微波輔助從羊肺中提取肝素鈉的工藝研究

師希雄，馮瑞章，王曉娟，余群力*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室，四川宜賓644000）

微波輔助從羊肺中提取肝素鈉的工藝研究

師希雄1，馮瑞章2，王曉娟1，余群力1*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室，四川宜賓644000）

以羊肺為原料，采用微波輔助法及鹽解、沉淀劑除蛋白質(zhì)的方法提取和分離肝素鈉。在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計L9(34)正交試驗確定最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，最佳提取工藝為料液比1∶15（g∶mL），微波作用時間180 s，微波功率480 W，沉淀劑用量為0.8%，此條件下肝素鈉得率為294.78 mg/kg。

羊肺；肝素鈉；提??；微波；工藝優(yōu)化

肝素是由葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、氨基葡萄糖與硫酸聚合而成的黏多糖，其結(jié)構(gòu)為四糖單元所組成的聚合物，肝素鈉是分子質(zhì)量不同的酸性黏多糖相混合的硫酸氨基多糖的鈉鹽[1]。肝素鈉是一種很好的抗凝血藥物，主治血栓、心臟病和腎病等，現(xiàn)在認為肝素鈉通過激活抗凝血酶而發(fā)揮抗凝血作用，近幾年發(fā)現(xiàn)在臨床上的新用途有：治療肺間質(zhì)纖維化、骨關(guān)節(jié)炎、小兒急性偏癱、慢性腎小球腎炎，抗炎、抗過敏、抗病毒、抑制癌細胞增殖以及增進人體免疫功能等生物活性[2-5]。

我國畜禽副產(chǎn)物極其豐富，據(jù)統(tǒng)計，每年羊的臟器產(chǎn)量就達到200多萬t，其中，肺臟與腸粘膜中肝素鈉含量豐富，這為肝素鈉的生產(chǎn)提供了豐富的原料，但是，目前羊臟器制藥的利用率還很低，一部分以食料的形式出售和加工，一部分未被利用，這樣不僅附加值非常低，而且浪費資源，污染環(huán)境，因此，有必要利用羊的臟器開發(fā)具有抗凝血、抗血栓等功能的肝素鈉。

肝素鈉提取方法有鹽析法、超聲波輔助法、酶解法或者結(jié)合使用[6-9]。近年來，微波輔助技術(shù)在有效成分的提取方面得到廣泛應(yīng)用，該技術(shù)具有加熱效率高、選擇性高、穿透力強、提取時間較短的特點，利用微波對細胞的破壁和加熱作用，可加速有效成分的快速溶出[10-12]。以羊肺為原料，采用微波輔助的方法制備肝素鈉的研究鮮有報道，本試驗以羊肺為材料，采用微波輔助的方法提取肝素鈉，以便為肝素鈉的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品：貴州迪大生物有限公司；氯化鈉、乙醇（95%vol）、明礬、氫氧化鈉、硫酸、硼砂、D254離子交換樹脂吸附劑均為分析純：杭州恒鑫達化工有限公司。

羊肺來自蘭州大尾羊。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2B組織搗碎勻漿機：金壇市醫(yī)療儀器廠；85-2恒溫磁力攪拌器：常州國華電器有限公司；PH-3C型酸度計：上海佑科儀器儀表有限公司；HH-S8型電熱恒溫?zé)崴郏罕本┛苽ビ琅d儀器有限公司；BPZ-6930LC真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHB-IIIG真空抽濾機：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；756P紫外-可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；HX-Z電子天平：慈溪市天東衡器廠；洗脫柱Φ30 mm×300 mm：大連日普利科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肝素鈉的提取工藝流程[13]

1.3.2 操作要點

（1）預(yù)處理：稱取解凍后的羊肺100 g，按照一定的料液比加入一定量的水，在組織搗碎機中搗碎至肉糜狀，然后用2 mol/L NaOH將pH值調(diào)至8.7[9]。另外，將樹脂用2 mol/L NaOH浸泡6～7 h將其活化，保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）微波處理羊肺：將肉糜按設(shè)計的微波功率與作用時間進行處理。

（3）提取：在微波處理后的肉糜中，加入樣品量5%的NaCl，60℃下每隔10 min攪拌30 s，連續(xù)進行該操作2 h，之后立刻升溫至95℃，靜置10 min沉淀蛋白，用100目篩過濾，收集濾液。

（4）吸附：待濾液冷卻到50℃，用2 mol/L NaOH將pH值調(diào)至8.5，然后加入8%的樹脂（蒸餾水沖至中性），50℃下于恒溫磁力攪拌器中連續(xù)吸附8 h，然后用100目篩過濾，收集樹脂備用。

（5）洗滌與洗脫：將樹脂裝入洗脫柱，用蒸餾水反復(fù)沖洗3～5次直至無色，用1.2 mol/L的NaCl浸泡洗滌樹脂30 min，棄濾液。先將5 mol/L的NaCl加入樹脂洗脫柱中浸泡3 h，用三角瓶收集浸提液；再用3.5 mol/L的NaCl浸泡2 h，用同一個三角瓶收集液體，重復(fù)此操作2次，濾液三角瓶中備用。

（6）沉淀：在濾液中加入0.8%（質(zhì)量比）的明礬，在50℃下處理1 h，用濾紙過濾，收集濾液。在濾液中加入1.5倍體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，充分搖勻后靜置12 h，真空抽濾，保留固體。

（7）粗品干燥：將抽濾得到的固體物料在真空干燥箱中60℃干燥至質(zhì)量恒定，得到肝素鈉粗品。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，配成482 μg/mL肝素鈉水溶液，再按0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL的質(zhì)量濃度梯度，分別吸取不同體積的肝素鈉水溶液，用蒸餾水定容到1 mL，向每份溶液中分別加入3 mL含0.025 mol/L硼砂的體積分?jǐn)?shù)為90%硫酸溶液，然后充分搖勻，放在90℃水浴中，連續(xù)攪動10 min后取出，冷卻至室溫，30 min后采用紫外-可見分光光度計測定波長298 nm時的吸光度值（另做不加肝素鈉，用水代替的空白試驗作為對照），重復(fù)3次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

1.3.4 肝素鈉含量的測定

肝素鈉粗品用四分法取出后，用蒸餾水定容到25 mL的容量瓶中配制成待測液，吸取1 mL待測液加入玻璃管中，再加入3 mL含0.025 mol/L硼砂的90%硫酸溶液，搖勻，在90℃的水浴中加熱10 min，同時，不斷攪動，然后冷卻至室溫，30 min后采用紫外-可見分光光度計測定波長298 nm時的吸光度值（另做不加肝素鈉，用水代替的空白試驗作為對照），重復(fù)三次，取平均值。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上可得到提取物中肝素鈉的含量[7]。肝素鈉得率計算公式如下：

式中：A為樣品所測得的吸光度值；M總為所得肝素鈉粗品的總質(zhì)量，g；m溶為溶解在25 mL容量瓶中肝素鈉的質(zhì)量，g；m樣為所取羊肺樣品的質(zhì)量，g；25為定溶于25 mL容量瓶中；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.5 單因素試驗

（1）微波作用時間

在料液比1∶15（g∶mL），微波功率480 W，沉淀劑用量0.8%的條件下，考察微波作用時間（90 s、120 s、150 s、180 s、210 s）對肝素鈉得率的影響，重復(fù)3次。

（2）微波功率

在料液比1∶15（g∶mL），微波作用時間180 s，沉淀劑用量0.8%的條件下，考察微波功率（273 W、373 W、480 W、587 W、693 W）對肝素鈉得率的影響，重復(fù)3次。

（3）料液比

在微波功率480 W，微波作用時間180 s，沉淀劑用量0.8%的條件下，考察料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））對肝素鈉得率的影響，重復(fù)3次。

（4）沉淀劑用量

在微波功率480 W，微波作用時間180 s，料液比1∶15的條件下，考察沉淀劑用量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）對肝素鈉得率的影響，重復(fù)3次。

1.3.6 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）正交試驗，確定肝素鈉提取的最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品進行吸光度值測定，依據(jù)測定結(jié)果得到肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of heparin sodium

以肝素鈉質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，肝素鈉在波長298 nm處的吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，根據(jù)測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程為：Y=0.003 9X+0.052，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，表明二者線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 微波作用時間對肝素鈉得率的影響

圖2 微波作用時間對肝素鈉得率的影響Fig.2 Effect of microwave time on heparin sodium yield

圖2反映了微波作用時間對肝素鈉得率的影響，由圖2可知，隨著微波作用時間的增加，肝素鈉的得率不斷升高，當(dāng)微波作用時間達到180 s時，得率達到最高值，繼續(xù)增加微波作用時間時，肝素鈉得率開始降低。這可能由于多糖類物質(zhì)在高溫下容易分解，在提取初期，肝素鈉能夠被不斷浸出，但是，隨著作用時間的延長，溫度逐漸升高，部分肝素鈉被熱解，從而使得率下降[14]。因此，微波作用時間180 s較好。

2.2.2 微波功率對肝素鈉得率的影響

圖3 微波功率對肝素鈉得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on heparin sodium yield

圖3反映了微波功率對肝素鈉得率的影響，由圖3可知，當(dāng)微波功率在273～480 W范圍內(nèi)時，隨著微波功率的增加，肝素鈉的得率呈顯著上升的趨勢，功率達到480 W時，得率達到最高值。然而，當(dāng)微波功率進一步增加時，肝素鈉得率不斷下降。這可能是因為微波功率過大造成溫度過高使多糖部分分解，從而使得率下降[15]。因此，選擇微波功率480 W較好。

2.2.3 料液比對肝素鈉得率的影響

圖4 料液比對肝素鈉得率的影響Fig.4 Effect of l material liquid ratio on heparin sodium yield

圖4反映了料液比對肝素鈉得率的影響，由圖4可知，當(dāng)液料比在1∶5～1∶15（g∶mL）范圍內(nèi)時，隨著料液比的增加，肝素鈉得率明顯提高，當(dāng)料液比在1∶15～1∶25（g∶mL）范圍內(nèi)時，肝素鈉得率呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。故選擇料液比為1∶15（g∶mL）最佳。

2.2.4 沉淀劑用量對肝素鈉得率的影響

圖5 沉淀劑用量對肝素鈉得率的影響Fig.5 Effect of precipitation agent addition on heparin sodium yield

圖5反映了沉淀劑用量對肝素鈉得率的影響，由圖5可知，當(dāng)沉淀劑用量在0.4%～0.8%范圍內(nèi)時，隨沉淀劑用量的增大，肝素鈉得率呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，然而，在沉淀劑的用量＞0.8%后，肝素鈉得率開始下降。因此，從降低生產(chǎn)成本的角度考慮，沉淀劑用量選擇0.8%較好。

2.3 正交試驗結(jié)果

綜合單因素試驗結(jié)果，設(shè)計L9（34）正交試驗，因素水平見表1，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 肝素鈉提取條件工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for heparin sodium extraction conditions optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

由表2可知，4種因素對肝素鈉得率影響的主次順序為：C＞B＞D＞A，即對肝素鈉得率影響最大的因素是料液比，然后依次是微波作用時間，沉淀劑用量，微波功率。最佳的提取條件為A2B2C2D2。即微波功率為480 W，微波作用時間為180 s，料液比為1∶15，沉淀劑用量為0.8%。在最優(yōu)提取條件下進行驗證試驗，得到肝素鈉的得率為294.78 mg/kg。

由表3可知，微波功率、微波作用時間、料液比、沉淀劑用量對肝素鈉得率均有極顯著地影響（P<0.01）。

3 結(jié)論

微波輔助從羊肺中提取肝素鈉的最佳工藝條件為：料液比1∶15（g∶mL），微波作用時間180 s，微波功率480 W，沉淀劑用量0.8%。在此條件下，羊肺中肝素鈉得率為294.78 mg/kg。各因素對肝素鈉得率均有極顯著地影響，影響的大小次序為料液比＞微波作用時間＞沉淀劑用量＞微波功率。采用該工藝提取肝素鈉操作簡單，為羊肺的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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Microwave-assisted extraction technology of heparin sodium from sheep lung

SHI Xixiong1,FENG Ruizhang2,WANG Xiaojuan1,YU Qunli1*
(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province,Yibin University,Yibin 644000,China)

Using sheep lung as raw material,heparin sodium was separated and extracted by microwave-assisted method,salt-solution and precipitant deproteinization method.L9(34)orthogonal test was designed to determine the optimum process conditions on the basis of single factor test.The results indicated that the optimum extraction process was material liquid ratio 1∶15(g∶ml),microwave time 180 s,microwave power 480 W,precipitation agent addition 0.8%.Under these conditions,the heparin sodium yield was 294.78 mg/kg.

sheep lung;heparin sodium;extraction;microwave;technology optimization

S872

A

0254-5071（2014）10-0028-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.007

2014-07-08

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（CARS-38）

師希雄（1977-），男，講師，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。

*通訊作者：余群力（1962-），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。