一株酸性淀粉酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究

劉 洋，王一琰，白黎婧，相宏宇，朱洪亮，謝秋宏，*

（1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012；2.淄博國澳生物酶技術(shù)有限公司，山東淄博255000）

一株酸性淀粉酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究

劉 洋1，王一琰1，白黎婧1，相宏宇1，朱洪亮2，謝秋宏1，*

（1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012；2.淄博國澳生物酶技術(shù)有限公司，山東淄博255000）

用含有淀粉的選擇培養(yǎng)基，通過透明圈法篩選到一株產(chǎn)酸性淀粉酶的菌株，其發(fā)酵液酶活力達(dá)到123U/mL。通過形態(tài)觀察。生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析等方法初步鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus lincheniformis BW-2。對其產(chǎn)生的淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該菌株產(chǎn)生的淀粉酶最適反應(yīng)溫度為70℃；最適反應(yīng)pH為4.5，同時具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性；Ca2+和Mg2+對該酶有激活作用，Mn2+和Cu2+對該酶有抑制作用，抑制劑PMSF（苯甲基磺酰氟）及DTT（二硫蘇糖醇）對該酶活力影響較小。通過PAGE分析發(fā)現(xiàn)BW-2產(chǎn)生的淀粉酶與已知熱穩(wěn)定淀粉酶分子量或結(jié)構(gòu)可能存在差異。Bacillus lincheniformis BW-2是一株具有研究開發(fā)潛力的產(chǎn)酸性淀粉酶的菌株。

酸性淀粉酶，菌株篩選，分離鑒定，酶學(xué)性質(zhì)

α-淀粉酶[EC3.2.1.1]屬于糖苷水解酶類。它水解淀粉的α-1，4和α-1，6糖苷鍵，同時生產(chǎn)低分子量產(chǎn)物如葡萄糖、麥芽糖和麥芽糊精等。淀粉酶廣泛分布于自然界。所有植物、動物和微生物幾乎都含有淀粉酶。淀粉酶是研究較多、生產(chǎn)最早、應(yīng)用最廣和產(chǎn)量最大的一種酶，其產(chǎn)量占整個世界酶生產(chǎn)市場的30%以上[1-2]。淀粉酶在工業(yè)上被廣泛用于燃料酒精、淀粉糖漿、傳統(tǒng)釀造、食品加工和紡織退漿等行業(yè)[3-5]。

在淀粉加工過程中，淀粉酶首先在高溫下液化淀粉，淀粉漿的自然pH通常為4.5左右[6]，而大多數(shù)的商品細(xì)菌α-淀粉酶最適作用pH約為6.5左右[7]，且在低pH條件下不穩(wěn)定。因此，pH在淀粉液化前需調(diào)至5.8～6.2。然后再進(jìn)行糖化酶糖化步驟。但糖化酶的最適作用pH通常在4.5左右，因此，液化淀粉pH又必須調(diào)至酸性。兩步pH調(diào)節(jié)過程大大的增加了淀粉加工成本。雖然諾維信與杰能科兩大酶制劑公司已相繼推出最適pH為5.0的淀粉酶，但其在較低pH下酶活力明顯降低[8-11]。近年來，國內(nèi)外對酸性淀粉酶生產(chǎn)菌株做了大量研究。謝建華等[12]篩選到一株解淀粉芽孢桿菌，其產(chǎn)生的酸性淀粉酶最適pH為5.0，最適溫度為40～45℃。錢萍[13]通過復(fù)合誘變黑曲霉，獲得一株酶活力比原始菌株提高10倍的誘變株，同時該誘變株產(chǎn)生的酸性淀粉酶最適pH為4.0，且在50℃、pH4.0條件下酶活力穩(wěn)定。Sajedi等[7]分離到一株酸性淀粉酶產(chǎn)生菌Bacillus sp.KR-8104，并對其產(chǎn)生的酸性淀粉酶進(jìn)行了純化和酶學(xué)性質(zhì)分析。盡管目前對酸性淀粉酶的研究很多，但還沒有一株酸性淀粉酶菌種達(dá)到工業(yè)要求[13]。因此，篩選獲得產(chǎn)酸性淀粉酶生產(chǎn)菌株具有重要意義。

本研究從長白山溫泉口土壤中篩選到一株酸性淀粉酶生產(chǎn)菌株，對其進(jìn)行了形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析，并進(jìn)一步研究了其產(chǎn)酶的酶學(xué)性質(zhì)，同時與現(xiàn)有熱穩(wěn)定淀粉酶進(jìn)行了PAGE分析對比。該研究對酸性淀粉酶產(chǎn)生菌及其基因資源的開發(fā)提供了重要的材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究樣品 采自長白山溫泉口土壤；熱穩(wěn)定淀粉酶X1 為本實(shí)驗(yàn)室保存；可溶性淀粉 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸粉 分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈉等 分析純，北京化工廠；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；篩選培養(yǎng)基（g/L） 生玉米淀粉 300，NaNO32，KH2PO41，MgSO40.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，瓊脂20，pH4.8；種子培養(yǎng)基（g/L）

酵母浸粉5，蛋白胨10，NaCl 10，pH5.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 酵母浸粉5，蛋白胨10，NaCl 10，可溶性淀粉10，pH5.0。

超凈工作臺SW-CJ-2FD 蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9162 上海精密科學(xué)儀器有限公司；雙層小容量全溫度恒溫?fù)u床ZHWY-2102C 上海智城分析儀器制造有限公司；電子分析天平FA2204B 上海精密科學(xué)儀器有限公司；滅菌器54DWS 廈門致微儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選方法 取2g土樣，加入到裝有50mL無菌水的250mL錐形瓶中，內(nèi)有無菌玻璃珠若干，將土樣振蕩搖均后，用無菌水將其梯度稀釋，取適宜梯度稀釋液100μL，涂布于篩選培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h；待菌落長出后，用碘熏蒸；將透明圈較大的菌株分別進(jìn)行分離、純化后，發(fā)酵制取粗酶液，通過酶活力測定進(jìn)行復(fù)篩，將酶活力較高的菌株甘油保存，供進(jìn)一步菌種鑒定及酶學(xué)性質(zhì)分析用[14]。

1.2.2 粗酶液的制備 將菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37℃，150r/min培養(yǎng)48h。以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，37℃，150r/min發(fā)酵72h。將培養(yǎng)液12000r/min，離心10min上清液即為發(fā)酵粗酶液。

1.2.3 淀粉酶活力的測定 淀粉酶活力測定：根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]采用小體系DNS法測定淀粉酶活力，以2%的可溶性淀粉為底物，加入100μL 50mmol/L pH6.0的磷酸緩沖液，60℃水浴鍋內(nèi)保溫30min，迅速取出，放入冰浴內(nèi)，并向反應(yīng)體系中加入20μL，1mol/L NaOH終止反應(yīng)。然后從反應(yīng)體系中取出50μL反應(yīng)液，加入到盛有100μL去離子水的EP管內(nèi)，再加入200μL DNS溶液，沸水浴準(zhǔn)確反應(yīng)5min。從中取出20μL至96孔板內(nèi)，再加入250μL水，混合均勻后，測量540nm處吸光度值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶反應(yīng)釋放的還原糖量，從而計算淀粉酶活力。淀粉酶活力定義為：在實(shí)驗(yàn)條件下，1h釋放1mg的還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位。

1.2.4 菌株的形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn) 將復(fù)篩中酶活力較高的菌株進(jìn)行甘油保存后，分別接種于固體篩選培養(yǎng)基及液體種子培養(yǎng)基內(nèi)。37℃培養(yǎng)48h后，觀察固體平板上的菌落形態(tài)及淀粉水解圈大小，從培養(yǎng)液中吸取少量菌液在顯微鏡下觀察顯微形態(tài)。菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

1.2.5 菌株的16S rDNA序列分析 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1401R（5′-GCGTGTGTACAAGACCC-3′）擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA[17]。擴(kuò)增體系為20μL：2×rTaq 10μL，引物各0.8μL，模板0.4μL，補(bǔ)加ddH2O到20μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃4min；94℃40s，55℃50s，72℃100s，30個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物連接至TA載體后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST同源比對分析，選取同源性較高的序列經(jīng)ClustalX程序比對后，用MEGA 4.1軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。（GenBank accession number：KF311767）

1.2.6 溫度對淀粉酶活力的影響 分別測定粗酶液在pH6.0，溫度為40、50、60、70、80、90℃時的酶活力，反應(yīng)時間為30min，以酶活力最高時的相對酶活力為100%，計算其他溫度下的相對酶活力，以考察溫度對酶活力的影響。

1.2.7 pH對淀粉酶活力的影響 分別測定粗酶液在70℃，pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5時的酶活力，反應(yīng)時間為30min，以酶活力最高時的相對酶活力為100%，計算其他pH下的相對酶活力，以考察pH對酶活力的影響。

1.2.8 淀粉酶熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取一定量酶液，分別在pH4.5，70、80、90℃水浴條件下保溫處理，每隔一定時間取樣一次，并迅速冷卻，在最適條件下測定酶活力，以初始酶液為對照樣品，測定不同時間下淀粉酶的殘余活力。

1.2.9 淀粉酶pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取一定量酶液，分別在pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0條件下，70℃水浴保溫30min后，在最適條件下測定酶活力，以酶活力最高時的殘余活力為100%，計算不同pH下的殘余酶活力。

1.2.10 金屬離子及抑制劑對酶活力的影響 在酶反應(yīng)體系中分別加入Ca2+、Na+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、K+、Cu2+和Fe2+及PMSF和DTT，使其在酶反應(yīng)體系的終濃度為5mmol/L，以不加金屬離子及抑制劑的樣品為對照，分別進(jìn)行酶活力測定，以對照樣品的酶活力為100%，計算在不同金屬離子及抑制劑存在時的相對酶活力，以考察其對酶活力的影響。

1.2.11 PAGE分析淀粉酶 將BW-2發(fā)酵液，濃縮后，作PAGE分析。以菌株Bacillus lincheniformis產(chǎn)生的熱穩(wěn)定α-淀粉酶X1作為陽性對照。樣品于80℃水浴中處理10min后上樣進(jìn)行PAGE分析。同時作兩塊PAGE，電泳結(jié)束后，一塊膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，另一塊膠在含有2%可溶性淀粉的pH6.0磷酸緩沖液中浸泡振蕩1h，然后于70℃中酶解1h后用稀碘液染色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel及Origin 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

經(jīng)過水解圈法初步篩選，從200個菌落中獲得了菌落形態(tài)不同、水解圈較大的11個菌株，將它們分別分離、純化發(fā)酵培養(yǎng)后，進(jìn)行酶活力測定復(fù)篩。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中1株產(chǎn)淀粉酶活力最高，其粗酶液活力為123U/mL，高于已有文獻(xiàn)報道[4，18]。我們將該菌株暫定命名為BW-2，并對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析以及所產(chǎn)生的α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.2 菌株的形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA序列分析

形態(tài)及顯微觀察結(jié)果如圖1所示，A為形態(tài)觀察結(jié)果，B為顯微觀察結(jié)果，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，菌株在篩選培養(yǎng)基上表面干裂，呈白色，同時培養(yǎng)基上有明顯的淀粉水解圈；從顯微觀察結(jié)果可以看出，該菌株有芽孢，且明顯為短桿狀。菌株的生理生化特征見表1。由形態(tài)觀察及生理生化特征結(jié)果可以初步確定該菌株為芽孢桿菌屬。

圖1 菌株BW-2的形態(tài)觀察Fig.1 Morphological observation of the stain BW-2注：A：固體培養(yǎng)基上形態(tài)觀察；B：顯微鏡觀察（16×40）。

表1 菌株BW-2的常規(guī)生理生化反應(yīng)特征Table.1 Ttadition taxonomical properties of the strain BW-2

進(jìn)一步對菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析，提取該菌株基因組DNA，用通用引物27F和1401R，以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物約為1400bp，經(jīng)膠回收連接到TA載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。提取質(zhì)粒后，進(jìn)行測序。所測得序列大小為1402bp，在NCBI上進(jìn)行BLAST，該菌株與地衣芽孢桿菌一些種的序列同源性最高，達(dá)到99%以上，與相關(guān)菌株親緣關(guān)系見圖2。結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA序列分析，最終確定該菌株為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus lincheniformis BW-2。

2.3 溫度對酶活力的影響

圖2 BW-2菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees for 16S rDNA sequence of BW-2

溫度對酶活力的影響如圖3所示，從圖3中可以看出，該淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，同時，該酶具有較寬的反應(yīng)溫度范圍，在60～90℃時都能保持90%以上的相對酶活力。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Arikan報道的由Bacillus sp.A3-15生產(chǎn)的熱穩(wěn)定性淀粉酶最適溫度一致，同時兩者都具有較寬反應(yīng)溫度范圍[19]。

（4）對于蝦蟹養(yǎng)殖戶，政府暫無相應(yīng)補(bǔ)貼與鼓勵政策，養(yǎng)殖戶通過購買商業(yè)保險降低自身風(fēng)險。養(yǎng)殖戶自產(chǎn)自銷，基本無滯銷現(xiàn)象。土地承包商雇傭當(dāng)?shù)氐拈e置勞動力，閑置勞動力年齡一般為60周歲以上。

2.4 pH對酶活力的影響

圖3 溫度對酶活力影響Fig.3 Effect of temperature on activities of amylase

pH對酶活力的影響如圖4所示，從圖4中可以看出，該酶最適反應(yīng)pH為4.5，在3.5～7.0范圍內(nèi)，其相對酶活力可以維持在90%以上。該結(jié)果說明，菌株Bacillus lincheniformis BW-2生產(chǎn)的淀粉酶為酸性淀粉酶[12]。Liu等[20]從一種新型芽孢桿菌YX-1中提取了一種α-淀粉酶，最適作用pH同樣為4.5。但其最適作用溫度為40～50℃，大于60℃時，其酶活力顯著下降。因此Bacillus lincheniformis BW-2產(chǎn)生的淀粉酶與YX-1相比，在淀粉水解工藝中有更大的使用空間。

2.5 淀粉酶的熱穩(wěn)定性

淀粉酶的熱穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，從結(jié)果中可以看出，菌株Bacillus lincheniformis BW-2產(chǎn)生的淀粉酶在70℃保溫120min，其殘余酶活力仍能維持100%，在80℃條件下保溫120min，其殘余酶活力可以維持在82%，說明該酶在酸性條件下有良好的熱穩(wěn)定性。

2.6 淀粉酶的pH穩(wěn)定性

圖4pH對酶活力影響Fig.4 Effect of pH on activities of amylase

圖5 酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of the amylase

圖6 酶的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of the amylase

2.7 金屬離子及抑制劑對酶活力影響

金屬離子及抑制劑對酶活力的影響如圖7所示。從圖7中可以看出，與對照相比Ca2+和Mg2+對菌株Bacillus lincheniformis BW-2所產(chǎn)生的淀粉酶有激活作用。推測其可能是鈣依賴的淀粉水解酶類。Mn2+和Cu2+有抑制作用，而其他離子對淀粉酶沒有影響。抑制劑PMSF及DTT對淀粉酶活力影響較小。PMSF為絲氨酸抑制劑，可能是由于絲氨酸不是該淀粉酶的活性中心。DTT可以還原蛋白質(zhì)二硫鍵，可能是由于該蛋白質(zhì)不存在二硫鍵或二硫鍵的破壞并不影響該淀粉酶活性中心的結(jié)構(gòu)。

2.8 淀粉酶的PAGE分析

圖7 金屬離子和變性劑對酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ions and inhibitor on enzymatic activity

對BW-2發(fā)酵液和X1按1.2.11的方法處理后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，由圖8可以看出，熱穩(wěn)定淀粉酶X1和BW-2發(fā)酵液在80℃水浴10min后均有較明顯的淀粉酶水解條帶，說明BW-2生產(chǎn)的淀粉酶與熱穩(wěn)定淀粉酶X1耐熱性質(zhì)相似，在80℃的條件下，保溫10min仍有水解淀粉能力，同時，從兩者亮帶位置的差異來看，BW-2產(chǎn)生的淀粉酶與熱穩(wěn)定淀粉酶X1的分子量或結(jié)構(gòu)可能存在差異，推測其是新的淀粉酶，這一結(jié)論需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖8 淀粉酶的PAGE分析Fig.8 PAGE analysis of the amylase

3 結(jié)論

本研究使用含淀粉的選擇培養(yǎng)基，從長白山溫泉土壤中篩選到一株產(chǎn)酸性淀粉酶的產(chǎn)生菌株，其發(fā)酵液活力為123U/mL。通過形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA序列分析初步確定其為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus lincheniformis BW-2。進(jìn)一步對其酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，該淀粉酶最適反應(yīng)溫度為70℃，最適反應(yīng)pH為4.5；在pH4.5的條件下，70℃和80℃保溫120min，其殘余活力分別為100%和82%，說明其有較好的熱穩(wěn)定性，pH4.5～7.0，70℃保溫30min，其殘余活力均可維持在90%以上，說明其具有較好的pH穩(wěn)定性。通過研究金屬離子及抑制劑對酶活力影響發(fā)現(xiàn)，Ca2+和Mg2+對該淀粉酶有激活作用，Mn2+和Cu2+有抑制作用，抑制劑PMSF及DTT對該淀粉酶活力影響較小。通過PAGE分析發(fā)現(xiàn)BW-2產(chǎn)生的淀粉酶與已知熱穩(wěn)定淀粉酶分子量或結(jié)構(gòu)可能存在差異。本研究為菌株下一步的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，菌種改良及酸性淀粉酶的應(yīng)用，提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和材料基礎(chǔ)。

[1]Rana N，Walia A，Gaur A.α-Amylases from microbialsources and its potential applications in various industries[J].National Academy Science Letters，2013，36（1）：9-17.

[2]Maarel V D M，Bart V D V，Joost C M，et al.Properties and applications of starch converting enzymes of the a-amylase family[J].Journal of Biotechnology，2002，94：137-155.

[3]劉旭東，徐巖.一種新的中溫酸性α-淀粉酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)報，2008，14（2）：235-239.

[4]王曉燕，高潤池，廖昌瓏，等.Geobacillus sp.A27的分離篩選及其淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（1）：151-155.

[5]Pandey A，Nigam P，Soccol C R，et al.Advences in microbial amylases[J].Biotechnology and Applied Biochemistry，31（Pt2），2000：135-152.

[6]Sivaramakrishnan S，Gangadharan D，Nampoothiri K M，et al. Alpha-amylases from microbial sources-an overview on recent developments[J].Food Technology and Biotechnology，2006，44（2）：173-184.

[7]Sajedi R H，Naderi-Manesh H，Khajeh K，et al.A Caindependent alpha-amylase that is active and stable at low pH from the Bacillus sp.KR-8104 [J].Enzyme and Microbial Technology，2005，36（5-6）：666-671.

[8]Goyal N，Gupta J K，Soni S K.A novel raw starch digesting thermostable α-amylase from Bacillus sp.I-3 and its use in the direct hydrolysis of raw potato starch[J].Enzyme and Microbial Technology，2005，37：723-734.

[9]Gupta R，Gigras P，Mohapatra H，et al.Microbial α-amylase：a biotechnologicalperspective [J].Process Biochemistry，2003，38：1599-1616.

[10]Crab W，Mitchinson C.Enzymes involved in the processing of starch to sugars[J].Trends Biotechnology，1997，15：349-352.

[11]Shoji H，Toshikazu S，Kenji H，et al. Simultaneous production of glucoamylase and acid-stable α-amylase using novel submerged culture of Aspergillus kawachii NBRC4308[J]. Jounal of Bioscience and Bioengineering，2007，103：203-205.

[12]謝建華，師永生，杜麗琴，等.一株產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株的篩選、純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2011，17（1）：95-99.

[13]錢萍.酸性淀粉酶菌株的誘變選育及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技，2011，33（11）：183-186.

[14]馮旭明，遲乃玉，張慶芳.低溫淀粉酶菌株C2的分離鑒定及其產(chǎn)低溫淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)[J].微生物學(xué)通報，2011，38（12）：1762-1767.

[15]劉洋，唐芳榮，相宏宇，等.小體系高通量比色測定糖化酶活力新方法[J].中國釀造，2012，31（7）：140-143.

[16]Hot G J，Krieg R N，Sneath HAP，et al.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology[M].9th ed.Baltimore：Williams and Wilkins，1994.

[17]張保國，唐玲李祖明，等.阿維菌素殺蟲劑對甘藍(lán)葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J].環(huán)境科學(xué)，2009，30（5）：1291-1297.

[18]秦臻，蔡素梅，黃鈞，等.一株產(chǎn)生淀粉分解酶犁頭霉的分離鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)[J].微生物學(xué)通報，2011，38（5）：729-735.

[19]Burhan Arikan.Highly thermostable，thermophilic，alkaline，SDS and chelator resistant amylase from a thermophilic Bacillus sp.isolate A3-15[J].Bioresource Technology，2008，99：3071-3076.

[20]Xu D L，Yan X.A novel raw starch digesting α-amylase from a newly isolated Bacillus sp.YX-1：Purification and characterization[J].Bioresource Technology，2008，99：4315-4320.

Study on isolation and identification of acidic α-amylase producing strain and enzymatic properties

LIU Yang1，WANG Yi-yan1，BAI Li-jing1，XIANG Hong-yu1，ZHU Hong-liang2，XIE Qiu-hong1，*
（1.School of Life Science，Jilin University，Changchun 130012，China；2.Zibo Guoao Biological Enzyme Technology Co.，Ltd.，Zibo 255000，China）

An acidic α-amylase producing strain was screened through screening medium supplemented with starch by the method of hydrolysis halo，and the amylase activity of the fermentation broth was 123U/mL.The stain was identified as Bacillus lincheniformis by morphology observation，physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis，and was named as Bacillus lincheniformis BW-2.The enzymatic properties of the amylase were also investigated.The optimum pH and temperature of the amylase was 4.5 and 70℃，respectively.It also showed excellent thermostability and pH stability.The amylase activity was activated by Ca2+and Mg2+，whereas，it was inhibited by Mn2+and Cu2+.Meanwhile，these inhibitors PMSF and DTT had little effect on the enzyme activity.The molecular weight and structure of the amylase from BW-2 maybe was different from the known thermostable amylase by PAGE analysis.BW-2 was an acidic amylase producing strain which showed research and development potential.

acidic amylase；screening；isolation and identification；enzymatic properties

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0174-05

2013－07－16 *通訊聯(lián)系人

劉洋（1983-），男，在讀博士研究生，主要從事微生物酶方面的研究。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81072564）；吉林省科技廳科技發(fā)展計劃重點(diǎn)項(xiàng)目（20090945）。