白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中兩株產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的分離鑒定

袁春紅，宋菲菲，林凱，向文良，張慶

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039）

白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中兩株產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的分離鑒定

袁春紅，宋菲菲，林凱，向文良，張慶*

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039）

利用羧甲基纖維鈉（CMCNa）平板篩選法，從白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中分離得到12株產(chǎn)纖維素酶菌株，其中菌株M34和菌株N2的比酶活最大，被選為后續(xù)研究對(duì)象。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征觀察，生理生化特性分析并結(jié)合16S rRNA序列分析，鑒定菌株M34和菌株N2分別為環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和內(nèi)生芽孢桿菌（Bacillus endophyticus）。菌株經(jīng)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，運(yùn)用DNS法測(cè)定纖維素酶系酶活力，結(jié)果表明菌株N2的各酶活均高于菌株M34，其羧甲基纖維素酶活為0.132 U/mL，微晶纖維素酶活為0.012 U/mL，濾紙酶活為0.041 U/mL，β-葡萄糖苷酶活為0.158 U/mL。

黃水；纖維素酶；篩選；鑒定；酶活

纖維素酶是一類誘導(dǎo)型多酶復(fù)合體，通常由內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶3種具有不同催化反應(yīng)功能的酶組成，幾種酶協(xié)同作用催化纖維素水解為葡萄糖[1]。目前，纖維素酶已在發(fā)酵工業(yè)、造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、日用化工、廢水處理、動(dòng)物食料的加工等各個(gè)領(lǐng)域得到了應(yīng)用，其前景十分廣闊。在白酒釀造過(guò)程中，纖維素酶對(duì)原料中的纖維素進(jìn)行降解，破壞間質(zhì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使其包含的淀粉釋放出來(lái)，以利于糖化酶的作用，從而起到提高原料利用率、提高發(fā)酵率和縮短發(fā)酵時(shí)間的效果[2]?？梢援a(chǎn)生纖維素酶的微生物包括真菌、細(xì)菌、放線菌以及部分古菌和酵母菌[3]。但目前大多數(shù)研究主要集中于真菌，鑒于細(xì)菌繁殖和產(chǎn)酶速度快、發(fā)酵周期短，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，近年來(lái)關(guān)于細(xì)菌特別是極端環(huán)境中篩選到細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的研究也越來(lái)越受到重視[6]。

黃水是中國(guó)傳統(tǒng)白酒釀造過(guò)程中的副產(chǎn)物，含有大量的有機(jī)酸、醇、醛、酯等呈香呈味物質(zhì)，還有氨基酸、糖類、腐殖質(zhì)及菌體細(xì)胞等，其pH值為2.5～4.0，構(gòu)成了極端復(fù)雜的微生物生長(zhǎng)環(huán)境[7]。迄今為止，關(guān)于篩選產(chǎn)纖維素酶菌株的報(bào)道大多限于從土壤、糞便、水體中分離的菌株，未見(jiàn)有從黃水中篩選產(chǎn)纖維素酶菌株的報(bào)道[8]。本研究從白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水中篩選出了產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌，并對(duì)其形態(tài)、生理生化特征、16S rRNA序列及纖維素酶系活力進(jìn)行初步分析，為窖池中黃水的再次發(fā)酵回用，以促進(jìn)原料中纖維素的水解、提高發(fā)酵效率等生產(chǎn)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也為纖維素酶的研究提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃水樣品：四川水井坊提供；麩皮：成都當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)市售；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMCNa）（分析純）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；Kovacs氏試劑盒、硝酸鹽還原試劑盒：青島海博生物技術(shù)有限公司；TaKaRa聚合酶、DH5α感受態(tài)細(xì)胞：TaKaRa Biotechnology（大連）；pGM-T試劑盒、MarkerⅦ：天根生化科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒：OMEGA公司；Whatman NO.1濾紙：Whatman公司；D-（-）水楊苷（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；微晶纖維素（化學(xué)純）、3,5-二硝基水楊酸（化學(xué)純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AllegraX-15R冷凍離心機(jī)：貝克曼庫(kù)爾特公司；720BR/ 01492電泳凝膠成像分析系統(tǒng)、BiometraT1PCR儀：BIO-RAD公司；SGSP-02恒溫培養(yǎng)箱：黃石恒豐器械有限公司；ZHWY空氣浴恒溫振蕩器：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；WFJ-7200可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的分離與純化

取1 mL黃水用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)梯度取0.1 mL涂布于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行反復(fù)劃線純化，將純化的菌種編號(hào)、保存。

1.3.2 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選

將純化后的菌株點(diǎn)接于篩選培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2d，然后向培養(yǎng)平板上加入適量碘液染色2 min[10]。若菌株周圍有透明水解圈出現(xiàn)，則說(shuō)明該菌株產(chǎn)生纖維素酶。測(cè)量透明水解圈與菌落直徑的比值，初步確定菌株的纖維素酶活性高低。

1.3.3 菌落形態(tài)及生理生化特征

具體方法參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》。

1.3.4 菌株的DNA提取及16S rRNA分析

將純化后培養(yǎng)的菌株，按照A.E.Z.N.A.TM DNA Kit Protocol（America，OMEGA）提取總DNA，作為后續(xù)16S rRNA序列擴(kuò)增反應(yīng)模板。PCR擴(kuò)增體系組成為：5 μL 10× PCRReactionBuffer，4 μLdNTP，0.5μLTaq聚合酶，37.5μL ddH2O，引物Eu27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1490R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）各1 μL（10 pmol/μL），1 μL總DNA模板。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min完成35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。參照pGEM-TEasyVector System I（Promega USA）說(shuō)明將PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，涂布于含腺苷-磷酸（adenosinemonophosphate，Amp）（100 μg/mL）、異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-l-thiogalactopyranoside，IPTG）（24μg/mL）和X-gal（40μg/mL）的LB平板上，篩選陽(yáng)性克隆子。按照Plasmid Mini Kit I（OMEGA USA）說(shuō)明提取重組質(zhì)粒并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI中的Blast分析比對(duì)后，再通過(guò)Clustal X 1.8軟件進(jìn)行全序列比對(duì)，利用MEGA 4.0軟件以NeighBor-Joining法進(jìn)行1 000次步長(zhǎng)計(jì)算構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[11]。

1.3.5 酶系活性測(cè)定[13]

接種2%菌液（～×107CFU/mL）于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)液經(jīng)8 000×g離心20 min，得到上清液，即為粗酶液。取適當(dāng)稀釋的粗酶液1 mL加入用緩沖液（pH 7）配置的反應(yīng)底物1 mL，混勻，置于50℃條件下保溫一定時(shí)間，加入2 mL的DNS反應(yīng)液終止反應(yīng)，并在沸水浴中反應(yīng)10 min，冷卻，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、稀釋倍數(shù)、反應(yīng)時(shí)間計(jì)算酶活大小。

酶活力定義：每毫升樣液每分鐘水解纖維素底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

圖1 纖維素降解菌平板篩選Fig.1 Screening plate for cellulose-decomposing strains

表1 篩選平板上12株細(xì)菌的菌落直徑和透明圈直徑Table 1 Colony diameter and transparent circle diameter of 12 strains on screening plate

黃水中的細(xì)菌經(jīng)CMC平板初步篩選，共獲得12株能水解纖維素的菌株，見(jiàn)圖1。比酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，從表1可看出，菌株M34、N2的比酶活最大。纖維素分解菌能分泌纖維素酶而將菌落周圍的纖維素降解成小分子的低聚糖及纖維二糖、葡萄糖等，而培養(yǎng)基中未被水解的纖維素和革蘭氏碘液可形成棕色復(fù)合物，故在纖維素培養(yǎng)基上，纖維素分解菌的菌落周圍能形成透明的水解圈，且水解圈的大小同酶活性的高低有一定的數(shù)量關(guān)系。因此，菌株M34、N2被選為后續(xù)試驗(yàn)菌株。

2.2 菌株的形態(tài)及生理生化特征

菌株M34及菌株N2的形態(tài)特征結(jié)果見(jiàn)圖2。菌株M34在篩選平板上表現(xiàn)出透明，乳白，不規(guī)則，邊緣不整齊的形態(tài)；菌株N2在篩選平板上菌落形態(tài)為：不透明，白色，圓形，扁平，邊緣不整齊，不黏稠。通過(guò)革蘭氏染色，油鏡觀察發(fā)現(xiàn)這兩株菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，形態(tài)為桿狀并具有芽孢。菌株生理生化特征分析見(jiàn)表2。

圖2 菌株M34（A）及N2（B）菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strains M34（A）and N2（B）

表2 菌株M34、N2部分生理生化特征Table 2 Partly biochemical and physiological characteristics of strains M34 and N2

由表2可知，菌株M34可以利用多種糖，兩種菌株多項(xiàng)生理生化反應(yīng)呈陰性，但在一定的NaCl濃度和pH范圍內(nèi)可以生長(zhǎng)。

2.3 菌株的16S rRNA分析

將測(cè)序得到的序列在NCBI上完成BLAST，用Clustal X軟件與GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，用MEGA 4.0軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3結(jié)果可知，菌株M34與Bacillus circulans的親緣關(guān)系最近，與標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus circulansATCC 4513相似度為99%；菌株N2與Bacillus endophyticus親緣關(guān)系最近，與Bacillus endophyticusMDSR34相似度為99%。BOSSHARD P P[14]認(rèn)為相似度大于99%的細(xì)菌判定為同種細(xì)菌，相似度介于95%～99%之間則判定為同屬，相似度在91%～95%之間判定為同科。因此，由16S rRNA分析結(jié)果，結(jié)合菌落形態(tài)特征及生理生化特性分析，鑒定M34和N2菌株分別為環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和內(nèi)生芽孢桿菌（Bacillus endophyticus）。

圖3 基于16S rRNA序列同源性的菌株N2及M34系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strains N2 and M34 based on homology of 16S rRNA sequences

2.4 菌株纖維素酶系活性測(cè)定

表3 酶活測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of enzyme activity

將纖維素降解為葡萄糖是纖維素酶系共同作用的結(jié)果，分別以羧甲基纖維素鈉（CMCNa）、D-水楊苷、濾紙、微晶纖維素為唯一作用底物，并測(cè)定菌株M34和N2的內(nèi)切型葡聚糖苷酶（CMC酶活）、外切型葡萄糖苷酶（微晶纖維素酶）、濾紙酶及β-葡萄糖苷酶的酶活。結(jié)果如表3所示，菌株M34產(chǎn)生的纖維素酶系對(duì)羧甲基纖維素鈉表現(xiàn)出最高的降解活性（0.061 U/mL），即菌株N2產(chǎn)生的纖維素酶系對(duì)D-水楊苷表現(xiàn)出最高的降解活性（0.158 U/mL），也就是說(shuō)，菌株M34產(chǎn)生的纖維素酶系中內(nèi)切型葡聚糖苷酶活性最高，菌株N2產(chǎn)生的纖維素酶系中的β-葡萄糖苷酶活性最高。本研究獲得的菌株M34、N2分離自一種低氧、強(qiáng)酸性、營(yíng)養(yǎng)匱乏的極端環(huán)境，它們產(chǎn)生的酶也可能在極端的環(huán)境下具有某些特殊性能。目前本研究只是對(duì)它們的產(chǎn)酶情況進(jìn)行初步的了解，下一步將進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件以期在提高其纖維素酶系活性的同時(shí)了解他們的最佳產(chǎn)酶條件，為進(jìn)一步探討其在白酒釀造過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及對(duì)纖維質(zhì)原料的利用情況，及其是否可應(yīng)用于窖池中黃水的再次發(fā)酵回用等問(wèn)題奠定理論基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

纖維素酶由于其廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域及良好的應(yīng)用前景一直受到人們的關(guān)注，篩選產(chǎn)生該酶的新菌株、高產(chǎn)菌株，誘變選育該酶的高產(chǎn)菌株，克隆產(chǎn)生該酶的基因，以及對(duì)該酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程方向的研究一直都在進(jìn)行[15]。黃水中的大部分物質(zhì)對(duì)提高白酒質(zhì)量，增加白酒香氣，改善白酒風(fēng)味有著重要的作用，目前許多對(duì)黃水的研究主要集中于黃水中化學(xué)成分分析，而對(duì)其中的微生物及其產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物的研究卻未見(jiàn)報(bào)道[19]。本研究從低氧、高酸度、營(yíng)養(yǎng)匱乏的黃水環(huán)境中分離的2株產(chǎn)纖維素酶菌株M34和N2進(jìn)行鑒定。經(jīng)形態(tài)觀察、理化分析及分子生物學(xué)特征鑒定菌株M34和N2分別為環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulaulns）和內(nèi)生芽孢桿菌（Bacillus endophyticus），而有關(guān)該兩株菌來(lái)源的纖維素酶還未見(jiàn)報(bào)道。酶活測(cè)定結(jié)果表明菌株N2的纖維素酶系活力均高于菌株M34，且其中β-葡萄糖苷酶的酶活最高，為0.158U/mL。本研究首次對(duì)黃水中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌進(jìn)行了報(bào)道，為黃水中微生物系統(tǒng)的研究提供一定的理論指導(dǎo)，為今后細(xì)菌纖維素酶的研究提供了新的種質(zhì)資源，也對(duì)拓展纖維素酶的種質(zhì)來(lái)源具有著積極的意義。

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Isolation and identification of two cellulase-producingBacillusspp.from the by-product of Huangshui(fermented mash)from Chinese liquor fermentation

YUAN Chunhong,SONG Feifei,LIN Kai,XIANG Wenliang,ZHANG Qing*
(College of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China)

12 bacteria with cellulase-producing capacity were isolated from the by-product ofHuangshui(fermented mash)from Chinese liquor fermentation by carboxymethyl cellulose(CMC)plate screening method.Two strains named M34 and N2 with high specific enzyme activity were chosen as the follow-up test object.According to their morphology features,biochemical and physiological characteristics and 16S rRNA sequence analysis, strain M34 was identified asBacillus circulansand strain N2 was identified asBacillus endophyticus.Both strains cellulase activities were detected byDNSmethod and the resultsshowed thatthe enzyme activityofstrain N2 washigher than M34.Among the enzyme activityof strain N2,the CMCase activity was 0.132 U/ml,the avicellulase activity was 0.012 U/ml,the FPase activity was 0.041 U/ml and theβ-glucosidase activity was 0.158 U/ml.

Huangshui(fermented mash);cellulase;screening;identification;enzyme activity

Q93-33、Q815

A

0254-5071（2014）11-0090-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.020

2014-09-19

西華大學(xué)“西華杯”大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（No：2014135）

袁春紅（1989-），女，碩士研究生，研究方向食品生物技術(shù)。

*通訊作者：張慶（1979-），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛夹g(shù)。