• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬瘟病毒C株雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建及單克隆抗體的制備與鑒定

    2014-02-23 11:46:30,,,,
    中國動(dòng)物檢疫 2014年8期
    關(guān)鍵詞:雜交瘤單克隆效價(jià)

    ,,, ,

    (1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?744000;2.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730046)

    豬瘟病毒C株雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建及單克隆抗體的制備與鑒定

    楊明1,陳伯祥1,郭慧琳2,李杰1,豆林濤1

    (1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?744000;2.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730046)

    采用豬瘟病毒C株毒(CSFV C strain)免疫BALB/C小鼠,按照常規(guī)單克隆抗體制作方法構(gòu)建并篩選出能穩(wěn)定分泌抗豬瘟單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株4株,分別命名為1C9,1B11,3C8和3G9,經(jīng)鑒定,4株單克隆抗體腹水效價(jià)達(dá)到104~106。交叉試驗(yàn)及特異性試驗(yàn)表明,所制備的McAb與鴿新城疫病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、雞減蛋綜合征病毒無交叉反應(yīng)性,均完全針對豬瘟病毒(CSFV)抗原決定簇,具有高度特異性??笴SFV McAb的成功制備,為進(jìn)一步研究建立CSFV的快速診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

    豬瘟C株;雜交瘤細(xì)胞;單克隆抗體;鑒定

    豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的一種急性或慢性、熱性和高度接觸性傳染病,呈世界性分布,是豬的最重要傳染病之一。豬感染了CSFV后不但發(fā)病造成較高的死亡率,而且還具有不斷排毒的危險(xiǎn)性。鑒于其危害程度高,對養(yǎng)豬業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失巨大,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將本病列入法定報(bào)告?zhèn)魅静1-3]。自50年代以來,隨著豬瘟兔化弱毒中國株等疫苗的推廣應(yīng)用,我國豬瘟疫情得到了有效的控制。然而近年來國內(nèi)外仍有豬瘟散發(fā)性流行的報(bào)道,其原因除了豬瘟病毒在野外長期馴化發(fā)生了變異外,還在于不能及時(shí)確診而不能及早清除傳染源。要消滅豬瘟就需要建立一種快速準(zhǔn)確的診斷技術(shù)。單克隆抗體是具有高度特異性和靈敏性的免疫學(xué)診斷試劑,制備抗CSFV 單克隆抗體對豬瘟的臨床診斷、病原學(xué)研究及其在宿主細(xì)胞中的增殖和定位都有重要意義[4-6]。本研究通過細(xì)胞融合技術(shù)制備了抗CSFV 單克隆抗體,為豬瘟快速診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 豬瘟兔化弱毒株為豬瘟兔淋脾毒,由本所課題組保存;PK-15細(xì)胞,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所饋贈(zèng);SP2/0細(xì)胞,購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;BALB/C小鼠,購自衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所小動(dòng)物室,18~20g,6~8周齡,雌性;家兔,購自衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所小動(dòng)物室,體重約1.5Kg;鴿新城疫病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒PL株和SH株及EDS-76病毒均由本所課題組保存。

    1.1.2 試劑 DMEM、RPMI-1640(GIBCO);改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone);新生牛血清、胎牛血清(杭州四季青);弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(Sigma);L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、Hepes、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷、 氨基喋呤、8-氮鳥嘌呤、牛血清白蛋白、羊抗小鼠IgGHRP、Tween-20(Solarbio);PEG1500(Merck);30%H2O2(上海生工);Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche);四蒸水(本實(shí)驗(yàn)室自制)。

    1.1.3 主要器材 CO2培養(yǎng)箱(上海一恒);DNM9602A型酶標(biāo)分析儀(北京普朗);倒置生物顯微鏡(廣西);-86℃超低溫冰箱(上海楓田);臺式高速冷凍離心機(jī)(HEAL FORCE);核酸蛋白檢測儀四件套(上海天呈);SP-752型紫外可見分光光度計(jì)(上海);96孔、24孔細(xì)胞板(coaster)等耗材,均由Solarbio公司提供。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫抗原制備

    1.2.1.1 豬瘟兔化弱毒病毒液的制備 選擇成年健康家兔4只,耳靜脈注射處理好的豬瘟弱毒,1mL /只。另設(shè)對照4只,每隔12h測量家兔體溫,當(dāng)體溫連續(xù)三次超過正常值1℃或1℃以上的家兔立即撲殺,無菌取其脾臟和腸系膜淋巴結(jié),置無菌研缽研磨,加適量滅菌生理鹽水,離心后取上清,制成豬瘟兔化弱毒病毒液備用。

    1.2.1.2 病毒的濃縮和提純 取培養(yǎng)24h、生長良好的80%單層PK-15細(xì)胞,吸出舊培養(yǎng)液,取CSFV弱毒株,用DMEM不完全培養(yǎng)基稀釋,接種于細(xì)胞,加入量剛好蓋過瓶底為止,塞好膠塞,感作1h,吸出病毒感染液,同時(shí)換上PK-15維持液,塞緊膠塞,置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。接種病毒60 h后的細(xì)胞反復(fù)凍融3次,收集毒液。在收集的病毒液中緩慢加入PEG6000和NaCl,搖勻,使最終濃度PEG6000為7.5%,NaCl為0.3M,1mol/L NaOH調(diào)pH值至7.5,置4℃過夜。第二天10000r/min離心30min,棄去上清液,將沉淀懸浮于pH7.5的TNE緩沖液((0.05M Tris HCl,1M EDTA,0.1M NaCl) 中,約相當(dāng)于原液的2%,置4℃冰箱過夜,其間攪拌幾次。第二天4℃10000r/ min離心30min,去除沉淀,吸取上清液備用進(jìn)行Sephadex G-200凝膠過濾。

    1.2.1.3 Sephadex G-200凝膠純化 將Sephadex G-200凝膠煮沸,漂洗,活化后裝柱,平衡。取上一步濃縮物加至平衡好的Sephadex G-200柱子內(nèi)進(jìn)行純化,用BSZ-100電子鐘控自動(dòng)部份收集器收集樣品,用SP-752紫外可見分光光度計(jì)測量洗脫物的分布。用ELISA鑒定純化后的豬瘟弱毒,測定蛋白含量后備用。

    1.2.2 動(dòng)物免疫 選6-8周齡雌性BALB/C小鼠,用上述提純的豬瘟弱毒抗原,免疫3次,每次間隔兩周,第一次抗原加等量的弗氏完全佐劑,經(jīng)乳化分點(diǎn)注射于小鼠背部皮下,共注射0.2mL;第二次加等量的弗氏不完全佐劑,方法同前;第三次不加佐劑腿部肌肉注射,10d后尾部采血測血清效價(jià),達(dá)到要求時(shí)于融合前3d加強(qiáng)免疫用不含佐劑的等量抗原腹腔注射,3d后融合。

    1.2.3 檢測豬瘟抗體間接ELISA方法的確定 將制備的病毒包被抗原稀釋成150μg/mL,用包被液稀釋抗原從1:5稀釋到1:20,100μL /孔包被酶標(biāo)板;將陽性和陰性血清用血清稀釋液由1:200稀釋到1:1000;用酶標(biāo)抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋成由1:2400 稀釋到1:8000,采用間接ELISA方法進(jìn)行方陣實(shí)驗(yàn)。用酶標(biāo)分析儀測定OD490值,記錄結(jié)果。以P/N≥2.0的抗原、陽性、酶標(biāo)二抗的最大稀釋度作為抗原、陽性血清和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度。

    1.2.4 雜交瘤細(xì)胞株的建立 將免疫好的小鼠眼球采血后,無菌取出脾臟,除去脂肪及結(jié)締組織,將脾臟剪成小段,用滅菌注射器內(nèi)芯碾壓脾臟使淋巴細(xì)胞釋放出來,吸出細(xì)胞懸液。1000r/min離心10min,脾細(xì)胞重懸于RPMI-1640不完全培養(yǎng)基中,計(jì)數(shù),備用。將骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合前24h換液培養(yǎng),融合當(dāng)天,取生長良好細(xì)胞的用不完全RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕吹下,收集,1000r/ min離心10min,重懸于不完全RPMI-1640培養(yǎng)基中,計(jì)數(shù),備用。將SP2/0細(xì)胞及脾細(xì)胞兩種細(xì)胞按l:10(1×107:1×108)的比例混合于離心管,用50%的PEG1500作為融合劑進(jìn)行細(xì)胞融合,加入含1 %HAT的RPMI-1640完全培養(yǎng)基,小心吹散混勻細(xì)胞,在準(zhǔn)備好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上每孔加入0.1mL融合細(xì)胞懸液置37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后應(yīng)每日觀察細(xì)胞的生長情況。骨髓瘤細(xì)胞多在融合后2~3d內(nèi)明顯退化,細(xì)胞縮小、核濃縮、破碎。巨噬細(xì)胞增生、肥大,并開始吞噬細(xì)胞碎片。第6天可見隆狀雜交廇細(xì)胞生長。此時(shí)觀察判斷每孔的細(xì)胞克隆情況,并作好記錄。一般融合后6~7d,每孔移去HAT培養(yǎng)液0.1mL,補(bǔ)加等量的HT培養(yǎng)液。待融合后的細(xì)胞生長到覆蓋細(xì)胞孔底部1/4~1/3時(shí),細(xì)胞生長良好時(shí),可用已建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測上清液中的抗體,檢測為陽性的細(xì)胞孔采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng),陰性孔3d后再檢測一次,如仍為陰性則棄之。對陽性孔采用有限稀釋法進(jìn)行克隆,進(jìn)行3次克隆和亞克隆,直到所有的孔都為陽性。最后選擇OD490值高、細(xì)胞活力好的細(xì)胞孔,轉(zhuǎn)入24孔板,繼而轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),及時(shí)凍存。

    1.2.5 單克隆抗體腹水的生產(chǎn) 取10周齡BALB/C小鼠,腹腔注射0.5mL滅菌液體石蠟油進(jìn)行預(yù)處理。1周后,將生長良好雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞輕吹下,1000r/min離心10min后棄上清,細(xì)胞重懸于不完全1640培養(yǎng)基中,計(jì)數(shù)并調(diào)細(xì)胞數(shù)至1.5×106個(gè)/mL。每只小鼠腹腔注射0.5mL。待小鼠腹部膨大,用注射器采集腹水,將腹水3000 r/ min離心20min,收集上清,分裝后-80℃保存。

    1.2.6 單克隆抗體效價(jià)測定 用豬瘟弱毒抗原包被酶標(biāo)板,測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水的效價(jià),同時(shí)以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清和SP2/0誘生的陰性腹水做陰性作為對照。以P/N≥2.0的抗體最大稀釋度作為效價(jià)終值。

    1.2.7 單克隆抗體亞類及染色體數(shù)測定 采用Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit進(jìn)行單克隆抗體亞型鑒定。染色體計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)[7]介紹的方法進(jìn)行。秋水仙素阻抑雜交瘤細(xì)胞分裂中期,加入KCl低滲處理,固定液固定,制片,染色鏡檢。

    1.2.8 單克隆抗體特異性試驗(yàn) 用間接ELISA方法測定單克隆抗體分別與鴿新城疫病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)。

    1.2.9 雜交瘤細(xì)胞凍存和復(fù)蘇及穩(wěn)定性檢驗(yàn) 雜交瘤細(xì)胞的凍存:選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,輕輕將細(xì)胞從瓶壁上吹下,1000 r/min離心10min,棄上清,用凍存液將細(xì)胞沉淀懸浮,分裝于細(xì)胞凍存管中,1mL/管,加蓋封嚴(yán),注明細(xì)胞名稱,凍存日期。將凍存管置4℃冰箱1h,-20℃1h,轉(zhuǎn)入-80℃冰箱過夜,次日移入液氮中。

    雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇:從液氮中取出凍存管,迅速放入37℃水中,輕輕晃動(dòng)使其盡快融化。1000 r/min離心10 min,棄上清。用含20%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液將沉淀懸浮,加入細(xì)胞瓶,置37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)8代,并檢測培養(yǎng)上清液中的抗體效價(jià),檢查細(xì)胞株分泌抗體的穩(wěn)定性。

    2 結(jié)果

    2.1 豬瘟兔化弱毒病毒液的制備

    豬瘟弱毒接種家兔后,家兔體溫陸續(xù)升高,家兔體溫變化情況見圖1。對體溫連續(xù)三次超過正常值1℃或1℃以上的家兔立即進(jìn)行撲殺,取其淋巴結(jié)及脾臟,研磨加適當(dāng)生理鹽水離心后取上清制成病毒液。

    圖1 家兔體溫曲線

    從圖1可見,1、2、3、4號兔在注射弱毒后,第三天體溫開始超過正常體溫,第四天可以捕殺采集病毒。

    2.2 蛋白含量

    純化收集樣品稀釋后用SP-752紫外可見分光光度計(jì)測量OD2600.088和OD2800.072,50倍稀釋。按公式(1.45×OD280~0.74×OD260)×稀釋倍數(shù),計(jì)算得濃縮抗原的蛋白含量為1.964mg/mL。

    2.3 間接ELISA法檢測單克隆重抗體中血清和酶最佳工作濃度的確定

    根據(jù)矩陣法,將制備純化的豬瘟病毒先用包被抗原稀釋成150μg/mL,再用包被液稀釋抗原確定純化豬瘟病毒抗原最佳工作濃度為1:10,即最佳包被條件時(shí)病毒的蛋白含量為15μg/mL;陰陽性血清最佳工作濃度為1:600;最佳酶標(biāo)二抗工作濃度為1:6400。

    2.4 免疫小鼠血清效價(jià)

    用分離提純的豬瘟弱毒與弗氏佐劑等量乳化制備免疫抗原,小鼠通過背部皮下分點(diǎn)注射進(jìn)行免疫,第三次不加佐劑后腿肌肉注射免疫,三次免疫后10d尾靜脈采血分離血清,稀釋后進(jìn)行間接ELISA檢測血清效價(jià),結(jié)果見表1。

    表1 小鼠免疫血清效價(jià)測定結(jié)果

    2.5 細(xì)胞融合與克隆

    將免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞用PEG 1500方法進(jìn)行細(xì)胞融合,經(jīng)不斷改進(jìn)技術(shù),最后細(xì)胞融合率達(dá)到了90%以上,陽性率為10%。將10株陽性單克隆細(xì)胞株用有限稀釋法進(jìn)行3次克隆,經(jīng)檢測和篩選最終獲得能夠穩(wěn)定分泌抗CSFV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞4株,隨著克隆代數(shù)的增加,細(xì)胞培養(yǎng)上清CSFV抗體OD490值逐步升高,到第3次克隆時(shí)最終達(dá)到穩(wěn)定。

    2.6 單克隆抗體腹水的制備及抗體效價(jià)

    滅菌液體石蠟油處理BALB/C小鼠,1周后分別接種4株陽性雜交瘤細(xì)胞,待小鼠腹部膨大,用注射器無菌抽取腹水。將腹水3000 r/min離心20 min,收集上清,進(jìn)行效價(jià)測定,結(jié)果見表2。由表2可知,雜交瘤細(xì)胞的腹水抗體效價(jià)為104-106以上,細(xì)胞培養(yǎng)液的效價(jià)為1:1600-1:6400。

    表2 不同雜交瘤細(xì)胞株在腹水和細(xì)胞培養(yǎng)液效價(jià)的測定結(jié)果

    2.7 單克隆抗體亞類及染色體數(shù)測定

    篩選出的4株單克隆細(xì)胞株經(jīng)Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit試劑盒檢測后,3G9亞類為IgG1,1C9、1B11和3C8的抗體亞類均為lgG2b,4株單抗的輕鏈為κ鏈。經(jīng)染色體計(jì)數(shù),4株雜交瘤細(xì)胞株的平均染色體數(shù)為92~103條,符合雜交瘤細(xì)胞株的規(guī)律87~110條,與理論值相符。

    2.8 單克隆抗體特異性試驗(yàn)

    用間接ELISA檢測單克隆抗體與其它病毒的交叉反應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)它只與豬瘟病毒呈陽性反應(yīng),而與鴿新城疫病毒、豬呼吸繁殖綜合癥病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒都不發(fā)生交叉反應(yīng),說明這4株單克隆抗體都是針對豬瘟病毒的特異性單克隆抗體。

    2.9 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性檢驗(yàn)

    對4株克隆后雜交瘤細(xì)胞在凍存前后各連續(xù)培養(yǎng)8代,并用間接ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中的抗體效價(jià),結(jié)果傳代過程中和復(fù)蘇前后抗體效價(jià)沒有明顯變化,這說明各株雜交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體的能力穩(wěn)定。

    3 討論

    單克隆抗體是用預(yù)先免疫小鼠的脾細(xì)胞與能在體外無限生長的骨髓瘤細(xì)胞融合,形成具有雙親特征的雜交瘤細(xì)胞,通過克隆化得到來自單個(gè)細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞系,它們分泌的是針對同一抗原決定簇、分子具有高度同質(zhì)性和特異性的抗體。單克隆抗體技術(shù)是1975年法國的Kohler和英國的Milstein用細(xì)胞融合技術(shù)獲得了第一株能分泌抗羊紅細(xì)胞單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。此后,單克隆抗體的研制與應(yīng)用已成為醫(yī)學(xué)、動(dòng)物學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)學(xué)和食品衛(wèi)生等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[7]。

    豬瘟病毒只有一個(gè)血清型,常規(guī)血清學(xué)方法很難將其從不同地區(qū)不同時(shí)間分離的毒株區(qū)分開來。近年的研究表明,不同地區(qū)分離的CSFV毒株的抗原性差異不大,但病毒的遺傳特性上有差異。用單克隆抗體與不同毒株間的反應(yīng)性的差別來分析CSFV不同毒株之間微小的抗原差異,是目前研究較多的一種較好的方法[8-10]。

    1985年Wenvoort G C首次應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)的豬瘟病毒免疫小鼠建立和制備13株抗豬瘟病毒的McAb以來[11],McAb不僅在豬瘟診斷方面得到廣泛應(yīng)用,而且越來越多的抗豬瘟病毒的McAb被制備并應(yīng)用于豬瘟病毒的分子生物學(xué)研究。

    豬瘟病毒為單股正鏈RNA病毒,其基因組編碼一個(gè)多聚蛋白,經(jīng)宿主細(xì)胞的病毒蛋白酶后產(chǎn)生4種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白,豬瘟病毒自然感染后,可產(chǎn)生針對E2、Erns和NS3蛋白的抗體,目前,國內(nèi)外能夠穩(wěn)定分泌針對這三種蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞均有構(gòu)建成功的報(bào)道[12-16],國內(nèi)外的學(xué)者也借助豬瘟單克隆抗體建立了一系列針對豬瘟的抗原和抗體診斷方法[17-20]。

    用CSFV的McAb可用于引起豬瘟爆發(fā)流行的CSFV毒株進(jìn)行流行病學(xué)跟蹤研究。由于McAb具有一定的分“型”能力,只能檢出病毒的表型差異,而不能檢測到病毒的變異;而且,用于病毒分型的大部分McAb可能只對少數(shù)具有高免疫原性的位點(diǎn)呈現(xiàn)反應(yīng)性,可能僅作用于該病毒的一小部分區(qū)域,故難以應(yīng)用McAb全面和深入地闡明CSFV及其相關(guān)病毒的內(nèi)在結(jié)構(gòu)、組成和相互關(guān)系。目前PCR技術(shù)與核酸測序技術(shù)相結(jié)合被廣泛用于豬瘟病毒的分子流行病學(xué)研究。

    本試驗(yàn)以豬瘟弱毒免疫兔子,取其脾臟、淋巴結(jié)制備種毒,在PK15細(xì)胞是增殖,PEG6000濃縮病毒,經(jīng)Sephadex G-200純化后免疫BALB/C小鼠,經(jīng)過多次細(xì)胞融合和亞克隆篩選,最終篩選出4株高效分泌抗CSFV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。4株雜交瘤細(xì)胞的腹水抗體效價(jià)為達(dá)104-106以上,細(xì)胞培養(yǎng)液的效價(jià)為達(dá)1:1600-1:6400。單克隆抗體特異性鑒定和雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性測定等試驗(yàn)表明,所制備的單克隆抗體與其他抗原無交叉反應(yīng)性,具有較高的特異性和敏感性;所制備的雜交瘤細(xì)胞無論是連續(xù)傳代培養(yǎng)還是凍存后復(fù)蘇傳代均能穩(wěn)定分泌特異性抗體。該單克隆抗體的成功制備,為下一步相關(guān)ELISA檢測方法的建立、免疫層析快速診斷試紙的制備及基于單抗技術(shù)的豬瘟強(qiáng)弱毒的鑒別診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

    [1] 殷 震,劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M],第2 版.北京:科學(xué)出版社,1997,652-653.

    [2] 吳增堅(jiān),楊 奎.非典型豬瘟[J].畜牧與獸醫(yī),2000,32(2):35-36.

    [3] 韓雪清,劉湘濤,趙啟祖,等.豬瘟病毒遺傳發(fā)生關(guān)系分析[J].中國獸醫(yī)科技,1999(6):3-7.

    [4] 謝慶閣,翟中和.畜禽重大疾病研究進(jìn)展[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,1996,35-45.

    [5] 王 鎮(zhèn),丁明孝.豬瘟病毒致病機(jī)制及防治的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)雜志,1993,19(5):6-8.

    [6] 杜念興.豬瘟的回顧與展望[J].中國畜禽傳染病,1998,20(5):317-319.

    [7] 徐志凱.實(shí)用單克隆抗體[M].西安:陜西科學(xué)出版社,1992,27-89.

    [8] 羅廷榮.豬瘟病毒生物學(xué)特性研究的一些新進(jìn)展[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2001,20(1):55-57.

    [9] 王承浩,周作紅,王亞鳴,等.抗豬瘟病毒單克隆抗體的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1989,11(1):36-43.

    [10] 楊艷艷,張改平,肖治軍,等.分泌抗豬瘟病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2006,21(5):60-63.

    [11] Wensvoort G C. Topographical and functional mapping of epitopes on hog cholera virus with monoclonal antibodies[J].J Gen Virol,1989,70:2865-2876.[12] Weiland E,Stark R,Haas B,et al. Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer[J]. J Virol,1990,64(8):3563-3569.

    [13] 侯 強(qiáng),彭武平,孫 元,等.豬瘟病毒E2蛋白主要抗原區(qū)編碼基因的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2008,38(1):1-5.

    [14] Kosmidou A,Ahl R,Thiel H J,et al. Diffferentiation of classical swine fever virus(CSFV)strains using monoclonal antibodies against structural glycoproteins[J].Vet Microbial,1995,47(12):111-118.

    [15] 魯 絮,張嚴(yán)明,鄭增忍,等. 抗豬瘟病毒NS3(p80)蛋白單克隆抗體的制備及其特性鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,30(6):464-468.

    [16] 常天明,孫 元,李宏宇,等. 豬瘟病毒NS3蛋白的重組表達(dá)及其單克隆抗體的制備[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2010,40(2):144-149.

    [17] Narita M,Kimura K,Tanimura N,et al. Immunohistochemical detection of hog cholera virus antigen in paraffin wax-embedded tissues from naturally infected pig[J]. J Comp Pathol,1999,121(3):283-286.

    [18] 張長弓,黃印堯,鄭海明,等. 豬瘟病毒抗原膠體金快速檢測試紙的研究[J];福建畜牧獸醫(yī),2007,29(6):1-3.

    [19] 陸芹章,羅廷榮,溫和心,等. 豬瘟單克隆抗體的制備及ACI-ELISA檢測豬瘟病毒的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,26(5):283-286.

    [20] 梁冰冰,孫 元,彭伍平,等. 豬瘟病毒中和抗體競爭抑制ELISA 檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2008,38(11):957-961.

    Preparation and Identifcation of Monoclonal Antibodies against Classical Swine Fever Virus C Strain

    Yang Ming1,Chen Boxiang1,Guo Huilin2,Li Jie1,Dou Lintao1
    (1. Gansu Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Pingliang,Gansu 744000;2. Gansu Province Animal Disease Prevention and Control Center,Lanzhou,Gansu 730046)

    Four monoclonal antibodies designated as 1C9,1B11,3C8 and 3G9 against classical swine fever virus C strain(CSFV C strain) were generated by immunization of BALB/C mice with purifed CSFV C strain. The titers of ascetic fuids of the four McAbs were up to 104~106in indirect ELISA. The McAbs were only positive against CSFV,and negative against Newcastle disease virus of pigeon,porcine reproductive and respiratory syndrome virus,transmissible gastroenteritis virus and egg drop syndrome virus. The preparation of the McAbs provided a basis to establish rapid diagnostic method of CSFV.

    CSFV C strain;hybridoma;monoclonal antibody;identifcation

    S852.651

    A

    1005-944X(2014)08-0065-06

    甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目(GNSW-2005-15)

    陳伯祥

    猜你喜歡
    雜交瘤單克隆效價(jià)
    情緒效價(jià)的記憶增強(qiáng)效應(yīng):存儲(chǔ)或提取優(yōu)勢?
    單克隆抗體在新型冠狀病毒和其他人冠狀病毒中的研究進(jìn)展
    應(yīng)用HyD在仔豬斷奶早期可提高維生素D的效價(jià)
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    伏馬菌素B1單克隆抗體的制備及免疫學(xué)檢測方法初步應(yīng)用
    TSH受體單克隆抗體研究進(jìn)展
    雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)及其注意事項(xiàng)
    單克隆抗體制備的關(guān)鍵因素
    如何提高抗生素效價(jià)管碟測定法的準(zhǔn)確性
    生物效價(jià)法測定大黃炮制品活血化瘀功效
    中成藥(2014年9期)2014-02-28 22:28:58
    99久久中文字幕三级久久日本| 18禁在线播放成人免费| 免费日韩欧美在线观看| 伊人久久国产一区二区| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产 一区精品| √禁漫天堂资源中文www| videossex国产| 青春草国产在线视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 黄色配什么色好看| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| av黄色大香蕉| 99国产综合亚洲精品| 日本午夜av视频| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲五月色婷婷综合| 新久久久久国产一级毛片| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 一区二区三区精品91| 国产一区二区在线观看日韩| 搡女人真爽免费视频火全软件| 9色porny在线观看| 久久精品国产自在天天线| 国产精品成人在线| www.色视频.com| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 91精品三级在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 在现免费观看毛片| 伊人久久国产一区二区| 中文字幕免费在线视频6| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲av成人精品一区久久| 99re6热这里在线精品视频| 大话2 男鬼变身卡| 新久久久久国产一级毛片| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产精品熟女久久久久浪| av一本久久久久| 黄片播放在线免费| 日韩亚洲欧美综合| 十八禁高潮呻吟视频| 18+在线观看网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 少妇被粗大猛烈的视频| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩欧美精品免费久久| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 自线自在国产av| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲精品一二三| 精品国产国语对白av| 久久久久久人妻| 少妇人妻精品综合一区二区| 另类精品久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产日韩欧美亚洲二区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| av视频免费观看在线观看| 亚洲久久久国产精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美人与善性xxx| 国产熟女午夜一区二区三区 | 成人手机av| 22中文网久久字幕| av播播在线观看一区| 精品久久久久久电影网| 高清av免费在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 美女内射精品一级片tv| 久久人人爽人人片av| 免费黄色在线免费观看| 性色av一级| 国产高清三级在线| a级片在线免费高清观看视频| 久久久国产精品麻豆| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 人体艺术视频欧美日本| 大码成人一级视频| 简卡轻食公司| 亚洲,欧美,日韩| freevideosex欧美| 国产免费视频播放在线视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美三级亚洲精品| 伦理电影免费视频| 另类精品久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 在线观看三级黄色| 亚洲人与动物交配视频| 另类亚洲欧美激情| 国产精品国产三级专区第一集| 一级二级三级毛片免费看| 少妇 在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 边亲边吃奶的免费视频| 男女边吃奶边做爰视频| 久久精品夜色国产| 国产在线视频一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| av卡一久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 男人操女人黄网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲av欧美aⅴ国产| 成人影院久久| 亚洲人成网站在线播| 岛国毛片在线播放| 久久久久视频综合| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产精品国产三级国产专区5o| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久久久久久久久久久大奶| 精品少妇久久久久久888优播| 国产日韩欧美视频二区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 高清毛片免费看| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 特大巨黑吊av在线直播| 性色avwww在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 五月开心婷婷网| 亚洲av国产av综合av卡| 国产成人精品婷婷| 精品久久久精品久久久| 久热久热在线精品观看| 久久久久网色| 欧美成人精品欧美一级黄| 热99久久久久精品小说推荐| 国产免费一级a男人的天堂| 国产成人精品婷婷| 国产精品嫩草影院av在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品99久久久久久久久| av.在线天堂| 成人国产av品久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 在线看a的网站| 日本vs欧美在线观看视频| 国产综合精华液| 女性被躁到高潮视频| 韩国高清视频一区二区三区| tube8黄色片| 伦理电影大哥的女人| 亚洲精品自拍成人| 日韩中文字幕视频在线看片| 中国国产av一级| 天堂8中文在线网| 美女内射精品一级片tv| 热re99久久精品国产66热6| 午夜福利视频在线观看免费| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 免费高清在线观看视频在线观看| 大码成人一级视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久网色| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 免费看光身美女| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲精品乱久久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲国产精品一区三区| 亚洲av在线观看美女高潮| 人妻夜夜爽99麻豆av| 搡老乐熟女国产| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 免费少妇av软件| 日本与韩国留学比较| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日本欧美视频一区| 五月伊人婷婷丁香| 久久精品夜色国产| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久久精品94久久精品| videos熟女内射| 国产精品 国内视频| 国产视频首页在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲av中文av极速乱| 人人澡人人妻人| 国产在线一区二区三区精| 欧美精品一区二区大全| 免费观看性生交大片5| 午夜影院在线不卡| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 51国产日韩欧美| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 天美传媒精品一区二区| 黄色欧美视频在线观看| 一区二区av电影网| 婷婷色av中文字幕| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日日爽夜夜爽网站| av视频免费观看在线观看| 最黄视频免费看| 一级毛片我不卡| 国产又色又爽无遮挡免| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美日韩综合久久久久久| 一边亲一边摸免费视频| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产av国产精品国产| 亚洲第一av免费看| 久久精品国产自在天天线| 下体分泌物呈黄色| 国产精品久久久久久久电影| 91精品伊人久久大香线蕉| av专区在线播放| 日韩中字成人| 一级黄片播放器| 少妇高潮的动态图| 中国国产av一级| 丝袜喷水一区| 又大又黄又爽视频免费| 欧美精品亚洲一区二区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 色婷婷av一区二区三区视频| 飞空精品影院首页| 男女啪啪激烈高潮av片| 一本久久精品| 黄色配什么色好看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 日韩制服骚丝袜av| 另类精品久久| av在线观看视频网站免费| 热99国产精品久久久久久7| 国产毛片在线视频| 一区二区三区精品91| 中国三级夫妇交换| 中文天堂在线官网| 七月丁香在线播放| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美丝袜亚洲另类| 精品酒店卫生间| 婷婷色综合大香蕉| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 午夜福利视频在线观看免费| av.在线天堂| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 三级国产精品欧美在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 美女国产高潮福利片在线看| 99久久精品一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲精品久久午夜乱码| 中文字幕免费在线视频6| 国产有黄有色有爽视频| 久久精品久久久久久久性| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 亚州av有码| 国模一区二区三区四区视频| 午夜福利视频在线观看免费| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲内射少妇av| 秋霞在线观看毛片| 黄色一级大片看看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩伦理黄色片| 18禁在线播放成人免费| 99热6这里只有精品| 热99久久久久精品小说推荐| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产在视频线精品| 亚洲国产精品国产精品| 伦精品一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 亚洲美女视频黄频| 少妇丰满av| 一级二级三级毛片免费看| 51国产日韩欧美| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久久久人妻精品一区果冻| 人妻 亚洲 视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产爽快片一区二区三区| 欧美日韩在线观看h| 日韩 亚洲 欧美在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 99久久综合免费| 国产欧美亚洲国产| xxxhd国产人妻xxx| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 男女高潮啪啪啪动态图| 热99久久久久精品小说推荐| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 99久久人妻综合| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 99久久精品国产国产毛片| 色网站视频免费| 91精品国产国语对白视频| 欧美+日韩+精品| √禁漫天堂资源中文www| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 最近手机中文字幕大全| 免费观看av网站的网址| 在现免费观看毛片| 中文天堂在线官网| 亚洲人与动物交配视频| 2022亚洲国产成人精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产熟女午夜一区二区三区 | 七月丁香在线播放| 少妇精品久久久久久久| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产高清三级在线| 一级片'在线观看视频| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| av黄色大香蕉| 各种免费的搞黄视频| 精品亚洲成国产av| 亚洲精品乱久久久久久| 精品一区二区三卡| 一级毛片电影观看| 久久亚洲国产成人精品v| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久亚洲国产成人精品v| 久久午夜综合久久蜜桃| 在线精品无人区一区二区三| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 精品午夜福利在线看| 高清在线视频一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲国产欧美在线一区| 国产成人精品一,二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 91成人精品电影| 中国三级夫妇交换| 精品视频人人做人人爽| 欧美另类一区| 午夜福利,免费看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产成人freesex在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久久久久久久成人| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 女人久久www免费人成看片| 91在线精品国自产拍蜜月| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产av国产精品国产| 五月开心婷婷网| av卡一久久| 色网站视频免费| 一区二区三区乱码不卡18| 国产有黄有色有爽视频| 美女国产高潮福利片在线看| 国产黄色免费在线视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一区二区三区精品91| 啦啦啦啦在线视频资源| 又大又黄又爽视频免费| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲内射少妇av| 午夜视频国产福利| 国产视频首页在线观看| 免费看光身美女| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲国产日韩一区二区| 99九九在线精品视频| 一区二区三区精品91| 亚洲av综合色区一区| 一区在线观看完整版| 三上悠亚av全集在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 亚洲高清免费不卡视频| 高清视频免费观看一区二区| 一边亲一边摸免费视频| 国产片内射在线| 国产精品久久久久久久久免| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合| 中文字幕制服av| 美女主播在线视频| 久久99热6这里只有精品| av网站免费在线观看视频| 免费日韩欧美在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久久久久久久成人| 一级毛片电影观看| 少妇的逼水好多| 日本wwww免费看| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲熟女精品中文字幕| 女性被躁到高潮视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产一区二区在线观看日韩| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人毛片60女人毛片免费| 99久久综合免费| 91精品三级在线观看| 伦理电影免费视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品一二三区在线看| 日本午夜av视频| 国产精品久久久久成人av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产亚洲最大av| 久久久国产欧美日韩av| 一区二区av电影网| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 老司机亚洲免费影院| 欧美日韩综合久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 不卡视频在线观看欧美| 色哟哟·www| 久久av网站| 国产成人a∨麻豆精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 九色亚洲精品在线播放| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产熟女欧美一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 高清毛片免费看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品人妻久久久久久| 精品少妇久久久久久888优播| 99re6热这里在线精品视频| 久久99精品国语久久久| 晚上一个人看的免费电影| 日本wwww免费看| 国产免费又黄又爽又色| 在线观看国产h片| 一个人看视频在线观看www免费| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲av日韩在线播放| 久久人人爽人人片av| 精品国产乱码久久久久久小说| 涩涩av久久男人的天堂| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美+日韩+精品| av国产久精品久网站免费入址| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美精品亚洲一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 天天影视国产精品| 在线观看国产h片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩亚洲欧美综合| 日本av免费视频播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产视频首页在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品一区www在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 91成人精品电影| 国产亚洲最大av| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一本一本综合久久| 国产精品偷伦视频观看了| 乱人伦中国视频| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲国产日韩一区二区| 五月天丁香电影| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 人妻人人澡人人爽人人| freevideosex欧美| 99久久人妻综合| 国国产精品蜜臀av免费| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲av成人精品一区久久| 18禁在线播放成人免费| 人体艺术视频欧美日本| 国产日韩欧美视频二区| 美女国产视频在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 丝袜美足系列| 午夜日本视频在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一级片'在线观看视频| 国产在线视频一区二区| 热99国产精品久久久久久7| 91aial.com中文字幕在线观看| 日本91视频免费播放| 成人漫画全彩无遮挡| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲怡红院男人天堂| 午夜视频国产福利| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| freevideosex欧美| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲情色 制服丝袜| 免费av不卡在线播放| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产国语露脸激情在线看| 日韩电影二区| 在线观看免费高清a一片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 内地一区二区视频在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久女婷五月综合色啪小说| 最近的中文字幕免费完整| 日本wwww免费看| 人妻 亚洲 视频| av卡一久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久ye,这里只有精品| 国产高清不卡午夜福利| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品一区二区免费观看| 尾随美女入室| 日韩欧美精品免费久久| 黄片无遮挡物在线观看| av在线老鸭窝| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品熟女少妇av免费看| 三级国产精品片| 日韩大片免费观看网站| 不卡视频在线观看欧美| 色婷婷久久久亚洲欧美| 少妇丰满av| 99久久精品一区二区三区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲情色 制服丝袜| 最近中文字幕2019免费版| 另类精品久久| 各种免费的搞黄视频| 国产毛片在线视频| 女性被躁到高潮视频| 国产极品粉嫩免费观看在线 | av免费在线看不卡| 国产成人一区二区在线| 最后的刺客免费高清国语| freevideosex欧美| 国产一区有黄有色的免费视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 99热这里只有精品一区| av天堂久久9| 日本-黄色视频高清免费观看| 18禁动态无遮挡网站| 精品久久国产蜜桃| 99精国产麻豆久久婷婷| 999精品在线视频| 国产成人精品婷婷| 女性生殖器流出的白浆| 三级国产精品片| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 午夜激情福利司机影院| 亚洲伊人久久精品综合| 在线精品无人区一区二区三| 美女国产高潮福利片在线看| 国产一区二区在线观看av| 欧美+日韩+精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久久久久久久大av| 一个人看视频在线观看www免费| 水蜜桃什么品种好| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美日本中文国产一区发布| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 黄色配什么色好看| 人妻系列 视频|