合器上振蕩15s，再用雙層紗布過(guò)濾，濾液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)算出孢子懸浮液的濃度后，最后稀釋至所需濃度（1×105孢子/mL）。

1.2.5 不同濃度納米氧化鋅處理對(duì)A.alternata和P.expansum孢子萌發(fā)的影響 參照孫小娟[15]方法。用打孔器取直徑為10mm的2%瓊脂培養(yǎng)基并將其置于滅菌的載玻片上，然后分別加入10μL 5%、10%、15%和20%納米氧化鋅溶液于培養(yǎng)基上，以添加相同量的無(wú)菌水作為對(duì)照，再在其上加入10μL孢子懸浮液。置于25℃下，連續(xù)數(shù)小時(shí)鏡檢萌發(fā)率，直到對(duì)照基本完全萌發(fā)。每次鏡檢100個(gè)孢子，重復(fù)3次。

1.2.6 不同濃度納米氧化鋅處理對(duì)損傷接種蘋果病斑直徑的影響 參照畢陽(yáng)[16]方法并修改。選擇外觀整齊，無(wú)病蟲害的蘋果果實(shí)，2%NaClO進(jìn)行浸泡消毒2～5min，再用清水沖洗掉，待晾干后用70%酒精表面消毒，再用滅菌鐵釘（直徑3mm）在果實(shí)上均勻刺3mm深的傷口4個(gè)，15min待孔內(nèi)汁液晾干后，分別向孔內(nèi)注射1×105個(gè)/mL的A.alternata孢子懸浮液20μL，3h后，再分別用濃度為5%、10%、15%、20%的納米氧化鋅溶液浸泡3min。用同樣的方法接種P.expansum，并用同樣濃度的納米氧化鋅進(jìn)行處理，以接種后無(wú)菌水處理為對(duì)照。果實(shí)處理后，用PE薄膜包裹，在（20±2）℃下貯藏。每處理用果3個(gè)，每處理重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

接種青霉的果實(shí)在8d后測(cè)定發(fā)病率及病斑直徑，接種鏈格孢的果實(shí)在10d后測(cè)定發(fā)病率及病斑直徑。發(fā)病率以發(fā)病病斑數(shù)占接種病斑數(shù)的百分率計(jì)，病斑直徑采用十字交叉法測(cè)量。數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007和SPASS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行鄧肯氏多重差異分析（p＜0.05）。柱形圖中豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同字母表示在p＜0.05水平上的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米氧化鋅處理對(duì)A.alternata和P.expansum菌落直徑的影響

納米氧化鋅處理可顯著抑制A.alternata和P.expansum菌落直徑的擴(kuò)展，且抑制效果隨濃度的升高而增強(qiáng)（圖1A，圖1B）。其中5%的納米氧化鋅顯著抑制了A.alternata菌落生長(zhǎng)（p＜0.05），菌落直徑僅為對(duì)照的47.32%，當(dāng)濃度逐漸增至20%時(shí)，菌落直徑僅為對(duì)照的23.49%（圖1A）。P.expansum對(duì)納米氧化鋅處理表現(xiàn)出較好的耐受性，當(dāng)濃度增至20%時(shí)才明顯抑制P.expansum的菌落擴(kuò)展，菌落直徑僅為對(duì)照的66.43%（圖1B），可見納米氧化鋅能有效的抑制該菌的生長(zhǎng)。

圖1 納米ZnO處理對(duì)A.alternata（A）和P.expansum（B）菌落直徑的影響Fig.1 Effects of nano-zinc oxide on mycelial growth of A.alternata（A）and P.expansum（B）

2.2 納米氧化鋅處理對(duì)A.alternata和P.expansum孢子萌發(fā)的影響

圖2 納米氧化鋅處理對(duì)A.alternata（A）和P.expansum（B）孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of nano-zinc oxide on spore germination of A.alternata（A）and P.expansum（B）

納米氧化鋅可有效抑制A.alternata（圖2A）和P. expansum（圖2B）的孢子萌發(fā)。在5%～20%的處理濃度范圍內(nèi)，二者的孢子萌發(fā)率均顯著低于對(duì)照。當(dāng)濃度為5%時(shí)，A.alternata和P.expansum的孢子萌發(fā)率分別為對(duì)照的39.07%和18.13%，隨著納米氧化鋅濃度的增加抑制效果也越好，當(dāng)濃度為15%時(shí)，A.alternata和P.expansum的孢子萌發(fā)率與同期對(duì)照相比分別降至13.54%和29.99%；當(dāng)濃度進(jìn)一步增加至20%時(shí)，納米氧化鋅對(duì)A.alternata與P.expansum孢子萌發(fā)的抑制并未進(jìn)一步增強(qiáng)，與15%濃度納米氧化鋅相比，差異不顯著（p＜0.05）。

2.3 納米氧化鋅處理對(duì)損傷接種病斑直徑的影響

納米氧化鋅處理可有效抑制損傷接種蘋果病斑直徑的擴(kuò)展，其中以濃度為5%時(shí)的處理效果最好，對(duì)損傷接種A.alternata（圖3A）和P.expansum（圖3B）病斑直徑的抑制分別為同期對(duì)照的23.76%和34.68%。但隨著濃度的升高，A.alternata病斑直徑并沒(méi)有減小，且高濃度對(duì)病斑直徑的抑制效果差異不顯著（p＜0.05）。同樣，5%～20%的納米氧化鋅處理均能顯著減小損傷接種P.expansum蘋果的病斑直徑，各處理病斑直徑均明顯低于對(duì)照，其中15%和20%濃度的納米氧化鋅處理后，蘋果病斑直徑分別為對(duì)照的43.12%和43.55%，但二者之間無(wú)顯著差異。

圖3 納米氧化鋅處理對(duì)損傷接種A.alternata（A）和P.expansum（B）蘋果病斑直徑的影響Fig.3 Effects of nano-zinc oxide on lesion diameters of apple inoculated with A.alternata（A）and P.expansum（B）

3 討論

本研究結(jié)果表明，納米氧化鋅處理可有效的抑制A.alternate和P.expansum的菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)。尤其菌落生長(zhǎng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著納米氧化鋅的濃度的增加，其對(duì)兩種真菌的抑制效果亦顯著增加，且納米氧化鋅對(duì)A.alternate的抑制作用較P.expansum強(qiáng)，可見納米氧化鋅對(duì)不同病原物的抑制作用存在差異，這可能是由于不同病原物對(duì)其的敏感性不同或納米氧化鋅對(duì)不同病原物的作用方式不同。Lili等[11]研究發(fā)現(xiàn)納米ZnO對(duì)兩種植物真菌B.cinerea和P.expansum的抗菌機(jī)制不同，他們認(rèn)為納米ZnO是通過(guò)破壞細(xì)胞的功能和引起真菌菌絲變形來(lái)抑制B.cinerea的生長(zhǎng)，而對(duì)P.expansum則是通過(guò)抑制分生孢子梗和分生孢子的生長(zhǎng)來(lái)抑制其生長(zhǎng)。而Haghighi等[17]的研究也表明TiO2/ZnO納米復(fù)合材料能夠在可見光下有效地光降解白念珠菌的生物膜從而抑制白念珠菌的繁殖。另外何臨海等[18]還發(fā)現(xiàn)納米ZnO對(duì)其他真菌具有良好的抗菌作用，但其具體作用機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

納米材料因其粒徑及各種特殊的性質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于催化、生物醫(yī)藥、精細(xì)化工等多個(gè)行業(yè)，其在果蔬防腐保鮮上的應(yīng)用已成為目前的研究熱點(diǎn)。Maneerat等[19]用納米TiO2粉末和涂有TiO2的塑料薄膜對(duì)P.expansum和果實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將青霉菌孢子和TiO2粉末均加入到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中，發(fā)現(xiàn)光催化型TiO2能夠有效減少病原真菌孢子的萌發(fā)。另外，隨著TiO2添加量的增加，它通過(guò)光催化反應(yīng)抑制青霉菌的能力越強(qiáng)，培養(yǎng)基中活的菌落數(shù)越少，且無(wú)論選擇不同種類的果實(shí)接種擴(kuò)展青霉，納米TiO2粉末和涂有TiO2的膜都表現(xiàn)出了抗真菌活性，控制了果實(shí)的腐爛。此結(jié)果說(shuō)明二氧化鈦光催化反應(yīng)對(duì)擴(kuò)展青霉顯示了抗菌活性，其對(duì)控制采后病害存在巨大潛力。本研究結(jié)果顯示，納米氧化鋅處理可抑制損傷接種蘋果果實(shí)的青霉病和黑斑病的病斑擴(kuò)展，其中5%的納米ZnO對(duì)蘋果青霉病和黑斑病的抑制效果最好，隨著濃度的增大，抑制效果并沒(méi)有增強(qiáng)，這可能與納米ZnO的作用機(jī)理[20]有關(guān)，即在一定濃度下，隨著納米ZnO質(zhì)量濃度的提高，光催化作用及鋅離子溶出原理增強(qiáng)，二者之間也具有協(xié)同或相加作用從而發(fā)揮更強(qiáng)的抗菌作用，但超過(guò)一定濃度后，納米氧化鋅的凝聚作用也增強(qiáng)，使得局部鋅離子濃度降低，反而影響了抗菌作用的發(fā)揮。另外高濃度納米氧化鋅可能影響果實(shí)的生理狀態(tài)而降低了對(duì)病原物的抗性，具體原因還需進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

4.1 5%～20%的納米ZnO均能抑制A.alternate和P.expansum菌落生長(zhǎng)，且抑制效果隨著濃度的增加而增加，對(duì)A.alternate的抑制效果優(yōu)于P.expansum。

4.2 納米ZnO可明顯抑制A.alternate和P.expansum的孢子萌發(fā)，且作用效果不同。納米ZnO濃度從5%增加到20%時(shí)，A.alternate的孢子萌發(fā)率從39.1%降到12.6%，而P.expansum在15%時(shí)孢子萌發(fā)率最低，僅為5.4%。

4.3 納米氧化鋅處理可抑制損傷接種A.alternata和P.expansum蘋果果實(shí)的病斑擴(kuò)展，在納米ZnO濃度為5%～20%范圍內(nèi)，抑制效果并沒(méi)有隨濃度的升高而增強(qiáng)，其中，5%的納米氧化鋅對(duì)蘋果青霉病和黑斑病的控制效果最好。

綜上所述，雖納米ZnO在果蔬采后病害控制中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但其具體作用機(jī)理及采后規(guī)范化應(yīng)用技術(shù)還需進(jìn)一步深入研究。

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Effects of nano-zinc oxide treatment on black spot and blue mold of postharvest apple

LIU Jin-jin1，LI Yong-cai1，*，LIU Chang-ning2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College of Chemical and Biological Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070，China）

The effect of nano-zinc oxide at different concentrations against A.alternata and P.expansum of pathogenic bacteria in postharvest apple was demonstrated.Results indicated that nano-zinc oxide inhibited significantly the mycelium growth of A.alternata and P.expansum，and the inhibition efficacy was greatly enhanced when the concentration of nano-zinc oxide was increased.The inhibited ratio of 20%of nano-zinc oxide was respectively up to 86.85%and 49.60%，the former inhibitory effect was significantly better than the latter.The spore germination of A.alternata were 87.37%lower than the control after treatment with 20%zinc oxide.While the concentration of 15%zinc oxide treatment on P.expansum spore germination，the germination rate had dropped by 94.56%compared with the control.Lesion diameter of apple inoculated with A.alternata and P.expansum were decreased by nano-zinc oxide treatment when concentration at 5%showed the most effective，the lesion diameter reduced by 76.24%and 65.32%compared with the control.The higher concentration treatment did not increase the effect.It was suggested that nano-zinc oxide treatment could directly inhibit pathogens to decrease black spot and blue mold of postharvest apple.

apple；nano-zinc oxide；alternaria alternata；penicillium expansum

TS255.3

A

1002-0306（2014）04-0327-04

2013－05－27 *通訊聯(lián)系人

劉瑾瑾（1989-），女，碩士研究生，研究方向：采后生物學(xué)。