測定稻谷中α-淀粉酶活性的兩種方法的比較

雷凡，王月慧

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

測定稻谷中α-淀粉酶活性的兩種方法的比較

雷凡，王月慧*

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

采用碘比色法和降落數(shù)值法分別測定稻谷中α-淀粉酶活性，對測定結(jié)果進行了比較分析。實驗結(jié)果表明：兩種方法都可以測定α-淀粉酶活性，兩者的測定結(jié)果差異顯著，但兩者測定結(jié)果呈顯著直線相關(guān)性，說明降落數(shù)值的高低能間接的反映α-淀粉酶活性的大??；從變異系數(shù)來看，后者的變異程度較低，其精密度較高，前者引起的誤差因素較后者多；后者較前者簡便快速，重復(fù)性好等優(yōu)點。通過分析研究比較，降落數(shù)值法是分析測定大量樣品α-淀粉酶活性的最佳方法。

比色法；降落數(shù)值；α-淀粉酶活性；測定方法；比較

稻谷是我國主要糧食作物之一，其年產(chǎn)量2億t左右，約占世界稻谷總產(chǎn)量的36%，是我國流通量和消費量最多的糧種，也是我國最主要的儲備糧，約占糧食總儲備量的50%以上。其產(chǎn)量和品質(zhì)直接與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們生活水平息息相關(guān)。稻谷在運輸過程中必定要經(jīng)過一定時間的儲藏，稻谷在儲藏過程中由于受儲藏條件的影響不可避免地要發(fā)生緩慢的新陳代謝，這將導(dǎo)致稻谷發(fā)生陳化，造成大米品質(zhì)變劣[1-4]。由于食用大米在儲藏過程中發(fā)生的生物化學(xué)反應(yīng)主要是在各種酶的作用下進行的，稻米中酶活性減弱或喪失就會導(dǎo)致大米的陳化[5-6]。淀粉是稻谷中最主要的成分，在儲藏過程中，作用稻谷淀粉的酶主要有α-淀粉酶。α-淀粉酶又稱“糊精化酶”，它以隨機的方式從淀粉分子內(nèi)部水解α-1,4糖苷鍵。稻谷在儲藏過程中，α-淀粉酶活性隨著儲藏時間的延長而變化，進而對稻谷的食用品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響[7]，周顯青等[8]研究表明，稻谷的新陳度與α-淀粉酶的活性大小有顯著相關(guān)性，稻谷的α-淀粉酶活性與其非還原糖含量、發(fā)芽率、黏度、脂肪酸值等均呈現(xiàn)出指數(shù)關(guān)系，α-淀粉酶活性的變化都會影響稻谷其各項指標的變化，因此，在稻谷儲藏過程中測定其新陳度的變化時也把α-淀粉酶作為其一個重要參考指標[9-10]。目前，關(guān)于α-淀粉酶活性的測定方法有很多種，其方法的原理也各不相同，但其方法大多都是以小麥為原料測定α-淀粉酶的活性，很少有針對稻谷α-淀粉酶活性的測定，因此本文選用常規(guī)儲藏一年的粳稻谷作為原料，選用比較常用的兩種方法測定α-淀粉酶活性（直接方法碘比色法和間接方法降落數(shù)值法），比較了方法的精密度，準確度以及相關(guān)性等指標，旨在為稻谷以及其他作物的α-淀粉酶活性測定提供最佳測定方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經(jīng)過儲藏一年的優(yōu)質(zhì)粳稻谷：河南省黃國糧業(yè)股份有限公司（稻谷水分按照GB 5497—1985《糧食、油料檢驗水分測定法》測定為11.07%）。

α-淀粉酶：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；碘化鉀、碘、硫酸、可溶性淀粉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯化鈣：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；無水乙酸鈉：上海山浦化工有限公司；冰乙酸：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UnIC7200-分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SPX-250B-Z型恒溫生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-S-恒溫水浴鍋：上海維誠儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；MP-200A電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；GZX-GF101-1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；FN-IV降落數(shù)值測定儀：杭州大成光電科技有限公司；LM-74小型電動礱米機：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；JXFM110-全自動錘式旋風(fēng)磨：上海嘉定糧油儀器有限公司。

1.3 實驗方法

樣品的制備：稱取100 g稻谷樣品，經(jīng)礱谷成糙米、然后磨粉，粒度要求為90%以上能通過100目篩。

稻谷水分含量按照GB/T 5497—1985《糧食、油料檢驗水分測定法》[11]測定。

稻谷α-淀粉酶活性按照GB/T 5521—2008《糧油檢驗谷物及其制品中α-淀粉酶活性的測定比色法》[12]。

α-淀粉酶活性計算公式：

式中：A為α-淀粉酶活性，U/g；m為100 mL氯化鈣提取的試樣質(zhì)量，g；h為試樣中水分含量（以質(zhì)量分數(shù)計），%；f為酶提取液的稀釋倍數(shù)；t1、t2分別為不同的反應(yīng)時間，min；D1、D2分別為時間t1、t2時的吸光度值；b為lgD對t曲線的斜率的絕對值；500為系數(shù)。

稻谷降落數(shù)值參照GB/T 10361—2008《小麥、黑麥及其面粉，杜倫麥及其粗粒粉降落數(shù)值的測定》[13]。從黏度管放入水浴至攪拌器上止動器下降到達膠木塞上部為止所需的全部時間（s），即為降落數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種測定方法結(jié)果的相關(guān)性分析

分別用碘比色法和降落數(shù)值法對樣品中的α-淀粉酶進行5次平行測定，并記錄測定結(jié)果見表1。

對兩組數(shù)據(jù)進行t檢驗分析，測定結(jié)果為：t=8.409 9，t0.05=2.132，|t|＞t0.05說明兩種方法測定結(jié)果具有顯著性差異，碘比色法測定的結(jié)果可以直接反映出稻谷中α-淀粉酶活性的大小，而降落數(shù)值儀測定的結(jié)果是其稻谷的降落數(shù)值，能間接地反映出α-淀粉酶活性的大小。

對兩組數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，即碘比色法測得樣品α-淀粉酶活性（Y）與對應(yīng)降落數(shù)值儀測得α-淀粉酶活（X）進行直線回歸，得Y=6.856 6-0.013 8X，r=0.950 6。

表1 比色法和降落數(shù)值法結(jié)果Table 1 Results of iodine colorimetry and the values of falling numerical method

分析結(jié)果表明，碘比色法測定的結(jié)果與降落數(shù)值儀測定的結(jié)果具有顯著的直線相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.950 6。說明降落數(shù)值的高低能間接的反映稻谷中α-淀粉酶活性的大小，這與前人研究的α-淀粉酶活性與降落數(shù)值成極顯著負相關(guān)的研究結(jié)果是一致的[14-17]。

2.2 兩種測定方法精密度比較

分別用對碘比色法和降落數(shù)值法的精密度進行比較，兩種方法測得的α-淀粉酶活性的平均值、標準差、變異系數(shù)見表2。

表2 兩種測定方法變異系數(shù)分析結(jié)果比較Table 2 Variation coefficients of two methods

由表2可知，雖然降落數(shù)值法比碘比色法的標準差大；但由于兩者的測定結(jié)果的單位定義不同，就無法用標準差直接比較，而在算出變異系數(shù)后，就能看出碘比色法比降落數(shù)值法變異程度較大，因此說明降落數(shù)值法的精密度較高。

這是由于碘比色法中其所需要的操作步驟比較多，有一定的人為誤差，且實驗過程中的溫度、時間以及吸光度值的測定等均容易產(chǎn)生誤差；而在降落數(shù)值法中操作步驟較少，僅在糊化溫度上可能會引起誤差，其誤差來源較少，所以其方法比較可靠，也適合對大量樣品進行α-淀粉酶活性的快速測定。

2.3兩種測定方法的回收率比較

為檢驗兩種方法的準確度，稱取5個平行已知濃度的樣品，分別加入標準的α-淀粉酶，用兩種方法測定其回收率，結(jié)果見表3。

表3 兩種方法回收率比較Table 3 Recovery rates of two methods

從表3中可以看出，兩種方法的回收率比較接近，說明這兩種方法對測得α-淀粉酶活性都有一定的準確性。

2.4 兩種方法的內(nèi)容比較

兩種測定方法優(yōu)點和缺點的比較見表4。

表4 兩種測定方法優(yōu)缺點比較Table 4 Advantages and disadvantages of two mehtods

從表4中可以看出，碘比色法適宜于精確測得樣品中α-淀粉酶活性大小，但步驟比較繁瑣，費時、費力，不宜分析大量樣品，由于在用碘比色法測定樣品α-淀粉酶活性時候時間和溫度對其酶活有比較大的影響，所以在操作過程中要嚴格把控時間和溫度；降落數(shù)值法快速、簡便，是分析大量樣品中α-淀粉酶活性的最佳方法；但由于不同地區(qū)所處的海拔高度不同，不同大氣壓下水的沸點不同，而由于水浴溫度不同對降落數(shù)值的測定結(jié)果有較大影響，溫度愈低，降落數(shù)值測定結(jié)果愈高。

3 結(jié)論

碘比色法可直接測定稻谷中α-淀粉酶活性的大小，它的操作過程要求比較嚴格，需要保證準確的反應(yīng)時間和溫度，測定結(jié)果才可靠，適宜于精確測定少量樣品中α-淀粉酶的活性大小。小麥粉或其他谷物粉的懸浮液在沸水浴中能迅速糊化，并因其中α-淀粉酶活性的不同而使糊化物中的淀粉不同程度的被液化，液化程度不同，攪拌器在糊化物中的下降速度即不同，因此，降落數(shù)值的高低就表明了相應(yīng)的α-淀粉酶活性的差異，降落數(shù)值愈高表明α-淀粉酶的活性愈低，反之表明α-淀粉酶活性愈高。實驗表明：碘比色法與降落數(shù)值法測定α-淀粉酶活性的結(jié)果具有顯著直線性相關(guān)性，說明降落數(shù)值的高低能間接的反映出稻谷中α-淀粉酶活性的大小。因此在鑒定稻谷新陳度時，可測定稻谷的降落數(shù)值來預(yù)測α-淀粉酶活性，能夠更快速簡便而準確的反映出稻谷新陳度的情況。

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Comparison on two methods for determination of α-amylase activity in rice

LEI Fan,WANG Yuehui*
(College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

Iodine colorimetry and falling numerical method were used to determine theα-amylase activity in rice,and then the results were compared and analyzed.Both methods can be used to measureα-amylase activity,and had the significant differences.The two determination results showed significant linear correlation,it turned out that the value of falling number can indirectly reflect the activity of theα-amylase.At the point of variation coefficient,the iodine colorimetry had more error components;the falling numerical method had lower variation degree and a higher precision.And then the falling numerical method was more simple and quicker and it had a good repeatability.After analyzing comparison results,it concluded that the falling numerical method was a better way to determine theα-amylase activity for large number of samples.

colorimetry;falling number;α-amylase activity;determination method;comparison

TS210.7

A

0254-5071（2014）11-0152-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.035

2014-10-15

國家糧食局公益項目（201413007）

雷凡（1987-），男，碩士研究生，研究方向為糧食加工與儲藏。

*通訊作者：王月慧（1971-），女，副教授，碩士，研究方向為谷物科學(xué)。