在線SPE液質(zhì)聯(lián)用法分析原料糖漿中2-氨基乙酰苯

陳 盛，金 燕，劉綠葉，*

（1．浙江省臺(tái)州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院，浙江臺(tái)州318000；2．賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司，上海201203）

在線SPE液質(zhì)聯(lián)用法分析原料糖漿中2-氨基乙酰苯

陳 盛1，金 燕2，劉綠葉2，*

（1．浙江省臺(tái)州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院，浙江臺(tái)州318000；2．賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司，上海201203）

建立了一種采用在線SPE對(duì)糖漿中的2-氨基乙酰苯進(jìn)行了富集、濃縮與去除有機(jī)雜質(zhì)干擾樣品前處理方式，同時(shí)采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS）對(duì)樣品中2-氨基乙酰苯（2-AP）進(jìn)行了準(zhǔn)確定性與定量分析的方法。在線SPE柱：采用100%親水的Acclaim PA柱（4.0mm×30mm，5.0μm），分析柱采用ODS柱（2.1mm×150mm，3.0μm）；質(zhì)譜方法，采用ESI源選擇反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（SRM）模式，自動(dòng)優(yōu)化了S-Lens、CE等參數(shù)。結(jié)果表明：該方法的線性回歸方程Y=-12123.6+33480.1X，相關(guān)系數(shù)r為0.9999，線性范圍為0.3～150ng/mL，進(jìn)樣體積10.0μL，檢出限（以S/N=3計(jì)）為0.03ng/mL，樣品加標(biāo)回收率達(dá)93%以上。采用該方法對(duì)3份不同的生產(chǎn)工藝糖漿樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果表明均小于儀器檢出限。

2-氨基乙酰苯，在線SPE，液質(zhì)聯(lián)用，糖漿

2-氨基乙酰苯（2-aminoacetophenone，簡(jiǎn)寫為2-AP），是許多食品（如葡萄酒、果葡糖漿）中經(jīng)常出現(xiàn)的一種重要的、具有芳香活性的微量物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。1993年，人們發(fā)現(xiàn)含有2-AP的白葡萄酒中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一種類似于衛(wèi)生球、地板漆、濕羊毛或者是雜醇酒精的口味，當(dāng)酒中的2-AP濃度超過(guò)了某個(gè)感官閾值時(shí)，就會(huì)造成所謂“非典型老化（untypical aging）”的不良風(fēng)味，簡(jiǎn)稱為“UTA”現(xiàn)象，這種UTA現(xiàn)象的存在會(huì)嚴(yán)重影響葡萄酒的口感和風(fēng)味。后來(lái)也有文獻(xiàn)記錄2-AP有可能存在于果葡糖漿中，導(dǎo)致了果葡糖漿產(chǎn)生UTA現(xiàn)象，影響產(chǎn)品正常的風(fēng)味和口感[1-3]。因此，對(duì)于廣大的果葡糖漿生產(chǎn)企業(yè)而言，2-AP的含量是一項(xiàng)必須的檢測(cè)項(xiàng)目，以便能更好地預(yù)防控制和減少2-AP產(chǎn)生，以提高產(chǎn)品質(zhì)量，滿足市場(chǎng)需求。

2-氨基乙酰苯的檢測(cè)方法有多種，由于其含有苯環(huán)（見(jiàn)圖1），有較強(qiáng)的紫外吸收，且極性較弱，比較適合于反相液相色譜分離。ISBT方法[4]規(guī)定使用液相色譜紫外檢測(cè)器對(duì)該化合物進(jìn)行了分析，進(jìn)樣體積300μL，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，但該方法由于采用進(jìn)樣體積較大，且在低波長(zhǎng)測(cè)定，使得基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重，不能進(jìn)行準(zhǔn)確的定性與低含量的定量分析。Fan等[5]建立了浸入式固相微萃取法（DISPME）和GC-MS聯(lián)用法對(duì)2-AP進(jìn)行了快速檢測(cè)，采用內(nèi)標(biāo)法定量。整個(gè)分析時(shí)間需要約為40min，檢測(cè)限為0.5～1.0μg/L，該方法分析時(shí)間較長(zhǎng)，且前處理耗材使用的成本較高。因此，本文采用了在線SPE液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)2-AP進(jìn)行了分析。采用在線SPE方法對(duì)樣品進(jìn)行了富集與基質(zhì)去除，前處理更為快速；同時(shí)，采用了液相色譜與三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用的方法，在反相條件下對(duì)2-AP與糖漿中的雜質(zhì)進(jìn)行了分離，選擇反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行了準(zhǔn)確的定性與低含量的定量檢測(cè)。該方法具有快速，易操作，方便，重復(fù)性好，檢測(cè)限低等的特點(diǎn)，適合用于糖漿中2-AP的分析，對(duì)相關(guān)企業(yè)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及科研分析工作者具有一定的參考和借鑒意義。

圖1 2-氨基乙酰苯分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of 2-aminoacetophenone

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糖漿 來(lái)自某糖漿生產(chǎn)企業(yè)（批號(hào)分別為：20130201、20130301、20130401）；乙腈、甲醇、甲酸HPLC級(jí)，Thermo Fisher Scientific公司；2-氨基乙酰苯（CAS號(hào)：5468-37-1） 標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%），Sigma-Aldrich公司；超純水 美國(guó)Millipore公司；其他未注明試劑 均為分析純。

UltiMate 3000超高效液相色譜儀 Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)，主要配制：泵（內(nèi)置脫氣機(jī)，集成了左、右兩個(gè)泵），型號(hào)：DGP-3600RS；自動(dòng)進(jìn)樣器，型號(hào)：WPS-3000TSL（帶自動(dòng)清洗針功能）；TCC-3000RS柱溫箱 裝有一個(gè)六通閥；TSQ Vantage三重四極桿質(zhì)譜儀 Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)；色譜工作站 Chromeleon 6.8 SR10；質(zhì)譜工作站Xcalibur 2.2；根據(jù)以上儀器模塊，配制成在線SPE液質(zhì)聯(lián)用模式，示意圖見(jiàn)圖2。

1.2 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品處理

圖2 在線SPE液質(zhì)聯(lián)用示意圖Fig.2 The figure of online SPE HPLC-MS/MS

樣品前處理：精確稱取樣品3.0g，放入10mL進(jìn)樣瓶中，用含2%H3PO4的超純水定量到10mL，在100℃下加熱5min后，待冷卻至室溫，經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾，裝瓶并待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取2-AP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量0.300g于100mL容量瓶中，加入25mL HPLC級(jí)乙腈，用超純水定容至刻度，搖勻后制成0.300mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后用超純水逐級(jí)稀釋分別得到0.3、3.0、15.0、30.0、150.0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品，分別經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾后裝瓶，待測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件與方法

色譜條件：分析柱：Acclaim 120 C18（2.1mm× 150mm，3.0μm）；在線SPE柱：Acclaim PA C16（4.0mm× 30mm，5.0μm）。流動(dòng)相為乙腈與0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，其中，右泵提供分析柱洗脫流動(dòng)相，左泵提供SPE分析洗脫流動(dòng)相，見(jiàn)表1。進(jìn)樣體積：10.0μL。

質(zhì)譜條件：ESI源，正離子模式，霧化溫度：450℃，干燥氣：2.06×105Pa，輔助氣：3.44×105Pa，霧化電壓：3.0KV。定性定量掃描模式：選擇反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（SRM），碎片離子1：m/z 136.0～91.1，CE 24V；S-lens：56.0；碎片離子2：m/z 136.0～118.1，CE 14V；S-lens：56.0；碎片離子3：m/z 136.0-65.1 CE 36V；S-lens：56.0，其中碎片離子1為定量離子。

在線SPE六通閥切換時(shí)間：0min，閥位置1-2，SPE柱上樣；2.2min，閥位置6-1，SPE柱洗脫；3.5min，閥位置1-2，SPE柱平衡/再生，分析柱開(kāi)始分析。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table.1 The gradient elution condition of mobile phase

2 結(jié)果與討論

2.1 在線SPE選擇及質(zhì)譜條件優(yōu)化

在線SPE條件選擇：本方法參考了相關(guān)在線SPE文獻(xiàn)方法[6-7]，采用了更為親水的C16小柱做為SPE柱，在0～2.2min內(nèi)，糖漿樣品中的親水性基質(zhì)化合物，被洗脫入廢液，而在2.2～3.5min，2-AP被洗脫下來(lái)，經(jīng)過(guò)六通閥切入分析柱ODS柱中，3.5min后，SPE小柱進(jìn)入再生模式，而分析柱開(kāi)始進(jìn)入梯度洗脫分析。因此，該步驟去除掉了樣品中的基質(zhì)以及前處理樣品使用到的磷酸溶液等。

質(zhì)譜條件優(yōu)化：通過(guò)Xcalibur質(zhì)譜工作站，分別自動(dòng)優(yōu)化了S-lens，碰撞能量（CE），以及離子源霧化參數(shù)，最終選擇了三對(duì)碎片離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析。

表2 樣品加標(biāo)回收率結(jié)果Table.2 The results of recovery of spiked samples

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖及線性關(guān)系

參考“1.3”項(xiàng)中的條件與方法，分別對(duì)0.3、3.0、15.0、30.0、150.0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10.0μL，譜圖見(jiàn)圖3（以0.5ng/mL為例），以質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度（Intensity）與峰寬（min）的乘積即峰面積為縱坐標(biāo)Y，2-氨基乙酰苯濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性擬合，得線性回歸方程為：回歸方程為Y=-12123.6+33480.1X，相關(guān)系數(shù)r為0.9999，如圖4所示。

圖3 2-氨基乙酰苯標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 Chromatogram of 2-AP standard solution

圖4 2-氨基乙酰苯標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curve of 2-AP

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)15.0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了分析，連續(xù)進(jìn)樣了6針（進(jìn)樣體積10.0μL），保留時(shí)間（RT）為7.76min；峰面積平均值為538625，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為4.5%，重現(xiàn)性較好。

2.4 樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取空白樣品3份，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按照“1.3”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定（每份測(cè)定3次），根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算結(jié)果，然后計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2，回收率在93.3%～102.0%之間，回收率較好。

2.5 儀器檢出限

分析了標(biāo)準(zhǔn)溶液最低濃度點(diǎn)0.03ng/mL，進(jìn)樣體積為10μL，其信噪比達(dá)到3.0以上。因此，得出對(duì)2-氨基乙酰苯的儀器最低檢出限（LOD，以S/N=3計(jì)），達(dá)到0.03ng/mL。

2.6 實(shí)際樣品含量測(cè)定

對(duì)某生產(chǎn)企業(yè)提供的三份糖漿樣品分別進(jìn)行了兩次平行測(cè)定，結(jié)果均小于儀器的檢出限。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)TSQ vantage質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，同時(shí)采用online SPE在線富集濃縮的技術(shù)，具有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：a.可以去除干擾，如原料糖中的糖漿，還有提取用的磷酸；b.可以降低檢出限，最終達(dá)到0.03ng/mL；c.采用在線SPE技術(shù)比離線處理更快，重現(xiàn)性更好。因此，該方法適合用于糖漿或釀酒行業(yè)對(duì)2-氨基乙酰苯的分析要求，具有一定的推廣與借鑒意義。

[1]許世楓，黃立新，徐正康.果葡糖漿中的2-氨基乙酰苯及其檢測(cè)方法綜述[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（3）：110-113.

[2]Katrin Hoenicke，Thomas J Simat，Hans Steinhart.Untypical aging off-flavor in wine：formation of 2-aminoacetophenone and evaluation of its influencing factors[J].Analytica Chimica Acta，2002，458：29-37.

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Determination of 2-aminoacetophenone in syrup by online SPE HPLC-MS/MS

CHEN Sheng1，JIN Yan2，LIU Lv-ye2，*
（1.Taizhou Institution of Quality and Technical Supervision and Inspection，Taizhou 318000，China；2.Thermofisher Scientific Co.，Ltd.，Shanghai 201203，China）

An analytical method for determination of 2-aminoacetophenone in different Syrup by online SPE and HPLC MS/MS was developed which online SPE could enrich the target and remove the interference and HPLC-MS/MS could determine and quantitate of 2-aminoacetophenone.The SPE column was Acclaim PA（4.0mm×30mm），and the analytic column was ODS（2.1mm×150mm，3.0μm），and the Mass Spectrometry’s parameters（S-lens，CE，etc.）were automatic optimization with SRM mode.The results showed that the calibration formula was Y=-12123.6+33480.1X，the correction coefficient was above 0.9999，and the calibration curve was linear in the range of 0.3～150ng/mL，injection volume was 10.0μL and the detection limit of the method（with S/N=3）was 0.03ng/mL，the recoveries of spiked samples were more than 93%.Then 3 different samples were analyzed with this method，the contents were not detected.

2-ainoacetophenone；online SPE；HPLC MS/MS；syrup

TS247

A

1002-0306（2014）04-0076-03

2013－07－30 *通訊聯(lián)系人

陳盛（1983-），男，碩士研究生，研究方向：食品的檢測(cè)技術(shù)研發(fā)和質(zhì)量管理。